Genetic Characterization of the Caspiy virus (CASV) (Bunyaviridae, Nairovirus) isolated from the Laridae (Vigors, 1825) and Sternidae (Bonaparte, 1838) birds and the Argasidae (Koch, 1844) ticks Ornithodoros capensis Neumann, 1901, in Western and Eastern soasts of the Caspian sea

Full Text

Прототипный штамм LEIV-63Az (депонент Государственной коллекции вирусов РФ № ГКВ-721; авторы Львов Д.К., Громашевский В.Л., Сидорова Г.А., Скворцова Т.М.) изолирован в 1970 г. из крови больной сего-летней серебристой чайки (Larus argentatus Pontoppidan, 1763), добытой на острове Глиняный Бакинского архипелага у западного побережья Каспийского моря (40°17' с.ш., 49°55' в.д.) в Азербайджане [1-4]. На основании данных электронной микроскопии и отрицательных результатов изучения антигенных связей с известными буньявирусами CASV был отнесен к неклассифицированным вирусам сем. Bunyaviridae [2-5]. В этот же период в этом же биоценозе были изолированы три штамма CASV из клещей Ornithodoros capensis Neumann, 1901 (Argasidae Koch, 1844) (обследовано 1479 особей). Два штамма CASV были выделены в 1974 г. из клещей O. capensis (обследовано 2019 особей), собранных в гнездовой колонии речных крачек (Sterna hirundo Linnaeus, 1758) на островах в заливе Кара-Богаз-Гол на восточном побережье Каспийского моря (41°02' с.ш., 52°53' в.д.) в Туркмении. Таким образом, всего изолировано пять штаммов CASV при уровне вирусофорности клещей O. capensis порядка 0,21% в Азербайджане и 0,1% в Туркмении [6, 7]. В настоящей работе мы впервые секвенировали геном прототипного штамма CASV/LEIV-63Az с использованием метода полногеномного секвенирования. В результате проведенного молекулярно-генетического и филогенетического анализа показано, что CASV является новым представителем рода Nairovirus сем. Bunyaviridae. Материалы и методы Прототипный штамм CASV/LEIV-63Az был получен из Государственной коллекции вирусов РФ ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интра-церебральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4-е сутки) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных, одобренными комиссией Института по этике экспериментов с животными. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 10 мг) помещали в 350 мкл лизирующего буфера RLT (QIAGEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе Tys-sueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделили набором “RNeasy mini kit” (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориметра Qubit (Invitro-gen, США). Подготовка библиотек и секвенирование. Для депле-ции рибосомальной РНК использовали набор GenRead rRNA depletion Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для получения кДНК 50 нг деплециро-ванной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (“Thermo Scientific”, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (“Promega”, США). Инкубировали при 25°С в течение 10 мин, далее при 42°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С в течение 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора “NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module” (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с помощью набора “MinElute PCR Purification Kit” (QiAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор “TruSeq DNA Sample Prep Kits v2” (“Illumina”, США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза “QIAxcel Advanced System” (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени 2-кратно SsoFast EvaGreen Supermix (“Bio-Rad”, США), прибор Bio-Rad CFX1000), согласно рекомендациям, изложенным в руководстве “Sequencing Library qPCR Quantification Guide” (“Illumina”, США). Секвенирование ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq (“Illumina”, США) с использованием набора “MiSeq Reagent Kits v2 (300PE)” по схеме, описанной ранее [8, 9]. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов проводили с использованием программы “CLC Genomics Workbench 5.5” (“CLC bio”, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей осуществляли с помощью сервиса BLASTX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ “Lasergene Core Suite” (DNAstar, США). Последовательности выравнивали по алгоритму ClustalW [10]. Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили с применением программы MEGA5 по методу ближайшего соседа с 1000-кратным бутстреп-тестированием [11]. Поиск сайтов гликози-лирования, сайтов нарезания сигнального пептида и трансмембранных доменов проводили с помощью on line ресурсов NetNGlyc 1.0, SignalP и TMHMM 2.0 соответственно (сайт CBS Prediction Servers http://www. cb.sdtu.dk/services). 25 Обсуждение При анализе данных полногеномного секвенирования CASV (с использованием сервиса BLASTX) определили три протяженные последовательности, обладающие гомологией с вирусами рода Nairovirus (Bunyaviridae). Всего обнаружили три последовательности длиной 1594, 4520 и 11 880 н.о., соответствующие трем геномным сегментам наировирусов - S, M и L соответственно. После анализа транслирующих областей установили, что мы определили практически полную последовательность генома CASV, состоящего из трех сегментов РНК негативной полярности, каждый из которых имеет одну протяженную открытую рамку считывания (ОРС). При дальнейшем анализе определили, что размер и структура генома CASV является характерной для вирусов рода Nairovirus [12]. S-сегмент CASV длиной около 1594 н.о. имеет одну ОРС длиной 497 аминокислотных остатков (а.о.), которая кодирует белок нуклеокапсида (N). В ОРС S-сегмента CASV в позиции 7 расположен дополнительный старт-кодон, который не встречается у других наировирусов. Размер белка N CASV соответствует размеру у других наировирусов (в среднем 480-500 а.о., за исключением размера белка N у вируса Эрве (ERVEV - Erve virus), у которого она составляет 630 а.о.) [13]. Идентичность аминокислотной последовательности белка N CASV с другими наировирусами достигает 28% (табл. 1). В белке N CASV обнаружили мотив 277DEVD который является сайтом расщепления для каспазы-3. Этот мотив консервативен для штаммов вируса Крымской-Конго гемморагической лихорадки (ККГЛ) и не встречается у других наировирусов с известной последовательностью данного белка. Расщепление белка N ККГЛ каспазой-3 является необходимым для репликации ККГЛ. Нужно отметить, что каспазные сайты расщепления в нуклео-капсидном белке также нужны для репликации “человеческих” вирусов гриппа А [14, 15]. М-сегмент CASV, как и у других наировирусов, имеет одну протяженную ОРС, кодирующую полипротеин-предшественник оболочечных белков Gn и Gc. М-сегмент CASV кодирует полипротеин длиной 1376 а.о. Согласно результатам анализа полипротеина в программе SignalP server 4.1, первые 32 а.о. являются сигнальным пептидом и отщепляются по сайту SSA/SY. Предполагаемый сайт нарезания полипротеина сигнальной пептидазой, что приводит к образованию белков preGn и preGc, определен в позиции 699 (VSG/IK). Эти данные подтверждаются расположением трансмембранных доменов в зрелых белках Gn и Gc, что определено с исполь- Таблица 1 Уровень (в %) идентичности полноразмерных последовательностей белков CASV с вирусами рода Nairovirus Вирус RdRp (L-сегмент) G^Gn (М-сегмент) N (S-сегмент) ККГЛ(CCHFV -Crimean-Congo hemorrhagic fever virus) 41,0 27,3 28,4 Болезни овец Найроби (NSDV - Nairobi sheep disease virus) 41,7 25,2 28,4 Дугбе (DUGV - Dugbe virus) 41,7 25,4 28,1 Ерве (ERVEV - Erve virus) 38,8 25,9 26,9 Иссык-Куль (ISKV - 43,0 27,3 28,7 зованием программы TMHMM server 2.0. В дальнейший процессинг белков Gn и Gc наировирусов, возможно, вовлечены протеазы эндоплазматического ретикулума, в частности протеаза SKI-1. Сайт расщепления в preGn для SKI-1 365RKLL у CASV имеет такую же структуру, как у вируса ККГЛ [16]. Шесть потенциальных сайтов N-гликозилирования обнаружили в белке Gn CASV и только один в белке Gc. В целом уровень идентичности полипротеина CASV составляет 25-27% с другими наи-ровирусами (см. табл. 1). L-сегмент CASV имеет одну протяженную ОРС длиной 4001 а.о. L-сегмент буньявирусов кодирует фермент РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), который является наиболее консервативным вирусным белком. Уровень идентичности полной последовательности RdRp CASV с наировирусами составляет 38,8-43% (см. табл. 1). Филогенетический анализ провели методом присоединения соседей на основе сравнения полноразмерных аминокислотных последовательностей белков бунья-вирусов. На рис. 1, а-в, видно, что CASV практически равноудален от других наировирусов и является, таким образом, новым представителем рода Nairovirus. В настоящее время полные последовательности генома определены только для наировирусов, входящих в серогруппы ККГЛ (вирусы ККГЛ и Хазара), Дугбе (вирусы Дугбе, болезни овец Найроби, Купе) и Тиафора (Тиафора и Эрве). Также мы ранее секвенировали геном нового наировируса Иссык-Куль, который пока не включен ни в одну серогруппу. Для остальных наировирусов, объединенных в серогруппы Кальюб (Кальюб и Бандиа), Хьюз (Хьюз, Фараллон и Раза), Дера-Гхази-Хан (Дера-Гхази-Хан, Абу-Минас и Абу-Хаммад) и Сахалин (Сахалин и Тилламук) доступны только короткие (118 а.о.) последовательности каталитического центра RdRp [17]. Данный участок, помимо каталитического домена RdRp Таблица 2 Уровень (в %) гомологии каталитического центра RdRp (118 а.о.) CASV с наировирусами различных серогрупп Issyk-Kul virus) 26 Серогруппа Вирус Идентичность, % ККГЛ ККГЛ (CCHFV - Crimean-Congo hemorrhagic fever virus) 59,088 Тиафора (TFAV -Thiafora virus) Ерве (ERVEV - Erve virus) 53,437 Дугбе Дугбе (DUGV - Dugbe virus) 59,088 Дера-Гхази-Хан (DGKV - Dera Ghazi Khan virus) Абухаммад (ABUHV - Abu hammad virus) 66,499 Абумина (ABUMV - Abu mina virus) 69,514 Сахалин (SAKV -Sakhalin virus) Тилламук (TILLV -Tillamook virus) 74,346 Кальюб (QYBV -Qalyub virus) Бандиа (BDAV - Bandia virus) 63,390 Кальюб (QYBV - Qalyub virus) 61,262 Хьюз (HUGV - Hughes virus) Фараллон (FARV - Farallon virus) 80,741 Пунта-Салинас (PSV -Punta Salinas virus) 78,955 Раза (RAZAV - Raza virus) 81,622 Иссык-Куль (ISKV -Issyk-Kul virus) Иссык-Куль (ISKV - Issyk-Kul virus) 55,736 Рис. 1. Дендрограммы, построенные на основе сравнения полноразмерных аминокислотных последовательностей белков буньявирусов животных: RdRp (а); структурных белков оболочки Ge/Gn (б); белка нуклеокапсида N (в). у наировирусов, включает последовательность, гомологичную семейству домена опухоли яичника (OUT - от англ. ovarian tumor domain). Данный домен наировиру-сов обладает способностью деубиквитировать белки, что приводит к подавлению зависимых от убиквитина (Ub) сигнальных путей в инфицированной клетке. По этому механизму, вероятно, происходит подавление наи-ровирусами системы врожденного иммунитета, основанного на продукции интерферонов 1-го типа (ИФН-а и ИФН-Р) и фактора некроза опухоли (ТНФа) на ранней стадии инфекции. Данный домен у наировирусов до статочно консервативен [18, 19]. В данном регионе максимальным (80%) уровнем идентичности белков CASV обладает с вирусами серогруппы Хьюз (табл. 2). Также CASV близок к вирусам группы Сахалин (74%). На рис. 2, построенном на основе сравнения данного участка, видно, что разделение ветвей в целом соответствует разделению наировирусов на серогруппы, которое провели на основе перекрестных серологических реакций. CASV формирует отдельную ветвь, близкую к вирусам группы Hughes и Sakhalin (см. рис. 2). Следует отметить, что вирусы серогруппы Хьюз изолировали на террито- 27 Рис. 2. Дендрограмма, построенная на основе сравнения консервативного участка (118 а.о.) каталитического центра RdRp наировирусов. Справа указаны антигенные группы. рии Северной и Южной Америки от клещей Ornithodor-os (Carios) spp. (так же, как и CASV), которые связаны с морскими птицами [20, 21]. Таким образом, генетическая близость CASV к вирусам группы Хьюз отражает их общие экологические особенности и позволяет сделать вывод об их общем происхождении. В период изоляции штаммов на островах Бакинского архипелага в 1970 г. среди серебристых чаек наблюдалась эпизоотия и CASV был изолирован от больной се-голетней особи. Для чаек характерны кормовые миграции, в том числе от западного к восточному побережью Каспийского моря. При этом вполне реален обмен вирусами, связанными с чайками и их облигатными паразитами - аргасовыми клещами. Клещи O. capensis населяют побережья и острова от юга умеренного пояса до экватора бассейнов Атлантического, Индийского и Тихого океанов, а также некоторых крупных внутренних водоемов [22, 23]. Облигатные паразиты морских птиц - аргасовые клещи группы O. capensis (O. amblus Chamberlin, 1920; O. capensis Neumann, 1901; O. denmarki Kohls, Sonenshine, Clifford, 1965; O. maritimus Vermeil, Marguet, 1967; O. muesebecki Hoogstraal, 1969; O. sawaii Kitaoka, Suzuki, 1973) - замещают на юге умеренного пояса, в субтропиках, тропиках, субэкваториальном и экваториальном поясах иксодовых клещей Ixodes (Ceratixodes) uriae White, 1852, распространенных на севере умеренного пояса, субарктике-субантарктике [22-24]. Клещи паразитируют на многих видах птиц, преимущественно на ржанкообразных (Charadriiformes Huxley, 1867) - чайковых (Laridae Vigors, 1825) и крачковых (Sternidae Bonaparte, 1838), а также на пеликанообразных (Pelecaniformes Sharpe, 1891) - бакланах (Phalacrocoracidae Reichenbach, 1850) и пеликанах (Pelecanidae Rafinesque, 1815) [23, 24]. Цикл метаморфоза этих аргазид, включающий стадии яйца, личинки, 3-5 стадий нимфы, имаго, занимает, по данным лабораторного изучения, от 43 до 83 сут, т.е. может быть завершен на протяжении одного гнездового сезона птиц. Приведенные особенности экологии аргасовых клещей группы O. capensis обеспечивают стабильность природных очагов адаптированных к этим клещам вирусов и возможность их трансконтинентального переноса [4]. К наировирусам относятся такие важные патогены людей и животных, как возбудители ККГЛ, Иссык-Кульской лихорадки и болезни овец Найроби. Наировирусы, особенно связанные с птицами и летучими мышами, обладают высоким потенциалом в плане возникновения новых и вновь возвращающихся природно-очаговых инфекций. В настоящей работе охарактеризован геном CASV - нового вида в составе рода Nairovirus (Bunyaviridae). Полученные данные позволяют расширить количество известных наи-ровирусов до 9 (включая описанный ранее вирус Иссык-Куль) и дополнить сведения об их генетическом разнообразии. Зондирование территории Закавказья и Средней Азии проводили в рамках Программы по биобезопасности и изучению биоразнообразия в различных экосистемах Северной Евразии [4, 5, 25, 26].

References

Supplementary files