Taxonomy of previously unclassified Tamdy virus (TAMV) (Bunyaviridae, Nairovirus) isolated from the Hyalomma asiaticum asiaticum SchOlce et Schlottke, 1929 (Ixodidae, Hyalomminae) in the Middle East and Transcaucasia

Full Text

Прототипный штамм вируса Тамды (TAMV - Tamdy virus) LEIV-1308 был впервые изолирован из иксодовых клещей Hyalomma asiaticum asiaticum Schtil- Для корреспонденции: Львов Дмитрий Константинович, акад. РАН, dk_lvov@mail.ru. ce et Schlottke, 1929 (Ixodidae, Hyalomminae), собранных в августе 1971 г. с овец в пустынном ландшафте в окрестностях г. Тамдыбулак (41°36' с.ш., 64°39' в.д.) 15 Тамдинского района Бухарской области Узбекистана. По данным электронной микроскопии, TAMV был отнесен к негруппированным вирусам сем. Bunyaviridae [1-4]. Свыше 50 штаммов TAMV были изолированы в 1971-1983 гг. на территории Узбекистана [5-9], Туркмении [9-13], Киргизии [14, 15], Казахстана [16-18], Армении [19, 20], Азербайджана [11, 21-23]. В 57% случаев TAMV изолировали от Hyalomma asiaticum asiaticum Schtilce et Schlottke, 1929; 6% - от Hyalomma asiaticum caucasium Pomerantsev, 1940; 8% - от Hyalomma ana-tolicum Koch, 1844; 6% - от Hyalomma marginatum Koch, 1844; 6% - Rhipicephalus turanicus Pomerantsev, 1936; 2% - от Haemophysalis concinna Koch, 1844; 12% - от диких птиц наземного и кустарникового комплекса; 4% - от диких млекопитающих (включая летучих мышей); 2% - от лихорадящих людей (табл. 1). Заражение человека TAMV приводит к развитию заболевания, получившего название «лихорадка Там- Таблица 1 Изоляция штаммов TAMV в Средней Азии и Закавказье Место изоляции Источник изоляции Время сбора мате Количество регион страна область биотоп риала штаммов Средняя Азия Узбеки стан Бухарская область, Тамдинский район Песчаная пустыня H. as. asiaticum с овец и верблюдов Август 1971 г. Апрель 1972 г. 3 6 Апрель 1973 г. Май 1974 г. Май 1983 г. Туркме- Окрестности Каракумского ния канала (пос. Сакар-Чага, пос. Захмет, озеро Сарыкамыш) пос. Кызыл-Арват (предгорья Копетдага) Песчаная H. as. asiaticum с верблюда пустыня H. marginatum с овец H. as. asiaticum с верблюда H. as. asiaticum с верблюда Предгорная H. as. asiaticum с овец пустыня Всего ... Январь-май 1973 г. Июнь 1973 г. Июнь 1973 г. Июль 1981 г. Апрель 1984 г. Кирги- Чуйская долина (Ошская об-зия ласть) Всего . Полупустыня Больной человек Май 1973 г. Летучая мышь sp. Май 1973 г. Белая трясогузка (Motacilla Май 1973 г. alba Linnaeus, 1758) Сизоворонка (Coracias Май 1973 г. garrulus Linnaeus, 1758) Удод (Upupa epops Linnaeus, Май 1973 г. 1758) Обыкновенный скворец Май 1973 г. (Sturnus vulgaris Linnaeus, 1758) Пустынный сороко- Май 1973 г. пут (Lanius meridionalis Temminck, 1820) Степной хорь (Mustela Май 1973 г. eversmanni Lesson, 1827) Rh. turanicus Май 1973 г. Haem. concinna Май 1973 г. Казах стан Сузакский район Казалинский район Аральский район Кзыл-Ординский район Полупустыня H. as. asiaticum с овец H. as. asiaticum с коров H. as. asiaticum с верблюда H. as. asiaticum с верблюда Всего . Апрель 1979 г. Апрель 1979 г. Апрель 1979 г. Май 1979 г. 13 Закавка зье Армения Аштаракский район Каменистая H. as. caucasium с овец пустыня Всего . Май 1976 г. Всего . 1 Азер- Кусарский район Полупустыня H. as. asiaticum с овец Апрель 1985 г. 1 байджан Апшеронский район H. marginatum с овец Май 1985 г. 2 H. as. caucasium с овец Май 1985 г. 2 H. anatolicum с овец Май 1985 г. 4 H. as. asiaticum с овец Май 1986 г. 1 Всего 10 2 16 ды»: резкое начало, быстрый подъем температуры тела до 39-40°С (100%), сильная головная боль (94%), головокружение (50%), гиперемия зева (48%), кашель (25%), миалгия, тошнота (31%), сыпь (14%), фотофобия (11%). Острая фаза длится до 8 сут; период реконвалесценции 1-1,5 мес. Зарегистрированы случаи лабораторного заражения с благоприятным исходом [24]. В настоящей работе для установления таксономического положения TAMV секвенированы геномы трех штаммов: TAMV/LEIV-1308Uz (см. выше), TAMV/ LEIV-6158Ar (изолирован из H. asiaticum с овец в окрестностях с. Зевашен Арташатского района Армении) и TAMV / LEIV-10226Az (изолирован из H. asiaticum с овец в окрестностях п. Хангулу Апшеронско-го района Азербайджана). На основе филогенетического и молекулярно-генетического анализа показано, что TAMV является новым прототипным вирусом рода Nairovirus (сем. Bunyaviridae). Материалы и методы Вирусные штаммы. Работы с инфекционным материалом, связанные с получением и накоплением вируса, проводили в боксовых помещениях, оборудованных и сертифицированных для работы с микроорганизмами 2-й группы патогенности. Использованные в работе вирусы LEIV-1308Uz, LEIV-6158Ar и LEIV-10226Az получены из Государственной коллекции вирусов РФ при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизованной мозговой суспензии. Для накопления вируса лиофилизованную суспензию восстановили в 1 мл культуральной среды ДМЕМ (с добавлением антибиотика) и использовали для интрацеребрального заражения новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-3 сут) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 1 мл реагента TRIzol (Life Technology, США) и гомогенизировали пластиковым пестиком. Далее выделяли РНК согласно прилагаемой инструкции производителя данного реагента. Конечный осадок суммарной РНК растворяли в 100 мкл DEPC обработанной воды. Для дополнительной очистки, а также для удаления низкомолекулярных фракций рибосомаль-ной (5 S) и транспортной РНК полученный препарат очищали набором «RNeasy mini kit» (QIAGEN, Германия) в режиме clean-up на автоматической станции QIAcube (QIA-GEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли, используя флюориметр Qubit (Invitrogen, США). Для удаления рибосомальной (18 и 28 S) РНК использовали набор «GenRead rRNA depletion Kit» (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для этого брали не более 3 мкг суммарной РНК. Эффективность деплеции достигала 50-80%, и, таким образом, количество полученной РНК Рис. 1. Дендрограммы, построенные на основе филогенетического анализа полных аминокислотных последовательностей вирусных белков буньявирусов животных. а - РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp); б - полипротеин - предшественник оболочечных белков GnGc; в - нуклеопротеин (N). 17 Рис. 2. Дендрограмма, построенная методом максимального правдоподобия (Maximum likelihood), для каталитического центра RdRp наировирусов. Справа указаны названия серогрупп. для дальнейшего анализа составило около 300 нг. Подготовка ДНК-библиотек и секвенирование. Для получения кДНК около 100 нг деплецированной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с помощью набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали, используя набор «MinElute PCR Purification Kit» (QIA-GEN, Германия), на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Illu-mina, США) в соответствии с инструкцией. Для селекции ДНК по размеру применяли реагент «Ampure XP» (Beckman Coulter, США) с расчетом получения ДНК-библиотек длиной более 270 н. о., что соответствует размеру вставки около 150 н. о. Данные требования к размеру ДНК-библиотек связаны с использованием для секвенирования набора, позволяющего секвенировать не более 150 н. о. в одну сторону. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIAGEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом полимеразно-цепной реакции в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Секвенирование ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq (Illumina, США), используя набор «MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)», в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов проводили с помощью программы «CLC Genomics Workbench 6.0» (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей осуществляли, используя сервис BLASTX (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov). Для анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» (DNAstar, США). Последовательности выравнивали по алгоритму ClustalW. Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили с использованием программы MEGA5 по методу ближнего соседа или максимального правдоподобия (Maximum likelihood) с 100-кратным бутстреп-тестированием. Результаты и обсуждение Ранее TAMV на основании морфологии вириона был отнесен к сем. Bunyaviridae [1-3]. Классификация бу-ньявирусов основана на перекрестных антигенных связях в реакциях связывания комплемента, торможения гемагглютинации или биологической нейтрализации. Поскольку TAMV, как и другие негруппированные бу-ньявирусы, не имеют антигенных связей с известными вирусами, наиболее релевантным методом их классифи 18 Таблица 2 Генетическая дистанция (p-distance), рассчитанная на основе полной последовательности трех сегментов генома наировирусов L-сегмент (RdRp) хзируи 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tamdy LEIV-1308Uz 1 0,014 0,058 0,540 0,532 0,543 0,534 0,535 0,532 Tamdy LEIV-10228Az 2 0,006 0,061 0,539 0,533 0,543 0,534 0,536 0,533 Tamdy LEIV-6158Ar 3 0,027 0,030 0,540 0,533 0,545 0,537 0,533 0,533 Crimean-Congo hemorrhagic fever virus 4 0,619 0,620 0,622 0,388 0,474 0,396 0,511 0,510 Hazara virus 5 0,617 0,616 0,618 0,373 0,479 0,376 0,506 0,514 Erve virus 6 0,639 0,638 0,639 0,528 0,523 0,463 0,515 0,511 Dugbe virus 7 0,623 0,623 0,625 0,386 0,350 0,526 0,499 0,501 Issyk-Kul virus 8 0,624 0,627 0,626 0,590 0,573 0,604 0,579 0,489 Caspy virus 9 0,623 0,623 0,622 0,591 0,581 0,611 0,588 0,576 M-сегмент (GnGc) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tamdy LEIV-1308Uz 1 0,073 0,125 0,602 0,615 0,633 0,612 0,609 0,609 Tamdy LEIV-10226Az 2 0,071 0,092 0,600 0,617 0,632 0,617 0,607 0,608 Tamdy LEIV-6158Ar 3 0,105 0,076 0,606 0,611 0,632 0,613 0,608 0,608 Crimean-Congo hemorrhagic fever virus 4 0,748 0,750 0,749 0,543 0,548 0,549 0,613 0,591 Dugbe virus 5 0,771 0,773 0,774 0,660 0,523 0,562 0,612 0,604 Hazara virus 6 0,762 0,760 0,758 0,637 0,600 0,529 0,612 0,604 Erve virus 7 0,757 0,761 0,754 0,657 0,682 0,623 0,601 0,589 Issyk-Kul virus 8 0,752 0,750 0,750 0,759 0,761 0,745 0,748 0,577 Caspy virus 9 0,752 0,752 0,753 0,744 0,774 0,740 0,744 0,728 S-сегмент (N) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tamdy LEIV-1308Uz 1 0,056 0,056 0,555 0,563 0,551 0,594 0,581 0,569 Tamdy LEIV-10226Az 2 0,057 0,083 0,553 0,567 0,553 0,602 0,581 0,566 Tamdy LEIV-6158Ar 3 0,051 0,077 0,555 0,563 0,552 0,593 0,576 0,572 Crimean-Congo hemorrhagic fever virus 4 0,680 0,679 0,676 0,417 0,424 0,533 0,535 0,573 Hazara virus 5 0,685 0,687 0,689 0,443 0,436 0,534 0,545 0,580 Dugbe virus 6 0,667 0,666 0,675 0,470 0,483 0,536 0,574 0,573 Erve virus 7 0,723 0,729 0,723 0,613 0,625 0,619 0,568 0,582 Issyk-Kul virus 8 0,716 0,722 0,713 0,670 0,675 0,683 0,701 0,561 Caspy virus 9 0,710 0,708 0,715 0,725 0,733 0,725 0,732 0,732 Примечание. Вверху справа данные для нуклеотидных последовательностей, внизу слева - для аминокислотных. кации является филогенетический анализ генома. Ранее нами показано, что метод полногеномного секвениро-вания (next-generation sequencing) может быть успешно использован для получения геномных данных и дальнейшего филогенетического анализа с целью классификации новых или неизвестных РНК-вирусов [25-29]. В результате анализа данных секвенирования геномного материала трех топотипных штаммов - TAMV / LEIV-1308Uz, TAMV / LEIV-6158Ar и TAMV / LEIV-10226Az - с использованием сервиса BlastX найдены последовательности, обладающие гомологией с вирусами рода Nairovirus. Эти данные подтвердили первоначальное отнесение TAMV к сем. Bunyaviridae на основе морфологии вирио-на. Результаты дальнейшего анализа полученных данных показали, что определены практически полные последовательности генома всех трех исследуемых штаммов TAMV (ID GenBank: KF801653, KF801654, KF801655). Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения полных последовательностей генома буньявирусов животных, представлены на рис. 1. TAMV входит в состав рода Nairovirus и формирует филогенетически самостоятельный кластер. TAMV имеет низкий уровень гомологии с другими наировирусами. Гомология TAMV по аминокислотной последовательности РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp, L-сегмент) составляет менее 40% с вирусами Крымской-Конго ге моррагической лихорадки (CCHFV), Хазара (HAZV) и Дугбе (DUGV), которые так же, как и TAMV, экологически связаны с иксодовыми клещами Ixodidae. Полные последовательности генома наировирусов, экологически связанных с аргасовыми (Argasidae) клещами, ранее нами определены только для двух новых вирусов - Иссык-Куль (ISKV, KF801652) и Каспий (CASV, KF801658). Уровень гомологии TAMv с ISKV и CASV по RdRp составляет 37,6 и 37,7% соответственно. Данные, полученные для консервативного вирусного белка RdRp, в целом соответствуют низким значениям гомологии структурных белков GnGc (M-сегмент) и белка нуклеокапсида (N, S-сегмент). Так, гомология TAMV с наировирусами по полипротеину-предшественнику GnGc составляет в среднем 25%. При этом уровень гомологии белка нуклеокапсида TAMV с наировирусами, связанными с иксодовыми клещами (CCHFV, DUGV, HAZV), несколько выше (33%), чем с вирусами, связанными с аргасовыми клещами (28%) (ISKV, CASV), что является отражением общего направления эволюционного процесса. Низкий уровень геномной гомологии TAMV с известными наировирусами, а также отсутствие антигенных связей между ними позволяют заключить, что TAMV является прототипным представителем новой антигенной и филогенетической группы в составе рода Nairovirus. Известно около 35 наировирусов, которые сгруппирова 19 ны в 7 серогрупп (CCHF, DUGV, Thiafora, Hughes, Dera Ghazi Khan, Sakhalin и Qalyub), однако полные геномные данные доступны только для некоторых из них. Для вирусов серогрупп Sakhalin, Qalyub, Dera Ghazi Khan и Hughes известны только частичные последовательности каталитического центра RdRp, которые были использованы для более подробного филогенетического анализа (рис. 2). Топология TAMV на представленной дендрограмме подтверждает классификацию TAMV как прото-типного вируса новой антигенной группы. Три изученных штамма - TAMV/LEIV-1308Uz, LEIV-6158Ar и LEIV-10226Az - имеют между собой высокий уровень идентичности (табл. 2). Штамм TAMV/LEIV-10226Az, изолированный в Азербайджане, обладает с про-тотипным штаммом LEIV-1308Uz около 99% гомологии по нуклеотидной и аминокислотной (RdRp) последовательностям L-сегмента. Штамм TAMV/LEIV-6158Ar из Армении более дивергентен и имеет с LEIV-1308Uz уровень гомологии 94,2 и 96,3% по нуклеотидной и аминокислотной последовательности соответственно. Полипротеин-предшественник оболочечных белков GnGc (M-сегмент), которые несут главные антигенные детерминанты, у трех изученных штаммов TAMV имеют определенные различия. Так, уровень гомологии между LEIV-1308Uz и LEIV-10226Az составляет 93%. Штамм TAMV / LEIV-6158Ar по данному белку имеет менее 90% гомологи с прототипным штаммом LEIV-1308Uz и 93% с LEIV-10226Az. Различия по белку нуклеокапсида между тремя штаммами TAMV составляют 5-7% (93-95% гомологии). Зараженность TAMV самок и самцов клещей H. asiati-cum достигает 1 : 210 и 1 : 200 соответственно; личинок - в 20 раз ниже [9, 16, 19]. TAMV выделен из личинок H. asi-aticum, выведенных из кладок собранных в природе самок, что свидетельствует о трансовариальной передаче вируса. Подвид H. asiaticum asiaticum - самый ксерофильный и наиболее массовый среди представителей рода Hyalom-ma и подсем. Ixodinae [30]. Это объясняет распространение TAMV в центральной части Кызылкумов, Каракумах, Приаральских Каракумах и Муюнкумах [9]. TAMV - единственный из известных арбовирусов, циркуляция которого показана в аридных песчаных пустынях, даже в районах слабозакрепленных песков [31, 32]. Личинки клещей H. asiaticum паразитируют на грызунах и ежах, а H. marginatum - на зайцах и птицах. Эти животные наряду с овцами и верблюдами являются прокормителями имаго иксодид, которые участвуют в поддержании циркуляции TAMV [21, 22]. Клещи H. asiaticum asiaticum редко нападают на людей, поэтому эпидемические вспышки лихорадки Там-ды не возникают, но при хозяйственном освоении пустынных районов, возникновении скоплений людей (например, при военных действиях) нельзя исключать возникновения опасных для человека эпидемических ситуаций. При развитии отгонного скотоводства может повышаться вероятность контактов людей с инфицированными животными (овцы, верблюды и т. д.). Зондирование территории Средней Азии и Закавказья проводили в рамках Программы по биобезопасности и изучения биоразнообразия в различных экосистемах Северной Евразии и для пополнения Государственной коллекции вирусов РФ [7, 32-34].

References

Supplementary files