New subtype of influenza A virus from bats and new tasks for ecologo-virological monitoring

Full Text

Известные, в настоящее время, хозяева вируса гриппа А (Orthomyxoviridae, Influenza A virus) принадлежат классам птиц (Aves Linnaeus, 1758) и млекопитающих (Mammalia Linnaeus, 1758) типа хордовые (Chordata Bateson, 1885) [3, 15, 4, 29, 32, 41, 42], а также классу хромадорей (Chromadorea Inglis, 1983) типа круглые черви (Nematoda Rudolphi, 1808) [3, 32, 47, 48]. Основным природным резервуаром вируса гриппа А являются птицы водно-околоводного экологического комплекса: главным образом, представители отряда пластинчатоклювых, или гусеобразных (Anseriformes Wagler, 1831), среди которых ведущая роль принадлежит подсемейству благородных уток (Anatinae Leach, 1820) семейства утиных (Anatidae Vigors, 1825), а также представители отряда ржанкообразных (Charadriiformes Huxley, 1867) из подотряда чаек (Lari), куда входят семейства чайковых (Laridae Rafinesque, 1815), водорезовых (Rynchops Linnaeus, 1758), поморниковых (Stercorariidae Gray, 1870) и крачковых (Sternidae Vigors, 1825) [4, 15, 32, 42]. Из 116 известных, на сегодняшний день, субтипов (комбинаций подтипов гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA)) вируса гриппа А 114 (98.3 %) изолированы от диких и домашних птиц. Первое исключение это изолированный от свиней субтип H1N7, представляющий собой реассортант эпидемического штамма A/USSR/90/1977 (H1N1) (от которого наследованы сегменты PB2, PB1, PA, HA, NP и NS) и вируса гриппа A/equine/Prague/1/1956 (H7N7) лошадей, известного ранее как грипп лошадей 1-го типа (от которого наследованы сегменты NA и M) [35]. Второе исключение субтип H17N10 (номенклатура которого ещё не утверждена окончательно), обнаруженный в популяциях летучих мышей Центральной Америки (см. далее). НА вирусов гриппа А птиц обладают аффинностью к а2-3-сиалозидам (полисахаридам, терминированным остатком сиаловой кислоты, который связан со следующим моносахаридом а2-3-связью) [2, 14, 17, 28, 32, 42, 51], в большом количестве представленным на поверхности эпителиоцитов слизистых оболочек птичьего кишечника. Как следствие, заболевание у птиц протекает в форме энтерита (при высоковирулентном гриппе А (H5) и A (H7) добавляется сосудистая, дерматологическая и нейросимптоматика), вирус выделяется в окружающую среду с фекалиями, а заражение происходит фекальнооральным путём [3, 4, 18-24, 26, 31, 42]. Благодаря своей высокой экологической пластичности вирус гриппа А способен преодолевать межвидовые барьеры, проникать в популяции других хозяев, адаптироваться и длительное время циркулировать среди них. Проникая от птиц в популяции млекопитающих, вирус гриппа А принципиально меняет схему своей циркуляции: распространяется, в основном, капельно-воздушным путём и вызывает острое респираторное заболевание, способное протекать с осложнениями, наиболее опасными из которых являются пневмония и синдром Рея [5, 6-8, 17, 28, 36, 49]. Столь значительная разница объясняется тем, что в отличие а2-3-специфичности птичьих штаммов НА вирусов гриппа А млекопитающих высоко аффинны к а2-6-сиалозидам [2, 14, 17, 28, 32], которые представлены на поверхности эпителиоцитов слизистых оболочек верхних отделов респираторного тракта. Таким образом, специфичность НА к а2-6-сиалозидам является необходимым (но не достаточным) условием появления у вируса гриппа А эпидемического потенциала. Поэтому вирусы гриппа А, адаптированные к млекопитающим (т.е. имеющие а2-6-рецепторнуюспецифичность), представляют основной интерес в контексте прогнозирования опасных эпидемических ситуаций. Это положение было наглядно продемонстрировано весной 2009 г., когда вирус гриппа А (H1N1) pdm09, сформировавшийся в результате реассортации североамериканского и евразийского генотипов вируса гриппа А (H1N1) свиней [11, 16, 52], имея а2-6-рецепторную специфичность, быстро распространился по всему миру, став этиологическим агентом новой пандемии «свиного» гриппа. Однако особенностью организма свиней является наличие у эпителиоцитов слизистых оболочек их респираторного тракта одновременно и а2-3-, и а2-6-сиалозидов. Поэтому неудивительно, что пандемические штаммы с самого начала своего появления имели смешанную а2-6/ а2-3-рецепторную специфичность [8, 11-13, 30] и потому обладали потенциальной способностью к положительной селекции в направлении а2-3-рецепторной специфичности в нижних отделах респираторного тракта человека, где имеется значительное содержание а2-3-сиалозидов на поверхности эпителиальных клеток, что в свою очередь приводило к развитию тяжёлых летальных пневмоний [8, 12, 17, 25]. Другой пример: экспериментальная адаптация высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1) птиц к верхним отделам респираторного тракта хорьков и воздушно-капельному пути передачи, осуществлённая исследовательскими группами под руководством проф. Фуше [38, 39] и проф. Каваока [40], привела к таким изменениям рецептор-связывающего сайта НА, которые способствовали появлению а2-6-рецепторной специфичности. Обнаружение нового связанного с летучими мышами субтипа вируса гриппа А [50], обладающего рядом уникальных молекулярно-генетических характеристик включая структуру рецептор-связывающего сайта НА позволяет по-новому взглянуть на эволюцию и экологию этого вируса и сформулировать новые задачи эколого-вирусологического мониторинга. Обнаружение нового субтипа вируса гриппа А было сделано при обследовании с помощью ОТ-ПЦР с CODEHOP-праймерами [45, 46] на грипп А 316 клоакальных смывов от 21 вида летучи мышей, отловленных на территории низменности тихоокеанского побережья Гватемалы (рис. 1.А-В), покрытой сухими тропическими лесами с преобладанием махагони (рис. 1.Г), «испанского кедра», красильной хлорофоры и сидероксилона [1]. Исследование летучих мышей проводилось в рамках мониторинга исторических природных очагов [33, 43] паралитического бешенства КРС, природным резервуаром и переносчиками которого являются рукокрылые вампиры из подсемейства Desmodontinae Bonaparte, 1845 семейства листоносых (Phyllostomidae Gray, 1825) [34, 44]. В ходе массового отлова рукокрылых образцы отбирались от всех видов пойманных летучих мышей. Три клоакальных смыва (2 в материале 2009 г.; 1 в 2010 г. см. рис. 1.В) от желтоплечих листоносов (Sturnira lilium Geoffroy, 1810) (рис. 1.Д), которые не относятся к вампирам, содержали геномы вируса гриппа А, после полноразмерного секвенирования которых авторы работы [50] присвоили соответствующим вирусным вариантам обозначения A/little yellowshouldered bat/Guatemala/153/2009, A/little yellow-shouldered bat/Guatemala/164/2009 и A/little yellow-shouldered bat/Guatemala/060/2010. Однако следует иметь в виду, что такие обозначения используются для штаммов вируса гриппа А, которые, в данном случае, получены не были, несмотря на попытки изоляции вируса на моделях развивающихся куриных эмбрионов и клеточных линий [50] (скорее всего, причина неудачной изоляции -строение рецептор-связывающего сайта нового субтипа, который отличается и от всех известных эпидемических и птичьих вариантов). Молекулярно-генетический анализ нового субтипа вируса гриппа А показывает, что, несмотря на общий план строения генома, характерный для представителей рода Influenza A virus [4, 32], ряд генетических характеристик выделяют его среди других представителей этого рода. В первую очередь, обращает на себя внимание низкая гомология поверхностных белков НА (рис. 2) и NA (рис. 3) с другими субтипами вируса гриппа А. Дистантность НА нового варианта вируса гриппа А от известных субтипов это вируса составляет от 47.4 % (для Н2) и 47.7 % (для Н5) до 63.1 % (для Н15) и 63.2 % (Н10), считая среднее парное расстояние между аминокислотными последовательностями. Для белков это значительное расстояние, и обнаруженный вирусный вариант имеет все основания стать протипным для нового подтипа гемагглютинина Н17 (со сделанными уже выше оговорками об отсутствии штамма per se). При этом Н17 принадлежит кластеру подтипов, включающему Н1, Н2, Н5, Н6, Р8, Н9, Н11, Н12, Н13 и Н16 (см. рис. 2). Рисунок 1. Место сбора полевого материала, в котором обнаружен новый субтип H17N10 вируса гриппа А: А Центральная Америка на карте Западного полушария Земли; Б карта Центральной Америки (увеличенное изображение прямоугольной области на рис. А); В карта Гватемалы (увеличенное изображение прямоугольной области на рис. Б) и места сбора полевого материала (□ 2009 г.; Л 2010 г.), в котором обнаружен субтип H17N10 вируса гриппа А; Г типичный вид сухого тропического леса в низменности тихоокеанского побережья Гватемалы (на переднем плане видны махагони типичные растения этой зоны), где были отловлены летучие мыши; Д желтоплечий листонос (Sturnira lilium) хозяин нового субтипа H17N10 вируса гриппа А. г д НА НЮ Н15 Н7 Н14 Н4 НЗ HS Н12 HS Н16 Н13 Н11 Н17 Н6 Н5 Н2 Н1 В Рисунок 2. Иерархические отношения между аминокислотным последовательностями различных субтипов НА вируса гриппа А, а также вирусами гриппа В и С (метод вычисления дистантности усреднение парных расстояний; аггломеративный алгоритм UPGMA -unweighted pair-group method using arithmetic averages -«невзвешенного среднего»), варианта вируса гриппа А даже в большей степени, чем НА, «достойна» стать прототипом для нового подтипа NA N10. Вместе с тем, следует иметь в виду, что на момент написания данной статьи официальная номенклатура для нового субтипа ещё не была одобрена Международным Комитетом по таксономии вирусов. Обращает на себя внимание интересный факт: дистантность NA / N10 больше по отношению ко всем известным -подтипам NA вируса гриппа А, чем дистантность между ними и NA вируса гриппа В. Причём эта ситуация имеет место в разрез с обычной ситуацией, когда вариабельность HA выше, чем NA. По-видимому, имела место реассортация с наиболее древним из известных на сегодняшний день вариантом вируса А В А Рисунок 3. Иерархические отношения между аминокислотным последовательностями различных субтипов NA вируса гриппа А и В (метод вычисления дистантности усреднение парных расстояний; аггломеративный алгоритм UPGMA -unweighted pair-group method using arithmetic averages -«невзвешенного среднего»). Однако сайт протеолитического нарезания НА / Н17 кардинальным образом отличается от такового у НА / Н1-16 (табл. 1). Это свидетельствует о том, что хозяйские протеазы, которые делают вирус инфекционно активными, также существенно отличаются. Ещё более неожиданна структура рецептор-связывающего сайта НА. Новый подтип Н17 содержит А222 и Н223, в то время, как эпидемические штаммы содержат D222 и Q223 (штаммы от больных летальной тяжёлой первичной пневмонией, обладающие повышенным сродством к а2-3-сиалозидам G222, N222, E222, V222 и R223) [8, 12, 17, 25], а штаммы от птиц обычно содержат G222 [18-24, 30, 42]. Более того, новый подтип Н17 содержит уникальные N190, Q224 и D225, которые также могут влиять на рецепторную специфичность, которая остаётся пока главной загадкой, способной пролить свет на эпидемический потенциал вируса гриппа А от летучих мышей. Дистантность NA нового варианта вируса гриппа А от известных субтипов это вируса составляет от 72.9 % (для N1) 73.1 % (для N5) до 78.8 % (для N2) и 80.2 % (N9), считая среднее парное расстояние между аминокислотными последовательностями. Таким образом, NA обнаруженного NA гриппа, который предшествовал и вирусам гриппа А, и вирусам гриппа В. Произошла ли эта реассортация в организме желтоплечих листоносов, или вирус проник в их популяцию уже после реассортации, ещё предстоит выяснить. Лиганд-связывающий сайт NA / N10 тоже обладает рядом структурных особенностей: R119, N274, N292, в то время, как большинство диких штаммов вируса гриппа содержат E119, H274, R292, а штаммы, резистентные к действию ингибиторов NA (озельтамивир, занамвир) V119, Y274, K292. Это ещё подтверждая гипотезу уникальной рецепторной специфичности нового субтипа вируса гриппа А и древности происхождения NA / N10 (имея в виду замену в 292-ом сайте NA, которая находится в области активного центра фермента, демонстрирующего высокий уровень эволюционного консерватизма в отсутствие селективного отбора под действием химиопрепаратов). Таблица 1. Аминокислотные последовательности сайта протеолитического расщепления гемагглютинина различных вариантов вируса гриппа А. Вариант вируса гриппа А Сайт протеолиза * гемагглютинина Пандемические штаммы «Испанский грипп» (1918-1919 гг.) A (H1N1) pdm1918 PS....IQSR|G «Азиатский грипп» (1957-1958 гг.) A (H2N2) pdm1958 PQ....IESR|G «Гонконгский грипп» (1968-1970 гг.) A (H3N2) pdm1958 PE....KQTR|G «Русский грипп» (1977-1978 гг.) A (H1N1) edm1977 PS....IQSR|G «Свиной грипп» (2009-2010 гг.) (п. I.3-6) A (H1N1) pdm2009 PS....IQSR|G Штаммы от птиц авирулентные (LPAI Н5) PQ....RETR|G авирулентные (LPAI Н7) PEXP...KXR|G вирулентные (HPAI Н5) PQ..RKRKKR|G вирулентные (HPAI Н7) PEPSKKRKKR|G Штаммы птичьего происхождения, изолированные от людей Гонконг (1997 г.) (HPAI H5N1) PQRERRRKKR|G Гонконг (1999 г.) (LPAI H9N2) PQ....RSSR|G Нидерланды (2003 г.) (HPAI H7N7) PEIP.KRRRR|G Юго-Восточная Азия (2003 г.) (HPAI H5N1) PQRERRRKKR|G Нуклеотидные последовательности, обнаруженные у желтоплечих листоносов (Sturnira lilium) Г ватемала, низменность тихоокеанского побережья (2009-2010 гг.) A (H17N10) LN.....QME | G * Положительно заряженные основные аминокислоты выделены жирным шрифтом на голубом фоне; « . » -делеции, внесённые при выравнивании последовательностей; «|» точка протеолитического расщепления. Новые задачи эколого-вирусологического мониторинга вируса гриппа А возникают не только потому, что для этого вируса установлен новый хозяин, которого следует включить в перечень обследуемых видов, но главным образом потому, что имеются основания считать летучих мышей дополнительным природным резервуаром вируса гриппа А. Это положение требует дополнительной верификации, хотя предварительные филогенетические данные для HA (рис. 2), NA (рис. 3), внутренних генов (данные не представлены), а также уникальная структура рецептор-связывающего сайта, отличная от таковой у штаммов от других млекопитающих и птиц, уже свидетельствует в его пользу. Отряд рукокрылых (Chiroptera Blumenbach, 1779) является единственным таксоном в классе млекопитающих, способным к активному полёту. Благодаря этому, рукокрылые, подобно птицам, способны к значительным сезонным миграциям. Кроме того, летучие мыши являются колониальными животными [9], что резко повышает эффективность распространения инфекционных заболеваний в их популяциях. Летучие мыши являются природным резервуаром для целого ряда вирусов (Arenaviridae, Bunyaviridae, Coronaviridae, Filoviridae, Flaviviridae, Paramyxoviridae, Picornaviridae, Rhabdoviridae, Togaviridae; теперь в этот список включается и Orthomyxoviridae) возбудителей опасных заболеваний человека. Желтоплечий листонос (Sturnira lilium), обитающий в Центральной и Южной Америке, не является вампиром, но плотояден [37]. Тот факт, что вирус гриппа А (H17N10) был обнаружен не только в фекалиях, но и во внутренних органах этого вида летучих мышей позволяет сделать вывод, что имела место продуктивная инфекция вируса, а не индикация вирусного гнома в остатках пищи. Этот вывод подтвержадется и высокой вирусной нагрузкой во внутренних органах S. lilium: 106-107 копий РНК/мл и серологическими данными [50]. Вирусологические исследования в Центральной Америке традиционно были направлены на изучение вампиров (Desmodontinae), поэтому детальные данные об экологии S. lilium, достаточных для построения эколого-вирусологических моделей, в настоящее время, отсутствуют. Не исключено, что свою роль могут играть и паразитические круглые черви (Nematoda, Chromadorea) [3, 32, 47, 48]. В любом случае, рукокрылые древняя группа млекопитающих известная с эоцена, а листоносые формируют автохтонную для Центральной Америки группу, ископаемые останки представителей которой находят с раннего миоцена. Поэтому вирус предположение о глубокой адаптации предкового вируса к S. lilium нуждается в дальнейшем исследовании, в том числе в контексте потенциальной возможности преодоления вирусом гриппа А (H17N10) межвидового барьера и проникновения в человеческую популяцию. В бывшем СССР функционировала стройная система мониторинга природноочаговых вирусных инфекций, научно-методическое руководство которой осуществлял НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР. Помимо медицинского и фундаментального научного значения эти исследования носили характер перманентных манёвров с целью профилактики возможных актов биотерроризма и обеспечения биологической безопасности государства. Одном из несомненных достоинств этой системы была возможность «тонкой функциональной настройки» применительно к вновь появляющимся возбудителям инфекционных заболеваний, условиям ландшафтной обстановки, лабораторным методам обследования полевого материала, etc.. В начале XXI века аналог советской системы мониторинга был воссоздан в условиях современной России на базе ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава и, как показала практика последнего десятилетия, сохранил свойство адаптироваться к новым технологическим схемам и быстро реагировать на возникающие угрозы (см. [10]). С этой целью в ближайшее время всем опорным базам Всероссийского Центра экологии и эпидемиологии гриппа с референс-центром по диагностике гриппа при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России необходимо: 1. обновить информацию о современной таксономической структуре отряда рукокрылых (Chiroptera); 2. на территориях в зоне своей ответственности пополнить кадастр видов рукокрылых, мест их массового скопления, зимовки, характеристик взаимодействия с людьми и сельскохозяйственными животными, а также эпизоотических и эпидемических вспышек, связанных или возможно связанных с летучими мышами; 3. модифицировать технологии сбора полевого материала с целью включения биопроб от летучих мышей в схему обследования природных очагов вирусных инфекций; 4. профильным подразделениям разработать праймеры для индикации нового субтипа H17N10 с помощью ОТ-ПЦР, а также секвенирования функционально-значимых фрагментов генома и полноразмерного генома; 5. профильным подразделениям обновить базы данных нуклеотидных последовательностей для беспраймерного секвенирования нового субтипа H17N10; 6. коллекциям клеточных культур обновить реестры перевиваемых клеточных линий рукокрылых; 7. подготовить информацию об особенностях содержания рукокрылых в инфекционных вивариях; 8. расширить спектр синтетических сиалополигликанов, которые могут быть использованы для тестирования рецепторной специфичности вирусов гриппа А методом сиалозидо-ферментного анализа. Praemonitus premunitus учили древние. Открытие нового субтипа H17N10 является ещё одним грозным напоминанием о том, что вирус гриппа А ещё далеко не исчерпал свой эпидемический потенциал, до времени скрытый в глубинах его природной очаговости. Si vis pacem, para bellum.

References

Supplementary files