Efficiency of the Influenza A and B Viruses Isolation from Nasopharyngeal Swabs Taken in the Test Tubes Σ-Virocult® (M40 Compliant, Sigma Virocult) and Virocult® (M40 Compliant, Virocult) in 2010-2011 Epidemic Season

Full Text

Одним из направлений исследований в службе надзора за циркуляцией вирусов гриппа как в России, так и других странах мира является изоляция эпидемических штаммов из клинического материала. Значение изоляции состоит в уточнении этиологии эпидемических подъемов заболеваемости и определении долевого участия вирусов гриппа в структуре ОРВИ; получении новых антигенных вариантов вирусов гриппа А и В, их антигенной характеристики; изучении биологических и молекулярно-генетических свойств; выборе и подготовке кандидатов в вакцинные штаммы и диагностические препараты; определении чувствительности выделенных штаммов к этиотропным препаратам (ремантадин, арбидол, ингибиторы нейраминидазы); оценке эффективности вакцинопрофилактики гриппа путем сопоставления данных по степени родства вакцинных штаммов и их эпидемических вариантов. Эффективность изоляции штаммов зависит от ряда факторов, среди которых особое место занимает взятие материала и его хранение до начала лабораторных исследований. В обычной практике вирусологов нашей страны используют транспортную среду, которую готовят на основе среды Игла МЕМ [4]. Безусловно наиболее удобными как для вирусологов, так и для врачей, берущих анализы, являются коммерческие пробирки с уже готовой транспортной средой, упакованные с тампонами для взятия материала. Их вариантами являются пробирки с транспортной средой Σ-Virocult® (M40 Compliant, Sigma Virocult) и Virocult® (M40 Compliant, Virocult). Одно из достоинств этих пробирок - возможность их хранения при комнатной температуре, а после взятия клинического материала - при 4°С. Целью настоящего исследования было сравнительное изучение эффективности изоляции штаммов вирусов гриппа А и В в период эпидемического подъема 2010-2011 гг. при взятии клинических образцов в пробирки с транспортной средой на основе среды Игла МЕМ и в коммерческие пробирки Σ-Virocult® (M40 Compliant, Sigma Virocult) и Virocult® (M40 Compliant, Virocult). Материалы и методы Пробирки для взятия носоглоточных смывов. Среды Игла МЕМ с добавлением антибиотика (гентами-цин), альбумина и хепес-буфера; Σ-Virocult® (M40 Compliant, Sigma Virocult, lot 10A06) и Virocult® (M40 Compliant, Virocult, lot 10B10), предоставленные компанией ООО "МК Рустек". Клинический материал. Носоглоточные смывы от больных с диагнозом гриппа отбирали в первые 3 дня заболевания по клиническому диагнозу. Материал от одного пациента дублировали на 2 пробирки. Материал, взятый в среду Игла МЕМ, замораживали при -20°С; материал, взятый в коммерческие пробирки, хранили при 4°С не более 3 сут до использования в исследовании (рекомендации производителя). Молекулярно-генетические методы. Подтверждением наличия вируса гриппа в носоглоточном смыве был положительный результат диагностики с ОТ-ПЦР-РВ с использованием коммерческих наборов АмплиСенс Influenza virus A/B-FL и АмплиСенс Influenza virus A/H1-swine-FL, "Интерлабсервис", Россия [2]. Изоляция вирусов гриппа. Использовали монослой клеток культуры ткани MDCK как наиболее чувствительной линии клеток в отношении вирусов гриппа А и В [10]. Первичное заражение монослоя клеток культуры ткани MDCK проводили по методике H. Davies и соавт. [7]. Индикацию вирусных изолятов, полученных на клетках культуры MDCK, выполняли в реакции гемагглютинации (РГА) [4]. Определение антигенной структуры штаммов. Антигенную структуру выделенных штаммов определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с использованием эталонных штаммов вирусов гриппа A(H1N1)swl и В, A/Калифорния/7/2009(H1N1)swl и В/Брисбен/60/2007 и приготовленных к ним специфических поликлональных сывороток [3, 4]. Эталоны получены из справочного центра ВОЗ по гриппу (CDC&P, США), а также коллекции лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России. Определение инфекционной активности вирусов. Инфекционную активность вирусов определяли согласно методике, описанной ранее [6]. Инфекционные титры рассчитывали по методу Рида и Менча [5]. Результаты Настоящее исследование предусматривало 2 этапа работы. На первом этапе проведено сравнительное изучение эффективности культивирования пандемического штамма вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl при разных режимах хранения материала в пробирках с транспортной средой на основе среды Игла МЕМ и в коммерческих пробирках со средой Σ-Virocult® (M40 Compliant, Sigma Virocult). Эффек- Контактная информация: Шевченко Елена Сергеевна, канд. мед. наук; e-mail: esshevchenko@yandex.ru 43 тивность культивирования вируса оценивали путем сравнения результатов инфекционной активности вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl, полученных при хранении вируса, разведенного средой Игла мЕм и Σ-Virocult® (M40 Compliant, Sigma Virocult), в режимах: при комнатной температуре, 4оС, -20оС в течение 7 и 14 дней. В табл.1 представлены результаты определения инфекционных титров вируса гриппа A/IIVMoscow/01/2009 (H1N1)swl при различных режимах хранения пробирок. Как видно из представленных данных, практически при всех режимах хранения вируса в его разведении транспортной средой Σ-Virocult® (M40 Compliant, Sigma Virocult) инфекционные титры ниже аналогичных показателей для среды Игла МЕМ на 1,0—3,0 lg, что является статистически значимым. Исключение составил режим хранения при 4оС в течение 14 дней, для которого показатели инфекционных титров были сравнимы. Тем не менее предварительные результаты позволили сделать вывод о возможности хранения материала в течение более длительного срока (до 14 дней), не прибегая к замораживанию (результаты сравнимы при хранении при комнатной температуре). При всех режимах вирус сохранял жизнеспособность и мог быть рекультивирован с достаточным инфекционным титром, необходимым для его дальнейшего изучения. На втором этапе проведены исследования, посвященные оценке эффективности изоляции эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В из носоглоточных смывов, взятых в пробирки со средой на основе среды Игла МЕМ, а также Σ-Virocult® (M40 Compliant, Sigma Virocult) и Virocult® (M40 Compliant, Virocult). В эпидемическом сезоне 2010-2011 гг. в России циркулировали штаммы вирусов гриппа A(H1N1)pdm09 и В, что было определено в настоящем исследовании. Штаммы вируса гриппа A(H1N1)pdm09 были антигенно родственны эталону А/Калифорния/7/2009 (H1N1)swl. Штаммы гриппа В были родственны эталонному вирусу В/Брисбен/60/2007 (линия В/Виктория-подобных) [1]. В табл. 2 и табл. 3 в сравнительном плане представлены результаты изоляции эпидемических штаммов из носоглоточных смывов, взятых в пробирки со средой на основе среды Игла МЕМ, Σ-Virocult® (M40 Compliant, Sigma Virocult) и Таблица 1 Инфекционные титры вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl при разных режимах разведения и хранения Режим хранения пробирок с транспортной средой Инфекционный титр вируса, (lg) разведение вируса в среде Игла МЕМ разведение вируса в среде Σ-Virocult® (M40 Compliant, Sigma Virocult) Исходный титр вируса 6,7 6,45 Через 7 дней t комнатная 3,5 2,5 4oC 4,0 2,5 -20oC 5,5 2,5 Через 14 дней t комнатная 3,5 1,7 4oC 5,5 5,0 -20oC 6,7 1,7 Virocult® (M40 Compliant, Virocult) от пациентов, госпитализированных с предварительным диагнозом “грипп” средней и тяжелой формы. Критерием отбора пациентов был клинический диагноз, в связи с чем не во всех случаях была подтверждена гриппозная инфекция или наличие вирусов гриппа в носоглоточном смыве, выявляемых постановкой ОТ-ПЦР-РВ. Только по клиническим симптомам среди 60 пациентов, включенных в исследование, грипп был подтвержден у 42 положительным результатом на специфическую РНК вируса гриппа А и В методом ОТ-ПЦР-РВ. При этом эффективность изоляции составила 52% (22 пациента), что является достаточно высоким показателем (обычно не более 20%). Эффективность изоляции штаммов вирусов гриппа А и В из носоглоточных смывов больных, взятых в пробирки Σ-Virocult® (M40 Compliant, Sigma Virocult) и Virocult® (M40 Compliant, Virocult) c транспортной средой, в эпидемическом сезоне 2010-2011 гг. была достаточно высокой и сравнимой с эффективностью изоляции штаммов вирусов гриппа из носоглоточных смывов, взятых в пробирки со средой Игла МЕМ, по всем оцениваемым показателям: эффективности выделения, пассажу изоляции, титру изолята, возможности проведения ОТ-ПЦР-РВ, спектру вирусов гриппа А и В. Таблица 2 Изоляция эпидемических штаммов при применении пробирок Σ-Virocult® (M40 Compliant, Sigma Virocult) с транспортной средой Пробирки для взятия носоглоточных смывов Число пациентов с РНК вирусов гриппа, выявленной Число пациентов с выделенным вирусом в клетках культуры MDCK пациен пассаж выделения титр ГА при выделении тов методом ОТ-ПЦР-РВ первичное заражение 1-й пассаж в целом 1/4 1/8 1/16 Со средой Σ-Virocult® 30 26 11 2 13 8 4 1 Со средой Игла МЕМ 12 1 13 4 9 - Таблица 3 Изоляция эпидемических штаммов при применении пробирок Virocult® (M40 Compliant, Virocult) c транспортной средой Пробирки для взятия носоглоточных смывов Число пациентов Число пациентов с РНК вирусов гриппа, выявленной методом ОТ-ПЦР-РВ Число пациентов с выделенным вирусом в клетках культуры MDCK пассаж выделения титр ГА при выделении первичное заражение 1-й пассаж в целом 1/4 1/8 1/16 1/32 9 - 9 3 5 - 1 Со средой Virocult® Со средой Игла МЕМ 44 30 16 7 2 9 5 2 1 1 Обсуждение Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о достаточно высокой эффективности изоляции штаммов вирусов гриппа А и В из носоглоточных смывов больных, взятых в пробирки Σ-Virocult® (M40 Compliant, Sigma Virocult) и Virocult® (M40 Compliant, Virocult) c транспортной средой, которая была сравнима с эффективностью изоляции штаммов вирусов гриппа из носоглоточных смывов, взятых в пробирки со средой Игла МЕМ по всем оцениваемым показателям. Наши результаты подтверждают многочисленные данные зарубежных исследователей. Данные литературы указывают на высокую эффективность культивирования вирусов гриппа А и B, а также РС-вируса, аденовируса, риновируса, вируса парагриппа, корона-вируса, энтеровируса из смывов, взятых в транспортную среду Virocult®, сравнимую с эффективностью среды Игла МЕМ. Значимым является тот факт, что среда Virocult® совместима со многими молекулярнодиагностическими методами исследования: иммунохроматографией, ИФА, ПЦР и культивированием на разных клеточных линиях [8, 9]. Наше исследование подтвердило сохранение жизнеспособности вирусов гриппа А и В при длительном хранении клинического материала до 14 дней при комнатной температуре и при 4оС без замораживания, что является, безусловно, значимым при отсутствии необходимого оборудования. Презентация проф. A. Rudsdale на последнем клинико-вирусологическом симпозиуме продемон-стри-ровала, что транспортная среда Virocult® поддерживает вирус гриппа в жизнеспособном состоянии, по крайней мере 8 дней при двух температурных режимах: 4оС и комнатной температуре, а также совместима со многими молекулярными методами исследования для обычной и быстрой идентификации известных штаммов. Virocult® соответствует мировому стандарту для транспортных сред, который утвержден и зарегистрирован для использования во всем мире, включая США и Канаду [12]. Другие зарубежные исследования продемонстрировали высокую эффективность изоляции вируса гриппа типа А, а также аденовируса, вируса парагриппа, риновируса и вируса простого герпеса 1-го и 2-го типов из смывов, взятых в пробирки со средой Virocult®, после хранения материала в течение 7 дней при комнатной температуре и при 4оС [11]. Транспортная среда Virocult® использовалась на протяжении многих лет во Франции для отбора проб в рамках эпиднадзора за гриппом. Применяя методы диагностики ЩТ-ПЦР и ИФА, исследователи показали, что среда Σ-Virocult® является надежной и повышает эффективность изоляции вируса гриппа A(H3N2), а также его жизнеспособность при сроке хранения до 4 дней при комнатной температуре и 4оС [13]. Заключение Полученные данные могут быть использованы для решения проблемы взятия и хранения носоглоточных смывов от больных в период эпидемии гриппа в пробирках с транспортными средами Σ-Virocult® (M40 Compliant, Sigma Virocult) и Virocult® (M40 Compliant, Virocult), а также и эффективной изоляции из них штаммов вирусов гриппа А и В. Транспортная среда Virocult® пригодна для идентификации новых вирусов гриппа и других респираторных вирусов, а также для дифференциальной диагностики острых респираторных инфекций.

References

Supplementary files