A Comparative Study of the Antiviral Activity of Chemical Compounds Concerning the Orthopoxviruses Experiments in vivo

Full Text

Ортопоксвирусы могут вызывать у людей заболевания с широким диапазоном клинических проявлений: от серьезных диссеминированных повреждений в случае заражения вирусом натуральной оспы (ВНО) до локальных повреждений при инфекции, вызванной вирусом оспы коров. После завершения программы «глобальной ликвидации оспы» на Земле благодаря массовой иммунизации населения и отмены вакцинации против оспы в 1980 г. в мире сложилась опасная ситуация, когда более половины людей на планете не имеют иммунитета против ортопоксвирусных инфекций. Несмотря на то что ВНО элиминирован из окружающей среды, другие ортопоксвирусы, например вирусы оспы обезьян и оспы коров, существуют, эволюционируют, распространяются и вызывают вспышки заболеваний среди людей [1, 2]. Также нельзя забывать о возможности использования ВНО биотеррористами, поскольку нет гарантии отсутствия его нелегального хранения или реконструкции на основе структуры ДНК [3]. В связи с этим особую важность приобретает поиск и разработка противовирусных препаратов, эффективных в отношении ВНО и других патогенных для человека ортопоксвирусов. Применение существующих средств профилактики и лечения ортопоксвирусных инфекций ограничено высоким риском осложнений при вакцинации, особенно у людей с дефектами иммунной системы [4], а также быстрым формированием невосприимчивости вирусов к химиотерапии [5, 6]. Среди субстанций, пригодных для лечения ортопоксвирусных инфекций, названы тиосемикарбазоны, аналоги нуклеозидов, нуклеотидов, ациклические нуклеозиды и нуклеотиды, интерфероны и их индукторы [6]. К настоящему времени наиболее исследованными и перспективными противооспенными средствами являются разрабатываемые в США препараты гексадецил-оксипропил сидофовир (CMX001) и ST-246 [5, 7, 8]. Тем не менее надежные лекарственные средства для профилактики и лечения натуральной оспы и других ортопоксви-русных инфекций у человека до сих пор отсутствуют, поэтому проблема их создания является по-прежнему актуальной. Целью данной работы было изучение противовирусной активности отечественных химически синтезированных соединений в отношении вирусов эктро-мелии и оспы обезьян в экспериментах на лабораторных животных. Материалы и методы Животные. В экспериментах использовали ауто-бредных мышей ICR обоего пола, полученных из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Животные содержались при естественном освещении на стандартном рационе со свободным доступом к воде. При выполнении исследований соблюдали «Правила проведения работ с ^пользованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.77 № 755) и придерживались «Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных» [9]. Вирусы. В работе использовали вирус эктромелии (ВЭ, штамм К-1) и центрально-африканский штамм вируса оспы обезьян (ВОО, штамм V79-1-005), полученные из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (пос. Кольцово, Новосибирская область). Вирусы нарабатывали в культуре клеток Vero. Концентрацию вирусов в культуральной жидкости определяли путем титрования методом бляшек в культуре клеток Vero, рассчитывали и выражали в десятичных логарифмах бляшкообразующих единиц в 1 мл (lg БОЕ/мл) [10]. Концентрация вируса в использованных в работе образцах ВЭ и ВОО составляла от 5,6 до 6,7 lg БОЕ/мл. Наработанные и использованные серии вирусов с указанным титром хранили при -70oC. Контактная информация: Кабанов Алексей Cергеевич, науч. сотр.; e-mail: kabanov@vector.nsc.ru 40 В экспериментах с ВОО использовали изолирующие пневмокостюмы в лаборатории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» с максимальным уровнем биологической защиты BSL-4. Инфицирование мышей ВЭ и ВОО. Перед заражением мышей наркотизировали с помощью эфирного наркоза. Было установлено, что 50% летальная доза (ЛД50) при интраназальном (и/н) введении ВЭ мышам массой 12-14 г равна 1,57 lg БОЕ/голову (37,2 БОЕ/ гол.). При изучении противовирусной активности препаратов заражение мышей ВЭ производили путем введения и/н по 40 мкл суммарно в обе ноздри в дозе 10 ЛД50/гол. Ранее нами было показано, что мыши массой 9-11 г чувствительны к ВОО, который начиная с 7-х суток после и/н введения в дозе 4,8 lg БОЕ/гол. вызывает у 50 % мышей появление клинических признаков заболевания (гнойный конъюнктивит, блефарит, взъеро-шенность шерсти), исчезающих через 11-13 сут после заражения в отсутствие гибели мышей [11]. При наличии размножения ВОО в легких через 7 сут после и/н заражения мышей разными дозами ВОО была определена 50% инфицирующая доза (ИД50), равная 2,35 lg БОЕ/гол. (224 БОЕ/гол.). При изучении противовирусной активности препаратов мышей и/н заражали ВОО из расчета 30 мкл суммарно в обе ноздри в дозе 10 ИД50/гол. Химические соединения. В работе были использованы 4 химических соединения, конденсированные производные пирролидин-2,5-диона, синтезированные в Новосибирском институте органической химии (НИОХ) им. Н.Н. Ворожцова СО РАН и ранее проявившие противовирусную активность в отношении ортопоксвирусов in vitro: {3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.02,6.08,10]додец- 11-ен-4-ил}тиомочевина (НИОХ-3); полуги-драт 4-{3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.02,6.08,10] додец-11-ен-4-ил}-4-азатетрацикло[5.3.2.02,6.08,10] додец-11-ен-3,5-диона (НИОХ-4); 7-[№-(4-триф-торметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.02,4]нон-8-ен-6-карбоновая кис лота (НИОХ-14); гидрат К-{3,5-диоксо-4-аза-тетрацикло[5.3.2.02,6.08,10]додец-11-ен-4-ил}-2-гидроксибензамида (НИОХ-32) [12]. В качестве положительного контроля использовали химическое соединение с установленной противооспенной активностью 4-трифторметил-N-(3,3a,4,4a,5,5a,6,6a-октагид-ро-1,3-диоксо-4,6-етеноциклопроп[1:]изоиндол-2(Ш)-ил)-бензамид (ST-246), синтезированное в НИОХ им. Н.Н. Ворожцова СО РАН по описанной методике [13]. Все лабораторные образцы химических соединений были охарактеризованы и паспортизованы. Введение химически синтезированных препаратов при инфицировании мышей ВЭ. Для исследования использовали препараты НИОХ-3, НИОХ-4, НИОХ-14, НИОХ-32 и ST-246. Все препараты вводили перорально 1 раз в сутки в дозе 50 мкг/г через 1 ч после заражения и далее в течение 9 сут после заражения ВЭ. Доза и схема введения препаратов были выбраны на основании литературных данных, согласно которым ST-246 в диапазоне доз от 30 до 100 мкг/г был эффективным в отношении летальных ортопоксвирусных инфекций у мышей [5, 7, 8, 14]. После заражения ВЭ за животными наблюдали в течение 21 сут, определяли долю павших животных, подсчитывали коэффициент защиты (КЗ равно % павших в контроле - % павших в опыте) и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) в каждой группе. За максимальную продолжительность жизни выживших животных принимали 21 сут после заражения ВЭ, т. е. гарантированное время прекращения специфической гибели инфицированных мышей, что было установлено эмпирически при многократном повторении аналогичных экспериментов. Через 6 сут после заражения 10 ЛД50 ВЭ у 5 животных из каждой группы брали легкие для определения титров ВЭ. Введение химически синтезированных препаратов при инфицировании мышей ВОО. Для исследования использовали химически синтезированные соединения НИОХ-14, НИОХ-32 и ST-246. Все препараты вводили перорально 1 раз в сутки в дозе 60 мкг/г за 1 сут до заражения и далее в течение 7 сут после заражения ВОО. Доза препаратов была выбрана с учетом увеличения отношения площади поверхности к массе тела у мыши массой 9 г по сравнению с мышью массой 12 г [15] и опубликованных данных об эффективных дозах ST-246 в отношении ВОО, находящихся в диапазоне от 3 до 100 мкг/г массы обезьяны циномол-гус [16, 17]. Через 7 сут после заражения ВОО во всех группах мышей определяли долю инфицированных животных по наличию ВОО в легких и титры ВОО в легких. Затем на основании полученных результатов подсчитывали коэффициент защиты (КЗ равно % инфицированных в контроле - % инфицированных в опыте) и индекс подавления продукции вируса (ИПВ равно титр ВОО в контроле - титр ВОО в опыте, lg). Определение титров ВЭ и ВОО в гомогенатах легких. Концентрацию ВЭ и ВОО в полученных от инфицированных мышей гомогенатах легких определяли стандартным для ортопоксвирусов методом подсчета количества бляшек при внесении в монослой культуры клеток Vero разведений образцов [10]. В случаях, когда ВОО в гомогенатах легких инфицированных мышей не выявлялся, т. е. был ниже порога чувствительности метода титрования, использовали минимальное значение титра, которое можно было определить при данном методе (1,1 lg БОЕ/мл). Статистическая обработка. Статистическую обработку и сравнение результатов осуществляли стандартными методами [18] с помощью пакета компьютерных программ Statistica 6,0 («StatSoft Inc.», 19842001) [19]. Сравнение доли выживших или инфицированных животных в группах проводили по критерию X2. Нормальность распределения титров вируса в легких и СПЖ мышей проверяли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова для вероятности ошибки р > 0,10. Титры ВЭ в легких представлены как среднее значение ± ошибка среднего (M ± m). Их сравнение проводили с использованием /-критерия Стьюдента [18]. СПЖ мышей и титры ВОО в легких представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (M ± SM). Для сравнения этих показателей в опыте и контроле применяли непараметрический ^-критерий Манна-Уитни [18]. Результаты и обсуждение Проведенные исследования показали, что при заражении мышей 10 ЛД50 ВЭ (штамм К-1) количество выживших животных достоверно превышало контрольный уровень только при введении препа 41 Таблица 1 Противовирусная активность препаратов НИОХ-3, НИОХ-4, НИОХ-14, НИОХ-32 и ST-246 в отношении ВЭ in vivo Группа мышей, получав- Показатели выживаемости и титры вируса в легких мышей массой 12-14 г, зараженных 10 ЛД50 ВЭ ших препараты в дозе 50 мкг/г количество выживших мышей количество погибших мышей КЗ, % СПЖ, сут (M ± SJ титры ВЭ в легких, lg БОЕ/мл (M ± m) НИОХ-3 (n = 19) 1 (5,3) 18 (94,7) -5,2 9,50 ± 2,87 5,75 ± 0,18 НИОХ-4 (n = 18) 2 (11,1) 16 (88,9) 0,6 11,33 ± 3,98 4,17 ± 0,45* НИОХ-14 (n = 18) 16** (88,9) 2** (11,1) 78,4 20,22 ± 2,26*** 5,00 ± 0,36* НИОХ-32 (n = 17) 2 (11,8) 15 (88,2) 1,23 10,06 ± 4,32 5,87 ± 0,29 ST-246 (n = 19) 18** (94,7) 1** (5,3) 84,2 20,84 ± 0,69*** 4,68 ± 0,22* Контроль ВЭ (n = 19) 2 (10,5) 17 (89,5) - 10,67 ± 4,1 6,15 ± 0,10 Примечание. * - отличие от контроля по /-критерию Стьюдента при р < 0,05; ** - отличие от контроля по критерию х2 при р < 0,00001; *** - отличие от контроля по ^-критерию Манна-Уитни прир < 0,00001; коэффициент защиты (КЗ) = % павших в контроле - % павших в опыте; СПЖ рассчитывали, принимая за максимальный срок жизни выживших животных 21 сут; титры ВЭ в легких определяли через 6 сут после инфицирования; n - число животных, М - среднее, m - ошибка среднего, SM- стандартное отклонение, здесь и в табл. 2 в скобках процент ратов НИОХ-14 и ST-246 в дозе 50 мкг/г (табл. 1). В этих же группах мышей СПЖ тоже была выше, чем в контроле (см. табл. 1), причем по показателям КЗ и СПЖ инфицированных мышей НИОХ-14 проявил такую же эффективность, как ST-246, тогда как препараты НИОХ-3 и НИОХ-4 не оказывали влияние на выживаемость мышей, зараженных ВЭ (см. табл. 1). В данной работе приведены результаты, полученные при введении мышам, инфицированным ВЭ, препаратов в дозе 50 мкг/г, поскольку пероральное введение НИОХ-14 и ST-246 в дозах 25 и 12,5 мкг/г было менее эффективным в отношении исследуемых показателей (результаты не представлены). Было обнаружено, что под влиянием НИОХ-14 и ST-246 титры вируса в легких через 6 сут после инфицирования мышей ВЭ достоверно снижались относительно контрольного уровня (см. табл. 1). Вместе с тем в группе мышей, получавших НИОХ-4, продукция ВЭ была также ниже контрольного уровня (см. табл. 1). По-видимому, ингибирование наработки ВЭ в легких не является единственным и достаточным условием проявления защитного эффекта препаратов in vivo. Так, в отличие от НИОХ-14 и ST-246 введение НИОХ-4, НиОХ-3 и НИОХ-32 не препятствует размножению ВЭ в носовой полости, трахее, головном мозге, селезенке, поджелудочной железе, печени и почках (результаты не представлены). Есть данные, свидетельствующие о том, что ST-246 в дозе 100 мг/кг при заражении мышей вирусом вакцины (штамм WR) ингибирует его диссеминацию и размножение в легких, печени, селезенке и головном мозге [14]. Далее в экспериментах при заражении мышей 10 ИД50 ВОО (штамм V79-1-005) оценивали противовирусное действие препаратов НИОХ-14 и ST-246, а также НИОХ-32 как препарата сравнения, не давшего эффекта in vivo в отношении ВЭ. В табл. 2 приведены данные, полученные при заражении мышей ВОО и введении препаратов в дозе 60 мкг/г, поскольку НИОХ-14 и ST-246 в дозе 30 мкг/г не влияли на инфекционность ВОО (результаты не представлены). Достоверные различия в проценте не инфицированных ВОО животных и титрах ВОО в легких через 7 сут после заражения наблюдались только в группах, получавших препараты НИОХ-14 и ST-246. При этом противовирусное действие НИОХ-14 и ST-246 было практически одинаковым, а НИОХ-32 оказался неэффективным в отношении ВОО в экспериментах in vivo (см. табл. 2). Таким образом, проведенные исследования показали, что химическое соединение НИОХ-14 обладает высокой противовирусной эффективностью в отношении ВЭ и ВОО in vivo. Более того, проти-вооспенная эффективность НИОХ-14 сопоставима с противооспенной эффективностью ST-246 по всем исследованным показателям. Это позволяет сделать заключение о перспективности дальнейшего исследования химического соединения НИОХ-14 с целью разработки на его основе нового отечественного противооспенного препарата. По-видимому, соеди Таблица 2 Противовирусная активность препаратов НИОХ-14, НИОХ-32 и ST-246 в отношении ВОО in vivo Группа мышей, получавших препараты в дозе 60 мкг/г Показатели инфицируемости и титры вируса в легких мышей массой 9-11 г, зараженных 10 ИД50 ВОО количество неинфицированных мышей количество инфицированных мышей КЗ, % титры ВОО в легких, lg БОЕ/мл (M ± SM) НИОХ-14 (n = 6) 6* (100,0) 0* (0,0) 100,0 1,10 ± 0,00** НИОХ-32 (n = 6) 0 (0,0) 6 (100,0) 0,0 3,86 ± 0,69 ST-246 (n = 6) 5*** (83,3) 1*** (16,7) 83,3 1,32 ± 0,53** Контроль ВОО (n = 12) 0 (0,0) 12 (100,0) - 4,28 ±0,09 Примечание. * - отличие от контроля по критерию х2 при р < 0,00001; ** - отличие от контроля по ^-критерию Манна-Уитни при р = 0,00075; *** - отличие от контроля по критерию х2 при р = 0,0002; коэффициент защиты (КЗ) = % инфицированных в контроле - % инфицированных в опыте; титры ВОО в легких определяли через 7 сут после инфицирования; n - число животных, М - среднее, SM - стандартное отклонение. 42 нение НИОХ-14 имеет такой же механизм противовирусного действия в отношении ортопоксвирусов, что и препарат ST-246, аналогом которого он является [12]. ST-246®, или Tecovirimat™ разработан компанией «SIGA Technologies Inc.» по лицензии «ViroPharma Inc.» (Корваллис, штат Орегон, США) [7]. Полагают, что ST-246 является ингибитором оболочечного белка р37 ортопоксвирусов и подавляет выход вирионов на поверхность инфицированной клетки за счет воздействия на ортологи белка р37 ортопоксвирусов [5, 8, 20].

References

Supplementary files