Herpes virus infection of human gametes and male sterility: from experimental models to development of clinical recommendations

Full Text

Лаборатория клеточной инженерии была создана по инициативе В.М. Жданова в 1986 г.. Перед лабораторией были поставлены задачи: разработка гибридомной технологии получения моноклональных антител (МКА) к вирусным антигенам; использование МКА для изучения фундаментальных проблем вирусологии и вопросов практического здравоохранения. В настоящее время, коллекция гибридом, полученных в лаборатории клеточной инженерии, насчитывает более 50 клонов, продуцирующих МКА, взаимодействующие с белками вирусов -возбудителей наиболее распространенных и социально значимых заболеваний: гепатитов В и С, герпеса, цитомегаловирусной инфекции, иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекции), клещевого энцефалита, гриппа птиц, гриппа человека. На основе МКА разработан ряд диагностикумов и тест-систем, приоритетный характер которых подтвержден 9 авторскими свидетельствами на изобретения и 4 патентами Российской Федерации. С помощью МКА изучена тонкая антигенная структура и топология антигенных детерминант вирусов, выявлены неизвестные ранее эпитопы, индуцирующие образование вируснейтрализующих антител и обладающие протективными свойствами. Полученные МКА используются для решения актуальных проблем медицинской науки и здравоохранения: создания ДНК-вакцин; разработки алгоритма диагностики и лечения герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных и часто болеющих детей. В настоящее время проводится комплексное изучение роли герпесвирусов в развитии мужского бесплодия и в нарушениях беременности. Данному направлению исследований лаборатории посвящена представленная статья. Актуальность проблемы. Серологические исследования свидетельствуют о чрезвычайно широком распространении герпесвирусов в человеческой популяции. В некоторых регионах земного шара антитела к вирусам простого герпеса (ВИГ) 1-го и 2-го типов и цитомегаловирусу (ЦМВ) выявляют у большинства лиц репродуктивного возраста [1, 2]. Показано, что герпесвирусы пантропны и способны поражать практически все органы и системы человека, вызывая заболевания различной степени тяжести [3, 4]. В то же время, роль герпесвирусных инфекций в развитии мужского бесплодия изучена недостаточно. Наименее исследованы молекулярные и клеточные механизмы взаимодействия герпесвирусов с мужскими гаметами - клетками, обладающими уникальными особенностями. Формирование сперматозоидов происходит в ходе сперматогенеза из сперматогониев через стадии сперматоцитов и сперматид. В результате зрелые гаметы представляют собой клетки с минимальным объёмом цитоплазмы, гиперспирализованнным хроматином и сниженной биосинтетической активностью. В то же время, для успешной репликации вируса требуются активно функционирующие клеточные системы синтеза биомолекул. В связи с этим, 134 остаётся открытым вопрос о том, могут ли герпесвирусы находиться внутри зрелой половой клетки, и если да - то каково состояние их генома. Не раскрыты также механизмы передачи герпесвирусов через сперму. Для инфицирования эпителиальных клеток генитального тракта женщины вирусу необходимо преодолеть мукозный барьер. Так как сперматозоиды способны к активному движению, можно предположить, что половая передача герпесвирусов осуществляется подвижными гаметами, которые выполняют функцию вектора для доставки к чувствительным клеткам [5]. Проверка данной гипотезы требует детального исследования взаимодействия герпесвирусов со сперматозоидами. Взаимодействие ВПГ и ЦМВ со зрелыми половыми клетками. Изучение клеточной фракции эякулята показало присутствие ДНК герпесвирусов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) [6, 7]. Быстрым культуральным методом в эякуляте обнаружена инфекционная активность ВПГ и ЦМВ [7]. Представленные данные убедительно свидетельствуют о контакте вируса со сперматозоидом, однако не являются строгим доказательством внутриклеточной локализации. Для получения новых данных были использованы подходы, позволяющие локализовать вирусные маркеры in situ. Так, методом непрямой иммунофлуоресценции в препаратах сперматозоидов были обнаружены антигены ВПГ [8], а методами ПЦР in situ [9, 10] и ДНК-гибридизации in situ [11] - ДНК герпесвирусов. Детальное изучения взаимодействия герпесвирусов со сперматозоидами проводили в экспериментах in vitro. Сперматозоиды человека инкубировали с ВПГ или ЦМВ в предварительно подобранных условиях, затем проводили иммуноцитохимическую реакцию с помощью вирусспецифических МКА. В полученных цитологических препаратах изучали локализацию вирусных белков методом сканирующей конфокальной микроскопии. Оказалось, что от 0,1 % до 2 % клеток были окрашены МКА, что согласуется с ранее полученными данными о доле пораженных клеток в естественно инфицированном эякуляте [9, 10]. Белки ВПГ и ЦМВ наблюдали в определенных локусах: чаще всего окрашенными оказывались головки и шейки сперматозоидов, реже - средняя часть и хвост; наблюдали также различное сочетание указанных сайтов окраски (рис. 1). В некоторых клетках окраску выявляли преимущественно в периакросомальной, экваториальной и субакросомальной зонах. Сохранение окраски после прохождения гамет через градиент и серии отмывок указывает на прочное прикрепление вируса к мембране сперматозоида. Более того, наличие дискретных локусов локализации вирусных белков позволяет предположить специфическое взаимодействие вируса с клеточными рецепторами. Наличие определенных сайтов прикрепления герпесвирусов к мембране сперматозоида, возможно, объясняется неравномерным распределением рецепторов, посредством которых 135 происходит связывание патогена с клеткой. Такое предположение позволяют сделать данные, полученные при изучении сперматозоидов, зараженных вирусом папилломы человека. Локализация данного вируса в экваториальной зоне головки сперматозоида совпадает с расположением рецепторов (синдекан-1), с которыми специфически связывается вирусный капсидный белок L1 [12]. Герпесвирусы используют ряд рецепторов для проникновения в чувствительные клетки [3, 4]. Однако взаимодействие ВПГ и ЦМВ с рецепторным аппаратом сперматозоида не изучено, что диктует необходимость проведения соответствующих исследований. Рисунок 1. Локализация ВПГ в сперматозоидах методом конфокальной микроскопии. Представлены серийные оптические срезы с шагом 0,5 мкм. Через 1 ч после заражения in vitro белки ВПГ (зелёный сигнал) выявляли в экваториальной области головки сперматозоидов (А-Е) и в области шейки сперматозоидов (Ж-М); ядра клеток окрашены пропидия иодидом (красный сигнал). Шкала 5 мкм. А Б В Г Д Е Ж 3 И к л м І і Неоднородный характер связывания герпесвирусов со сперматозоидами (разные локусы связывания или их отсутствие) может объясняться также разной степенью зрелости половых клеток. Не исключено, что на распределение мембранных белков сперматозоидов влияет преждевременная капацитация или акросомальная реакция в экспериментальных условиях. Так, показано, что индукция акросомальной реакции предотвращает связывание сперматозоида с герпесвирусом 6-го типа [13]. Влияние ВПГ и ЦМВ на сперматогенез. Герпесвирусы способны реплицироваться в эпителиальных клетках урогенитального тракта и добавочных железах, что создает условия для контакта зрелых гамет с вирусом в сперме. Незрелые половые клетки находятся в яичках, которые представляют собой иммунопривилегированный орган. Интактный гематотестикулярный барьер (ГТБ), согласно существующим представлениям, обеспечивает 136 защиту гамет от патогенов, циркулирующих в крови, в частности от ВПГ [14]. Вместе с тем проникновение вируса в мужские гонады может происходить до формирования защитного барьера (в препубертатном периоде), а также в обход ГТБ (восходящая инфекция урогенитального тракта). Нами предложено несколько экспериментальных моделей, позволяющих проверить указанные гипотезы и изучить влияние вируса на незрелые половые клетки, находящиеся на разных стадиях дифференцировки. Одна из них состояла в получении тестикулярной инфекции после внутрибрюшинного заражения препубертатных мышей. ВПГ проникал гематогенным путём в незащищенный барьером семенник. Накопление вирусных маркеров происходило в течение первой недели инфекции, после чего вирусная нагрузка постепенно снижалась. Несмотря на сравнительно быструю элиминацию вируса, в течение месяца после заражения в инфицированных органах наблюдали повышенный уровень апоптоза и снижение пролиферативной активности незрелых половых клеток [15]. Другая модель воспроизводила восходящую инфекцию урогенитального тракта. Для этого семенники мыши заражали через rete testis, что позволило изучить влияние ВПГ на сперматогенез половозрелых животных. Маркеры ВПГ были выявлены и в половых (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды), и в соматических (Сертоли, перициты) клетках семенника мыши (рис. 2). Как и в случае препубертатных животных, для тестикулярной инфекции было характерно острое течение (пик вирусной нагрузки на 6-й день инфекции) и ещё более выраженные деструктивные изменения: блок сперматогенеза, дезорганизация и атрофия сперматогенного эпителия, орхит, фиброз семенных канальцев и как результат -отсутствие сперматозоидов в эпидидимисе с 21-го дня инфекции. Гибель клеток Сертоли, необходимых для регенерации герминативной ткани, указывает на необратимость дегенеративных изменений в инфицированных семенниках. Для восстановления сперматогенеза, поврежденного в ходе ВПГ инфекции, использовали специфическую противовирусную терапию в сочетании с клеточными технологиями. На фоне перорального курса ацикловира в семенники мышей на 21-й день инфекции инъецировали суспензии клеток семенников неонатальных трансгенных мышей, экспрессирующих репортерный ген LacZ. Уже через 1 месяц после трансплантации клетки Сертоли мышей-доноров, идентифицируемые по гистохимической окраске на продукт гена LacZ, формировали новые семенные канальцы в семенниках мышей-реципиентов (рис. 3.А). Через 5 мес. в большей части новых канальцев клетки Сертоли поддерживали развитие половых клеток донора. Дифференцировка половых клеток доходила до стадии удлиняющихся сперматид (рис. 3.Б), которые могут быть использованы при лечении бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий. 137 Учитывая невосприимчивость лабораторных животных к ЦМВ человека, оценку влияния этого вируса на сперматогенез проводили с использованием ещё одной модельной системы - органной культуры яичка человека [16]. Заражение органной культуры ЦМВ показало, что вирус оказывает цитотоксический эффект на незрелые половые клетки, но не на сперматозоиды. Кроме того, было установлено, что наиболее часто вирус обнаруживался в наименее зрелых клетках [10, 16]. Это указывает на существование обратной зависимости между чувствительностью половых клеток к инфицированию и степенью их дифференцировки. Аналогичная закономерность была обнаружена и в органной культуре мужских гонад, инфицированной ВПГ [16, 17]. Рисунок 2. Локализация ВПГ в семенных канальцах методом конфокальной микроскопии. Белки ВПГ (зелёный сигнал) обнаружены в клетках Сертоли и незрелых половых клетках в семеннике мыши на 6-й день после заражения через rete testis; ядра клеток окрашены пропидия иодидом (красный сигнал). Шкала 50 мкм. Рисунок 3. Результаты трансплантации неонатальных тестикулярных клеток в семенники мышей, поврежденные ВПГ. Представлены новые семенные канальцы, образованные клетками доноров (А), и удлиняющиеся сперматиды (УС) в них (Б). Гистохимическая окраска на продукт гена LacZ (синий); ядра клеток окрашены нейтральным красным. Шкала 100 мкм 138 для (А), 10 мкм для (Б). Использованные экспериментальные модели позволили впервые установить факт инфицирования ВПГ и ЦМВ незрелых половых клеток. Герпесвирусы способны вызывать острую литическую инфекцию сперматогенных клеток на ранних стадиях инфекции как in vitro, так и in vivo. В то же время выраженный гаметотоксический эффект наблюдается и на поздних сроках, когда активность инфекционного процесса резко снижается. Это означает, что герпесвирусы могут оказывать не только прямое, но и опосредованное повреждающее действие. Патогенетические механизмы, лежащие в основе непрямого воздействия, пока не изучены, однако можно высказать некоторые предположения. Во-первых, ранее нами было показано, что ВПГ способен вызывать нарушение пролиферации и дифференцировки сперматогониев и сперматоцитов [18]. Во-вторых, деструктивные изменения в семенных канальцах могут быть вызваны сокращением популяции чувствительных к вирусу клеток Сертоли, обеспечивающих питание половых клеток и архитектонику канальца. В-третьих, воспалительная инфильтрация семенника при ВПГ-инфекции приводит к повышению проницаемости ГТБ, потере толерантности иммунокомпетентных клеток к мужским гаметам и -как следствие - фагоцитозу половых клеток. Кроме того, токсическое действие на мужские гаметы могут оказывать провоспалительные цитокины (интерлейкины-1а и -6, интерфероны, фактор некроза опухоли альфа), индуцируемые вирусной инфекцией семенника. Результаты экспериментальных исследований демонстрируют принципиальную возможность инфицирования незрелых половых клеток, указывают на потенциальные пути проникновения вируса в мужские гонады и позволяют предположить негативные последствия герпесвирусной инфекции для репродуктивного здоровья. Клинические аспекты проблемы взаимодействия ВПГ и ЦМВ с мужскими гаметами. Одним из последствий вирусного заражения гамет является передача инфекции со сперматозоидом. Особенную актуальность данная проблема приобрела с внедрением вспомогательных репродуктивных технологий. Существующие протоколы оплодотворения донорской спермой включают отмывку сперматозоидов. Однако, как правило, отмывки не позволяют получить свободные от вируса гаметы: сперматозоиды остаются зараженными ЦМВ в 89% образцов, ВПГ - в 59 % образцов [19]. Решением данной проблемы может быть обследование каждого образца донорской спермы на присутствие герпесвирусов. Другой вариант предотвращения передачи вирусов со спермой заключается в усовершенствовании методов очистки гамет от патогенов [20, 21]. Кроме того, идентификация рецепторов сперматозоида и их вирусных лигандов позволит специфически воздействовать на адсорбцию и элиминацию патогена. 139 В настоящее время нет прямых доказательств вертикальной передачи ВПГ и ЦМВ со сперматозоидом. Учитывая невысокую долю пораженных гамет в инфицированном эякуляте [9, 10], данный путь трансмиссии, если и возможен, представляется довольно редким событием. В то же время следует отметить, что первичное инфицирование женщины ВПГ или ЦМВ во время беременности может быть причиной невынашивания или аномалий развития плода [22, 23]. Таким образом, независимо от того, возможна или нет вертикальная передача, присутствие герпесвирусов в сперме представляет угрозу для исхода беременности и здоровья ребенка. Действительно, было показано, что невынашивание беременности коррелирует с выявлением ВПГ в эякуляте партнера [6]. Кроме того было установлено, что присутствие ВПГ в клеточной фракции эякулята негативно влияет на результаты экстракорпорального оплодотворения, значительно снижая частоту формирования бластоцист, имплантации эмбрионов и наступления беременности [24]. Важным последствием герпесвирусной инфекции эякулятов является бесплодие. Недавно разработанная в лаборатории экспериментальная модель герпесвирусной инфекции семенника мыши впервые позволила получить прямое доказательство негативного влияния ВПГ на фертильность [15]. Новорожденных мышей заражали ВПГ внутрибрюшинно, что позволило вирусу проникнуть в семенники до формирования ГТБ. После достижения инфицированными животными половозрелого возраста проводили их спаривание с неинфицированными самками. Количество родившихся мышат от инфицированных самцов было в 7 раз меньше, чем от неинфицированных животных. Доля фертильных самцов в опытной группе составила 12,5 %, что оказалось значительно ниже, чем в контрольной группе (87,5 %, p < 0.05). Результаты описанного эксперимента хорошо согласуются и дополняют ранее опубликованные нами данные о высокой частоте обнаружения герпесвирусов в эякуляте пациентов с бесплодием и о связи герпесвирусной инфекции с нарушением фертильности [25]. Учитывая полученные результаты, можно рекомендовать исследование эякулята мужчин на наличие ВПГ в случае бесплодия неясной этиологии. При обнаружении вируса может быть целесообразным проведение противовирусного лечения. Об этом свидетельствуют данные о наступлении беременности у ранее бесплодных пар после прохождения партнером курса специфической терапии [26, 27]. Вопрос о целесообразности обследования пациентов, состоящих в бесплодном браке, на другие вирусы, в частности ЦМВ, остается открытым. На сегодняшний день в качестве возможных этиологических агентов мужского бесплодия рассматривают широкий круг 140 патогенов как вирусной (ВИЧ, вирусы гепатита Ви С, папилломы человека, герпесвирусы 1-8 типов), так и бактериальной природы (хламидии, микоплазмы, уреаплазмы) [28, 29]. Существенным недостатком большинства популяционных исследований является изучение узкого круга инфекционных агентов, в результате чего истинный вклад отдельного патогена может быть искажен за счет отсутствия данных о других вирусах и бактериях. Другая сложность в оценке роли герпесвирусов в развитии бесплодия заключается в том, что в проводимых исследованиях значительно отличаются пороги чувствительности используемых методов. Решить эту проблему позволит разработка диагностических критериев на основе количественных методов определения вирусной нагрузки. Важнейшей задачей в этом направлении является проведение масштабных исследований для обоснования клинически значимых концентраций вирусов в сперме. Экспериментальные данные, полученные в лаборатории, показывают, что появились перспективы лечения мужского бесплодия герпесвирусной этиологии. Для этого в настоящее время развиваются новые подходы, основанные на сочетании противовирусной терапии и современных клеточных технологий. Заключение. Данные, полученные при исследовании эякулята пациентов и при использовании разработанных экспериментальных моделей, указывают на: 1) проникновение герпесвирусов в незрелые половые клетки и нарушение сперматогенеза; 2) ассоциацию ВПГ и ЦМВ со зрелыми гаметами; 3) корреляцию между выявлением ВПГ в эякуляте и бесплодием в браке; 4) нарушение ранних стадий эмбрионального развития при экстракорпоральном оплодотворении инфицированными ВПГ сперматозоидами; 5) связь невынашивания беременности с герпесвирусной инфекцией эякулята партнера; 6) принципиальную возможность лечения бесплодия герпесвирусной этиологии с помощью трансплантации клеток семенников неонатальных животных. На основании полученных результатов можно сделать следующие рекомендации: 1. обследование доноров спермы и мужчин, состоящих в бесплодном браке, на наличие герпесвирусов в эякуляте; 2. количественное выявление маркеров герпесвирусов в образцах спермы для установления уровня вирусной нагрузки, клинически значимой для нарушения фертильности и горизонтальной передачи патогена; 3. разработка схем и методов противовирусной терапии бесплодия и мониторинг лечения пациентов, выделяющих герпесвирусы с эякулятом; 4. развитие клеточных технологий лечения мужского бесплодия. 141 Решение теоретических вопросов, поставленных в настоящей работе, а также внедрение сделанных рекомендаций в практическое здравоохранение будет способствовать улучшению демографической ситуации в стране. Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (проект № 12-04-32258мол_а). Конфокальная микроскопия выполнена в центре коллективного пользования по биологии развития на основе использования клеточных технологий и оптических методов исследования на базе ИБР РАН.

References

Supplementary files