Local Antibody Immune Responses in Influenza Patients and Persons Vaccinated with Seasonal, Pre-pandemic, and Pandemic Live Attenuated Influenza Vaccines

Full Text

Локальный (местный, мукозальный) иммунитет является важнейшим звеном иммунной защиты населения от острых вирусных инфекций. На сегодняшний день этот вид иммунитета у людей в наибольшей степени изучен в отношении гриппозной инфекции и противогриппозной иммунизации. Разработана и широко апробирована отечественная иммунофермент-ная тест-система для количественного выявления локальных антител в секретах верхних дыхательных путей (СВДП) и слюне [7, 8]. Определены защитные титры IgA-антител в этих субстратах [7]. Охарактеризована взаимосвязь между локальным и системным гуморальным иммунном ответом [17]. Изучена способность живых гриппозных вакцин (ЖГВ) индуцировать локальный иммунный ответ в сравнении с инактивированными (ИГВ) вакцинами, вводимыми парентерально, интраназально и перорально [8]. Показаны возрастные различия в формировании по-ствакцинального локального иммунного ответа на ЖГВ [1, 2, 9]. Созданы количественные методики определения авидности локальных антител к вирусам гриппа А и В [3]. На основе этой методики проведено исследование данного показателя у вакцинированных лиц [18]. Кроме того, разработана экспериментальная модель, дающая возможность изучать клеточный локальный противогриппозный иммунитет в назоассо-циированной лимфоидной ткани грызунов [ 10, 12]. Подавляющее большинство перечисленных выше данных о формировании локального иммунитета было получено на материалах обследования людей до 2000 г. С тех пор эпидемиологическая обстановка по гриппу, а также штаммовый состав сезонных ЖГВ изменились. Появились новые пандемические и потенциально пандемические вакцины. В настоящей статье приведены сведения о формировании в 2000-2009 гг. локального и гуморального иммунного ответа у людей, перенесших грипп А, а также у лиц, привитых разными сезонными, пандемической А/ Калифорния/07/2009 - A(Н1N1)pdm2009 и потенциально пандемической A(Н5N2) ЖГВ. Материалы и методы Вакцины. Для иммунизации использовали отечественные тривалентные ЖГВ (НПО «Микроген», Россия). В состав сезонных ЖГВ (препарат «Ультра-вак») входили следующие вакцинные штаммы: А/17/ Пекин/95/25 (Н1Ш), А/17/Новая Каледония/99/145 (Н1Ш), А/17/Соломоновы острова/06/09 (НШ1), А/ 17/Брисбен/07/28 (Н1Ш), А/17/Сидней/97/76 (Н3Ш), А/17/Панама/99/242 (Н3Ш), А/17/Вайоминг/03/8 (Н3Ш), А/17/Калифорния/04/6 (Н3Ш), А/17/Брисбен/07/1 (Н3Ш), В/60/Санкт-Петербург/95/20, В/60/ Гонконг/01/22, В/60/Джилин/03/1, В/60/Флорида/04/ 181, В/60/Брисбен/08/83. Также были использованы моновалентные ЖГВ того же производителя: «Инфлювир» -пандемическая вакцина А/17/Калифорния/2009/38 (НШ1) и «Ультрагривак» - А/17/утка/ Потсдам/86/92 (Н5№). ЖГВ вводили интраназально по 0,5 мл (0,25 мл в каждую ноздрю), однократно (сезонные ЖГВ) и двукратно (моновакцины). Контингенты. Для проведения исследований были отобраны здоровые волонтеры в возрасте старше 18 лет, принимавшие участие в испытаниях ЖГВ в 20002009 гг. В течение 5 дней после вакцинации за всеми лицами проводились клинические наблюдения, которые включали измерение температуры тела, пульса и артериального давления, аускультацию сердца и легких, осмотр носоглотки. Побочные клинические реакции на вакцинацию не выявлены. Образцы сывороток крови и СВДП брали у каждого вакцинированного до и через 21 день после иммунизации. Все испытания вакцин проводились с разрешения комиссии по гриппозным вакцинам и диагностическим штаммам при Минздраве России с обязательной подписью относительно информированного согласия участников. Больные гриппом А(Н3№) лица (18 человек) в возрасте 18-21 года являлись членами наблюдавшегося воинского коллектива. Они перенесли во время вспышки в 2007-2008 гг. неосложненный клинически выраженный и серологически подтвержденный грипп А(Н3№). Парные образцы сывороток крови и СВДП хранились при -70°С. Лабораторные исследования. Титры сывороточных антител определяли в реакции торможения гемагглю-тинации (РТГА), которую выполняли по общепринятой методике с использованием 4 АЕ антигенов и 1% взвеси эритроцитов человека группы крови 0(I) [6]. Локальные IgA-антитела и иммуноглобулины разных классов и подклассов в сыворотках крови и СВДП определяли по ранее описанной методике иммунофермент-ного анализа (ИФА) [8]. На полистироловые микропанели («Медполимер», Россия) сорбировали 16 АЕ/мл 38 Таблица 1 Системный и локальный гуморальный иммунный ответ у лиц, больных гриппом A(H3N2) и привитых сезонной ЖГВ Группа Образцы Количество (%) конверсий антител в ИФА к вирусу гриппа А(Н3М2) IgA IgM IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgE Больные гриппом СВДП 13 (72,2) 0 4 (22,2) 0 0 0 0 А(Н3Ш) (n = 18) Сыворотка крови 9 (50,0) 0 8 (44,4) 2 (11,1) 1 (5,5) 5 (27,7) 0 Привитые сезонной СВДП 8 (44,4) 0 1 (5,5) 0 0 0 0 ЖГВ (n = 18) Сыворотка крови 4 (22,2) 2 (11,1) 5 (27,7) 2 (11,1) 1 (5,5) 2 (11,1) 0 используемых антигенов вирусов гриппа. Исследуемые образцы СВДП титровали с разведения 1:8 до 1:512. Конъюгатом служили моноклональные антитела против IgA, IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgE человека, меченные пероксидазой хрена (ООО “Полигност”, Россия). Достоверным приростом титров антител в РТГА и ИФА считали их увеличение в 4 раза и более во 2-м образце по отношению к 1-му. За титр локальных IgA-антител в ИФА принимали последнее разведение секретов, оптическая плотность которых в 2 раза и более превышала оптическую плотность контроля, включающего все ингредиенты реакции, кроме исследуемых секретов. Методика определения авидности локальных IgA-антитела в СВДП подробно изложена в нашей статье [3]. В РТГА и ИФА использовали антигены, аналогичные составу вакцин. Статистический анализ результатов проводили с использованием критериев Вилкоксона и ί-теста. Достоверными считали результаты при p < 0,05. Результаты В табл. 1 приведены сравнительные данные о системном и локальном гуморальном иммунном ответе (конверсии разных изотипов иммуноглобулинов) у взрослых людей, переболевших гриппом A(H3N2), и у лиц, привитых в 2007 г. сезонной тривалентной ЖГВ. По сравнению с вакцинацией гриппозная инфекция индуцировала большее число конверсий как сывороточных (IgG1 -соответственно 44 и 27%, IgA - соответственно 50 и 22%; p < 0,05), так и локальных (IgA - соответственно 72 и 44%, IgG1 - соответственно 22 и 5%; p < 0,05) антител. У тех и других локальный иммунный ответ ограничивался приростами IgA-антител и в гораздо меньшей степени - IgG1-антител (соответственно 72 и 22%; p < 0,05 и p < 0,01), тогда как системный иммунный ответ сопровождался увеличением уровня антител всех изотипов, за исключением IgE. Т абл. 2 содержит сведения об обнаружении у невакци-нированных молодых людей локальных IgA-антител к трем вирусам гриппам А: циркулировавшему штамму A(H1N1), вирусу A(H1N1)pdm2009 и птичьему вирусу A(H5N2). Обращает на себя внимание то обстоятельство, что IgA-антитела к пандемическому вирусу A(H1N1)pdm2009 в высоких титрах (> 1:64) выявлялись у значительного числа лиц (56%) еще до начала его эпидемического распространения в России. Аналогичный, но менее выраженный феномен наблюдался и в отношении IgA-антител к птичьему вирусу A(H5N2) - 19% лиц с высокими титрами IgA-антител (p < 0,01). Тот же показатель, касающийся IgA-антител к допандемическому активно циркулировавшему вирусу A(H1N1), был самым высоким -89% (p < 0,05 и p < 0,01). В табл. 3 представлены объединенные данные о частоте конверсий локальных IgA-антител к вакцинным вирусам гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В у лиц в возрасте 18-55 лет, прививавшихся в 2000-2009 гг. разными сезонными ЖГВ. Общее число конверсий этих антител было невелико - от 20 до 26%. Однако если рассматривать данный показатель иммуногенности в зависимости от исходного титра IgA-антител перед вакцинацией, то среди лиц с низкими титрами < 1:8 он был значительно выше (42-45%;p < 0,05), а у лиц с высокими исходными титрами > 1:64 - существенно ниже (2- 7%; p < 0,01). Следует особо отметить хорошо выраженные различия в доле (в %) лиц с высокими исходными титрами IgA-антител > 1:64 внутри двух групп вакцинированных: у которых присутствовала поствакцинальная конверсия IgA-антител (2-9%), и у привитых, у которых по-ствакцинальный титр не изменился, т. е. конверсия IgA-антител на прививку отсутствовала (27-33%;p < 0,05). Сведения в табл. 4 дают представление о количестве конверсий локальных IgA-антител у лиц того же возраста, прививавшихся двукратно моновалентными ЖГВ A(H1N1)pdm2009 и A(H5N2). После второй прививки доля лиц с конверсиями IgA-антител к вирусам A(H1N1)pdm2009 составила 54%, а к птичьему вирусу A(H5N2) - в 2 раза меньше, т. е. 27% (p < 0,05). В обоих случаях вторая вакцинация увеличивала эти показатели иммуногенности. При этом число конверсий сывороточных антител к первому и второму вирусам было значительно ниже по сравнению с приростами локальных антител (соответственно 21 и 13%; p < 0,05). Табл. 5 содержит данные об изменении авидности локальных IgA-антител у лиц в возрасте 18-21 года, Таблица 2 Обнаружение локальных IgA-антител к трем вирусам гриппа A у непривитых людей в возрасте 18-21 года Число Титры антител в СВДП Средние Вирусы геометриче лиц < 1:16 1:32 > 1:64 ские титры антител А/Брисбен/2007 (H1N1)* 47 1 (2,1%) 4 (8,5%) 42 (89,4%) 131,8 A(H1N1)pdm 2009** 59 15 (25,4%) 11 (18,6%) 33 (55,9%) 90,4 А/утка/Потсдам/1986(Н5Ш)*** 74 52 (70,3%) 8 (10,8%) 14 (18,9%) 11,3 П р и м е ч а н и е . * - СВДП отобраны в октябре 2008 г.; ** - СВДП отобраны в октябре 2009 г., т. е. до развития эпидемии в России; здесь и в табл. 3-5: A(Н1N1)pdm 2009 - современное обозначение штаммов типа А/ Калифорния/2009 (H1N1); *** - СВДП отобраны в 2006-2007 гг. 39 Таблица 3 Индукция сезонными тривалентными ЖГВ локальных IgA-антител у лиц в возрасте 18-55 лет* Вакцинный вирус гриппа Число исследованных индивидуальных парных образцов СВДП Общее число конверсий антител Количество конверсий антител в зависимости от их исходного титра перед прививкой среди всех прививавшихся Количество лиц с высокими исходными титрами антител > 1:64 перед прививкой среди двух групп < 1:8 1:16 1:32 > 1:64 лица с наличием конверсий антител после прививки лица с отсутствием конверсий антител после прививки А(Н1Ш) 388 102 (26,3%) 158** 68 33 129 102** 225 70 (44,5%) 20 (29,4%) 10 (30,3%) 2 (1,6%) 2(2,0%) 75(33,3%) А(Н3Ш) 226 44 (19,5%) 71 45 47 63 44 137 30 (42,2%) 8(17,8%) 5 (10,6%) 1 (1,6%) 1 (2,2%) 37 (27,0%) В 312 76 (24,4%) 119 61 37 95 76 170 52 (43,7%) 11 (18,0%) 6 (16,2%) 7 (7,3%) 7 (9,2%) 50 (29,4%) Примечание. * - объединенные данные о вакцинации в 2000-2009 гг; ** - числитель - число лиц с обозначенными титрами антител, знаменатель - из них доля с конверсиями антител. привитых ЖГВ A(Н1N1)pdm2009, А(Н5№) и сезонными тривалентными ЖГВ (суммарные показатели в 2000-2009 гг.). У 15-50% вакцинированных было зафиксировано достоверное поствакцинальное увеличение индексов авидности IgA-антител, тогда как в группе получивших препарат плацебо такое увеличение обнаружено только у 2 человек из 168 (0,8%; p < 0,05; < 0,01 иp < 0,001). Таким образом, вакцинация всеми ЖГВ, в том числе А(НШ1^ш2009 и А(Н5№), повышала авид-ность локальных IgA-антител. Обсуждение Нами показано, что у людей гриппозная инфекция превосходила вакцинацию ЖГВ в индукции локального гуморального иммунного ответа (см. табл. 1). Аналогичные результаты получены и при воспроиз ведении у мышей гриппозной инфекции и их иммунизации экспериментальным аналогом вакцинного штамма для ЖГВ [13]. Эти результаты совершенно логичны, поскольку инфекция является эталоном качества иммунного ответа, на который должна равняться вакцинология. По-видимому, в этом плане локальный иммунитет не является исключением. Кроме того, необходимо отметить, что ИГВ индуцирует этот тип иммунного ответа крайне слабо и в данном качестве значительно уступает ЖГВ [1, 8, 9]. Если сравнивать широту спектра иммунных ответов по изотипам вирусспецифических иммуноглобулинов (см. табл. 1), то и при инфекции и при вакцинации системный иммунный ответ включал конверсии всех изученных классов и подклассов антител, кроме IgE, а локальный иммунный ответ - только ^А-антител (соответственно 72 и 44%) и в значительно меньшей Таблица 4 Индукция моновалентными ЖГВ A(H1N1)pdm2009 и A(H5N2) локальных и сывороточных антител у добровольцев в возрасте 18-20 лет Препарат Группа Количество (%) конверсий антител локальные IgA-антитела по данным ИФА сывороточные антитела по данным РТГА первая вакцинация вторая вакцинация первая вакцинация вторая вакцинация А(Н1Ш^ш2009 Привитые ЖГВ (n = 24) 6 (25,0) 13 (54,2) 2 (8,3) 5 (20,8%) Получившие плацебо (n = 5) 0 0 0 0 А/утка/Потсдам/ Привитые ЖГВ (n = 15) 2 (13,3) 4 (26,7) 1 (6,7) 2 (13,3%) 1986 (Н5Ш) Получившие плацебо (n = 7) 0 0 0 0 Таблица 5 Авидность локальных IgA-антител у лиц в возрасте 18-21 года, привитых тремя типами ЖГВ ЖГВ Число привитых Группа Количество (%) лиц с достоверным увеличе-ним индексов авидности IgA-антител А(Н1Ш^ш2009 А/утка/Потсдам/1986 (Н5Ш) Сезонные трива- А(НШ1) лентные вакцины 49* Лица с конверсиями антител на вакцину (n = 26) Получившие плацебо (n = 10) 15 Лица с конверсиями антител на вакцину (n = 4) Получившие плацебо (n = 12) 321 Лица с конверсиями антител на вакцину (n = 52) Получившие плацебо (n = 73) 321 Лица с конверсиями антител на вакцину (n = 48) Получившие плацебо (n = 73) 4 (15,4) 0 2 (50,0) 0 17 (32,7) 0 23 (47,9) 2 (2,6) В 40 степени - IgG1 (соответственно 22 и 5%; p < 0,05). Полученные результаты свидетельствуют о том, что в иммунологических исследованиях в ИФА локального иммунитета при естественной (возможно, и экспериментальной) инфекции следует включать конъюгаты не только IgA-, но и IgG1-антител. Нами обнаружены у молодых людей высокие титры локальных IgA-антител к вирусу A(Н1N1)pdm2009 до его эпидемического распространения в России и такие же титры антител к птичьему вирусу A(ffiN2), с которым эти люди не встречались вообще (см. табл. 2). Доля таких лиц в отношении антител к первому вирусу оказалась значительной (56%), а ко второму - в 3 раза меньше (19%; p < 0,05). Примечательно, что у этих же лиц были выявлены примерно в той же пропорции перекрестно реагирующие СD4+ и СD8+ Т-клетки иммунологической памяти, специфичные к данным штаммам [14, 16]. Все это свидетельствует, на наш взгляд, о трех важных фактах. Во-первых, у взрослых людей существует не только гетеротипический Т-клеточный иммунитет к разным штаммовым разновидностям и подтипам вируса гриппа А [11], но и аналогичный локальный иммунитет в виде перекрестно реагирующих локальных IgA-антител, у которых, как известно, спектр взаимодействия с антигенами вирусов гриппа А гораздо шире, чем у сывороточных антител. Во-вторых, эпидемическая циркуляция вируса A(Н1N1)pdm2009 начиналась в условиях, когда часть населения могла быть защищена от этого возбудителя благодаря наличию гетеротипиче-ского Т-клеточного и гетеротипического локального иммунитета к предшествующим антигенным вариантам вируса А(Н1Ш). Именно в силу этих обстоятельств заболеваемость населения в период пандемического распространения вируса гриппа A(Н1N1)pdm2009 во всех странах носила и носит умеренный характер [4, 15, 19]. В-третьих, в случае полноценного "прорыва" птичьих вирусов гриппа А в человеческую популяцию она, как это утверждается, не будет "абсолютно неиммунной" [5], поскольку у части населения имеются перекрестно реагирующие локальные IgA-антитела и вирусспецифи-ческие Т-клетки памяти, которые будут предотвращать такую информацию и/или снижать ее тяжесть. Разумеется, это вовсе не исключает необходимость иметь резервные вакцины против всех потенциально пандемических вирусов гриппа А. Нами установлено существование четко выраженной обратной зависимости между предвакцинальным уровнем локальных IgA-антител к вирусам гриппа А и В и частотой их поствакцинальных конверсий: самая высокая частота наблюдалась среди лиц с исходными титрами антител < 1:8 и очень низкая - среди лиц с высокими титрами > 1:64 (см. табл. 3). Это свидетельствует, что анализ поствакцинальной индукции ЖГВ локального иммунитета должен осуществляться по тому же принципу, которого придерживаются при оценке этого препарата по частоте конверсий сывороточных антител, т. е. доля (%) таких конверсий должна рассчитываться только среди лиц с низкими исходными титрами. Данные табл. 3 указывают на то, что уровень локального предвакцинального иммунитета влияет на частоту индукции ЖГВ локальных IgA-антител после прививки, поскольку среди лиц с фиксированными приростами этих антител доля с высокими исходными титрами составила всего 2-9%, а среди привитых, у которых от-сутсвовали конверсии антител, - значительно больше (27-33%; p < 0,05). Конечно, у последних на иммунологическую “неотвечаемость” могли влиять и другие факторы (особенности генотипа, некачественная прививка, отсутствие должной приживляемости вируса в верхних дыхательных путях и т. д.). Нами обнаружено (см. табл. 4), что у молодых людей частота конверсий локальных IgA-антител на вакцину A(Н1N1)pdm2009 была намного выше аналогичного показателя для вакцины A(ffiN2) - соответственно 54 и 27% (p < 0,05). Это хорошо согласуется с результатами выявления у невакцинированных лиц того же возраста локальных IgA-антител к этим двум вирусам (см. табл.2). То же самое наблюдали у них и в отношении частоты поствакцинального достоверного увеличения вирусспецифических СD4+ и СD8+-Т-клеток памяти [14, 16]. Все это отражает состояние у обследовавшихся лиц иммунологической памяти к вирусам А(Н1Ш) pdm2009 и А(Н5№). К первому из них иммунологическая память, естественно, более выражена, поскольку взрослые люди в течение жизни уже инфицировались (возможно, неоднократно) вирусами данного подтипа и/или вакцинировались сезонными вакцинами, включавшими тот или иной дрейфовый вариант вируса А(НШ1). В то же время значительно более низкий уровень у лиц того же возраста перекрестно реагирующих локальных антител и Т-клеток памяти к птичьему вирусу A(ffiN2) объясняется тем, что для вакцинируемых это был первичный контакт. Ранее показана способность сезонной ЖГВ повышать у людей авидность локальных IgA-антител [18]. То же самое отмечено у добровольцев, прививавшихся вакцинами A(Н1N1)pdm2009 и А(Н5№) (см. табл. 5). В целом представленные в настоящей статье данные позволяют сделать следующие важные, на наш взгляд, выводы. Индукция у взрослых людей локального гуморального иммунитета с помощью ЖГВ возможна даже в отношении птичьего вируса гриппа А, с которым эти люди не встречались. Намного успешнее такая индукция развивается в ситуации, когда новый пандемический штамм относится к сероподтипу вируса гриппа А, который длительное время циркулирует среди населения. Определяющим в стимуляции ЖГВ локального гуморального иммунитета к любым реально и потенциально пандемическим вирусам гриппа А как антропонозной, так и зоонозной природы является предсуществующая у людей иммунологическая память в виде перекрестно реагирующих Т- и В-клеток и IgA-антител, специфичных к этим возбудителям. Поэтому при угрозе глобального распространения таких штаммов необходимо осуществлять экстренный мониторинг населения на наличие данных факторов иммунитета. Мониторинг не только дает представление об иммунной защите людей, но и позволяет предсказать иммуногенность готовящихся вакцин в отношении индукции вирусспецифических клеток памяти и локальных антител.

References

Supplementary files