IMMUNOMODULATORS AND SPECIFIC INACTIVATED VACCINES IN URGENT PROPHYLAXIS UNDER EXPERIMENTAL ARBOVIRAL INFECTION

Full Text

В последние годы существенно возрос интерес исследователей к использованию иммуномодуляторов (ИМ) для повышения общей резистентности организма к вирусным инфекциям. ИМ объединяет одно общее свойство - все они имеют иммунологические точки приложения, т. е. определенные мишени среди клеток иммунной системы. Отобранные для клинического использования ИМ могут применяться при широком круге заболеваний вирусной этиологии, активируя через определенные клетки-мишени иммунную систему и повышая резистентность к этим инфекциям. Кроме того, ИМ могут использоваться в сочетании со специфическими инактивированными вакцинами при терапии и профилактике острых и персистентных вирусных инфекций, с одной стороны, повышая иммуногенность вакцин, с другой - предотвращая развитие вторичных иммунодефицитных состояний организма [1]. Низкая иммуногенность инактивированных вирусных вакцин обусловлена, по-видимому, введением в организм недостаточного количества специфического антигена. Поэтому при использовании профилактических и особенно лечебных вакцин прибегают к многократным вакцинациям для формирования стойкого специфического противовирусного иммунитета [1]. Иным методом усиления иммуногенности вакцин является их применение с адъювантами, а в последнее время - и с ИМ [2]. Экстренная специфическая профилактика вирусных инфекций предполагает использование либо активных этиологических антивирусных препаратов, либо введение специфических вакцинных препаратов в комбинации с ИМ. В связи с этим представляет интерес исследование эффективности ряда отечественных ИМ, а также их сочетанного применения со специфическими вакцинами, для экстренной профилактики экспериментальных арбовирусных инфекций. Материалы и методы Животные. Мыши беспородные массой тела 6-7 и 10-12 г; мыши BALB/c массой тела 10-12 г; мыши СВА массой тела 10-12 г (питомник РАМН). Все работы с животными проводили строго по «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных». Вакцины. Культуральная инактивированная вакцина восточного энцефаломиелита лошадей (ВсЭЛ) получена в лаборатории сравнительной вирусологии нашего института [1] путем инактивации формальдегидом вируссодержащей жидкости, зараженной производственным вакцинным штаммом вируса ВсЭЛ. Вакцину вводили за 3 дня до основного опыта в дозе 0,2 мл подкожно (п/к) в разведении 1:8-1:16. Вакцина клещевого энцефалита (КЭ) «Энцевир» культуральная очищенная концентрированная, инактивированная, сорбированная жидкая (ФГУП «НПО «Микроген», Россия), введение 0,2 мл внутрибрю-шинно (в/б) за 3 дня до инфицирования. Оценку факторов гуморального иммунитета проводили в реакции нейтрализации по общепринятой методике. Вирусы. В работе использовали: 1) вирус ВсЭЛ (штамм «Panama») в дозе 3-5 ЛД50/0,2 мл п/к; 2) вирус КЭ (штамм «Софьин»), инфицирующая доза 10 ЛД50/0,2 мл п/к; 3) вирус желтой лихорадки, штамм 17Д (вирус вводили интрацеребрально в инфицирующей дозе 10 ЛД50 в объеме 0,03 мл). Все вирусы получены из музея вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России. Препараты. Полирибонат (ПРТ) (НИКТИ БАВ ГНЦ «Вектор», г. Бердск), пептидогликан-160 (ПГ-160), глюкозамурамилдипептид (ГМДП) (ЗАО «Пеп-тек»), ридостин (ЗАО «Вектор-медика»), тимозин (ООО НПП «Фарма-клон»), милайф (МНПЦ «Ми-лайф»). Все препараты производства РФ. Все исследуемые иммуностимуляторы вводили животным в дозировках в соответствии с рекомендациями фирм-производителей на 1 кг массы животных. На модели арбовирусных инфекций изучили иммуностимулирующее действие вышеуказанных препаратов. Эффективность иммуностимулирующего препарата определяли по уровню защиты животных, получивших вакцину в сочетании с ИМ, в сравнении с таковым у животных, получивших только вакцину; по средней продолжительности жизни (СПЖ) животных, определяемой в соответствии со стандартной методикой [3]; по уровню гуморального иммунного ответа (вируснейтрализующие антитела), устанавливаемому у мышей общепринятым методом [1]; по стимуляции клеточного иммунитета, определяемого in vivo по уровню лечебной активности иммунных Т-лимфоцитов (адоптивный перенос) [2]. Статистическая обработка. Для статистической обработки результатов применяли двусторонний критерий Фишера и критерий х2. Различие показателей считали значимыми при р < 0,05. Результаты Результаты исследований на модели ВсЭЛ. На модели ВсЭЛ исследовали влияние отобранных препаратов на формирование противовирусной резистентности, а также их способность к иммуностимуляции специфического иммунного ответа при вакцинации у мышей. Эффективность иммуностимулирующего действия препаратов определяли по проценту защиты животных и увеличению срока СПЖ. Из табл. 1 следует, что только один из изучаемых препаратов - препарат ГМДП - дает достоверный иммуностимулирующий эффект на формирование вакцинального специфического иммунитета. Препарат ГМДП при использовании по схеме -3 ч + 3 ч приводил к достоверному увеличению показателя защиты у иммунных животных на 30% по сравнению с таковым неиммунных животных. При введении иммунным животным других препаратов защита повышалась в среднем на 10-15%. У неиммунных животных на формирование противовирусной резистентности, которая выражается в повышении защиты на 20-30%, влияют следующие препараты: ПРТ (схемы: -24 ч; -4 ч + 4 ч + 24 ч; +4 ч + 24 ч) и ПГ-160 (схемы: -24 ч; -4 ч + 4 ч + 24 ч + 48 ч). Наибольшее повышение защиты по отношению к аналогичному показателю в контрольной группе на 50% дает препарат ридостин при схемах введения: -24ч ; -4 ч; -4 ч + 4 ч (см. табл. 1). Ридостин как наиболее эффективный иммуностимулятор мы использовали в дальнейших экспериментах на мышах для изучения реакций специфического иммунитета. 36 Таблица 1 Влияние ИМ на выживаемость и СПж мышей, инфицированных вирусом ВсЭЛ Препарат Разовая доза, Схема введения Неиммунные животные Иммунизированные мыши путь введения препарата % защиты СПЖ Р < % защиты СПЖ Р < ПРТ 0,5 мг/мышь п/к -24 ч 30 5,1 0,001 40 6,0 0,01 -4 ч + 4 ч + 24 ч 30 4,8 0,001 40 5,1 0,01 4 ч + 4 ч + 24 ч + 48 ч 30 5,0 0,001 40 5,1 0,05 +4 ч +24 ч 20 3,5 0,01 20 3,8 0,1 ПГ-160 0,5 мг/мышь п/к -24 ч 30 5,6 0,01 40 7,2 0,01 -4 ч + 4 ч + 24 ч 20 3,2 0,1 20 4,5 0,01 4 ч + 4 ч + 24 ч + 48 ч 30 5,8 0,05 40 7,0 0,05 Ридостин 50 мг/мышь -24 ч 50 8,9 0,01 65 10,5 0,01 -4 ч 50 8,4 0,01 60 9,8 0,01 -4 ч + 4 ч 40 7,8 0,01 40 8,3 0,01 +4 ч 20 5,3 0,1 30 6,8 0,05 ГМДП 80 мг/мышь п/к -24 ч - - - - -3 ч - - - - -3 ч + 3 ч 20 0,05 4,8 50 6,2 0,05 + 3 ч - - - - + 3 ч + 24 ч 20 0,05 5,6 20 6,0 0,05 Контроль вируса ВсЭЛ п/к 3-4 ЛД50/0,2 мл Выживаемость 7-10% СПЖ 9,1—9,3 Формирование общей резистентности к вирусу восточного энцефаломиелита лошадей при сочетанном применении вакцины против ВсЭЛ и ИМ ридостина изучали в этом эксперименте в реакции нейтрализации. Индуцирование иммунного ответа определяли по продукции специфических антител в сыворотке крови мышей. После однократной иммунизации в сочетании с ридостином отметили достоверное повышение содержания антител в сыворотке крови мышей (индекс нейтрализации равен 2,25, у контрольных животных - 1,75). В опытах адоптивного переноса иммунных спленоцитов мышей, которым вводили ридостин, при последующем заражении 100 ЛД50 вируса ВсЭЛ выживало 35% животных. В контрольной группе животных, получивших спленоциты от доноров интактных мышей и мышей, зараженных вирусом, погибало 100% животных. Результаты исследований на модели желтой лихорадки. Результаты исследования эффективности милайфа (экстракт гриба Fusarium Sambucinum) на выживаемость и СПЖ мышей, инфицированных вирусом желтой лихорадки, штамм 17Д, представлены в табл. 2. Как видно из данных табл. 2, при таком жестком варианте инфицирования препарат ридостин при введении в/б по профилактической схеме приводил к защите 18 % животных, в то время как препарат ми-лайф отличался достоверной противовирусной активностью, приводя к защите 30% животных, при введении в/б по лечебно-профилактической схеме (-24 ч + 24 ч). Результаты исследований на модели кЭ. Противовирусная активность исследуемых препаратов на беспородных мышах, зараженных 10 ЛД50 вируса КЭ, представлена в табл. 3. Данные табл. 3 свидетельствуют о достоверной защите при использовании при различных схемах введения трех препаратов: ридости-на, ПРТ и ПГ-160. Обращает внимание тот факт, что статистически достоверный процент защиты получен при использовании ридостина по профилактической схеме введения (-24 ч, -4 ч), а при применении ПРТ и ПГ-160 - при использовании по лечебной схеме. ИМ тимозин оказался в данном опыте неэффективным. При исследовании влияния изучаемых препаратов на формирование поствакцинального иммунитета к КЭ при однократной иммунизации экспериментальных животных (мыши линии СВА и BALB/c) отметили также положительное влияние применения препаратов на выживаемость этих животных. При этом Таблица 2 Влияние ИМ милайфа на выживаемость и СПж мышей, инфицированных вирусом желтой лихорадки (штамм 17Д) Препарат Схема введения, в/б Разовая доза препарата, кратность введения Защита, % р СПЖ, сут р Милайф -24 ч 5 мг/0,1 мл на 1 мышь двукратно - > 0,05 10,0 > 0,05 -24 ч + 24 ч 5 мг/0,1 мл на 1 мышь двукратно 30 < 0,01 14,0 0,01 +24 ч 5 мг/0,1 мл на 1 мышь двукратно - > 0,05 9,5 > 0,05 Ридостин -24 ч 100 мкг/0,1 мл на 1 мышь однократно 18,2 < 0,05 11,9 0,01 Контроль заражения 10 LD50/0,03 мл Выживаемость 2% - - 9,3 37 Таблица 3 Влияние ИМ при различных схемах их введения на выживаемость и СПж мышей, инфицированных вирусом кЭ Препарат Разовая доза препарата и путь введения Схема введения препарата (в ч) % защиты СПЖ Р < Ридостин 50 мг на 1 мышь п/к -24 ч 60 11,0 0,01 -4 ч 60 14,0 0,001 +4 ч 30 11,3 0,01 +48 ч 0 10,6 - ПГ-160 0,5 мг на 1 мышь п/к -24 ч 10 9,8 0,05 -4 ч 10 9,7 0,05 -4 ч + 4 ч + 24 ч 40 12,2 0,01 4 ч + 4 ч + 24 ч + 48 ч + 72 ч 35 11,5 0,01 ПРТ 0,5 мг на 1 мышь п/к -24 ч 10 10,4 0,05 -3 ч 0 9,6 - -3 ч + 3 ч + 24 ч 20 11,2 0,01 +3 ч + 24 ч + 48 ч + 72 ч 20 11,4 0,05 Тимозин 4 мкг на 1 мышь п/к -24 ч - 10,5 0,05 +3 ч 15 11,3 0,05 Контроль вируса КЭ п/к 10 ЛД50/0,2 мл Выживаемость 5-10% СПЖ 9,0-9,3 наблюдали также увеличение процента защиты животных при комплексном применении препарата с вакциной и увеличение их СПЖ при последующем инфицировании вирусом КЭ (см. табл. 3). Представленные в табл. 3 данные свидетельствуют о достоверном повышении защиты и СПЖ иммунизированных мышей при сочетанном применении даже с однократным введением Им ридостина, ПРТ, ПГ-160 и вакцины. Тимозин оказался неэффективен. Таким образом, результаты проведенных исследований позволили выявить ряд перспективных ИМ при экспериментальных инфекциях, вызванных альфа-вирусами (ВсЭЛ) и флавивирусами (КЭ, желтая лихорадка). Все это подтверждает необходимость дальнейшего целенаправленного изучения противовирусных препаратов, обладающих иммуномодулирующими свойствами на моделях арбовирус-ных инфекций. При сравнительном исследовании иммуномодулирующих препаратов у интактных и вакцинированных животных выявили усиление их противовирусного действия при сочетанном использовании со специфическими вакцинами, что также свидетельствует об иммуностимулирующей способности ряда изученных препаратов. Стимулирующее действие ридостина на киллерную активность «иммунных» лимфоцитов в опытах адоптивного переноса против альфа-вирусной инфекции, а также его стимулирующее действие на факторы гуморального иммунитета позволяет отнести данный препарат к перспективным и рекомендовать его для проведения дальнейших клинических испытаний при КЭ, так как эта инфекция эндемична для РФ. Обсуждение Приведенные в этой статье результаты исследований, как и ранее опубликованные [2-6] нами сведения, позволили выявить ряд перспективных ИМ (ридостин, ПРТ, ПГ-160, ГМДП, милайф), которые могут быть использованы при экспериментальных арбовирусных инфекциях с профилактической и даже с лечебной целью. В то же время другие известные ИМ (циклоферон, ти-мозин) такими свойствами не обладали. Применение отобранных нами иммуностимуляторов в комбинации со специфическими вакцинами для экстренной профилактики экспериментальных арбовирусных инфекций повышало защиту на 10-15% (ридостин, ПГ-160, ПРТ). Следует также отметить, что сочетанное применение специфических вакцин с ГМДП при экспериментальной ВсЭЛ-инфекции и тимозином при экспериментальной КЭ-инфекции у мышей позволило повысить до 40-50% защиту животных. Поэтому только предварительная проверка в экспериментах позволит получить сведения о возможности использования иммуностимуляторов в сочетании с вакцинами в клинико-эпидемиологической практике. Следует специально обратить внимание на то, что коммерческие вакцины используются в практике при КЭ, желтой лихорадке и ВсЭЛ-инфекции в течение уже многих десятков лет. В последние годы появилось новое поколение ИМ (иммунофан, полиоксидоний, рон-колейкин и др.) [7], которые также подлежат проверке в аналогичных экспериментах. Среди изученных нами отечественных ИМ наибольшей активностью и широким спектром действия отличался ридостин, который может быть рекомендован для клинико- Таблица 4 Процент защиты и СПж мышей СВА и BALB/c при однократном введении ИМ у интактных и иммунных животных, инфицированных вирусом кЭ Неиммунизированные мыши Иммунизированные мыши препарат, доза, путь введения % защиты СПЖ препарат % защиты СПЖ Тимозин 4 мкг на 1 мышь -24 ч до КЭ - 9,6 Вакцина + тимозин -24 ч до КЭ 40 10,3 Ридостин 50 мг на 1 мышь -4 ч до КЭ 50 11 Вакцина + ридостин -4 ч до КЭ 65 14 ПРТ 0,5 мг на 1 мышь -24 ч до КЭ 20 9,7 Вакцина + ПРТ -24 ч до КЭ 55 12 ПГ-160 0,5 мг/кг -24 ч до КЭ 20 9,8 Вакцина + ПГ-160 -24 ч до КЭ 40 13,8 Контроль вируса КЭ 10 ЛД50 0 9,2 Вакцинация однократная (разведение 1:1) 30 10,4 38 эпидемиологических испытаний со специфическими вакцинами при КЭ, ВсЭЛ и желтой лихорадке у инфицированных лиц. Таким образом, выявлена достоверная эффективность сочетанного действия ИМ ридостина, ПРТ, ГМДП, ПГ-160 и специфических вакцин на выживаемость мышей при арбовирусных инфекциях. При альфа-вирусной инфекции сочетанное действие специфической вакцины и ридостина сопровождалось повышением уровня специфического гуморального иммунитета (специфические антитела) и клеточного иммунитета (адоптивный перенос иммунных лимфоцитов). Сочетанное использование специфической вакцины и ридостина может быть рекомендовано для клинических испытаний при КЭ в очагах инфекции.

References

Supplementary files