INTRANASAL CO-ADMINISTRATION OF RECOMBINANT STREPTOCOCCUS GROUP B POLYPEPTIDES AND INFLUENZA ΔNSI VACCINE

Full Text

Патогенные стрептококки относятся к наиболее распространенным возбудителям бактериальных инфекций человека. Заболевания, вызываемые стрептококками группы В (СГВ) или Streptococcus agalactiae, в большинстве стран мира рассматриваются в качестве важной социально-экономической и медицинской проблемы. Являясь причиной серьезных патологий беременности, высокой смертности новорожденных, детей младшего возраста, пожилых лиц и пациентов с иммунодефицитами, СГВ способны вызывать не только первичную инфекцию, но и вторичные осложнения после респираторных вирусных инфекций, в том числе гриппа [6]. Антибиотики, широко применяемые для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых СГВ, нередко оказывается неэффективными в силу увеличения числа антибиотикоустойчивых штаммов, дают широкий спектр побочных эффектов у людей. Это определяет актуальность поиска новых средств и способов специфической профилактики инфекций, вызываемых СГВ. Разработка эффективной СГВ-вакцины проводится более 20 лет. В качестве возможных ком понентов вакцинного препарата рассматриваются различные бактериальные антигены (АГ), в том числе полисахариды капсулы и поверхностные белки СГВ [3]. Перспективным направлением является создание универсальной СГВ-вакцины на основе рекомбинантных аналогов поверхностных белков СГВ, имеющих в своем составе консервативные последовательности, общие для большинства серотипов СГВ и ряда других грамположительных бактерий [10]. Для индуцирования полноценного иммунного ответа при интраназаль-ном введении рекомбинантных бактериальных белков, как правило, требуется добавление адъюванта [8]. В настоящей работе исследовали иммуноадъювант-ные свойства вакцинного штамма вируса гриппа с удаленным геном NS1 при совместном интраназаль-ном введении с рекомбинантными полипептидами СГВ. Известно, что при интраназальном введении вирусы гриппа с удаленным ^1-геном стимулируют выработку значительного количества интерферонов 1-го типа и других цитокинов и хемокинов [2, 9]. Мы предположили, что данное свойство ΔNS1-вирусов не Контактная информация: Шурыгина Анна-Полина Сергеевна, мл. науч. сотр.; e-mail: shurygina@influenza.spb.ru 28 только обеспечивает развитие полноценного противовирусного ответа, но и способно определить их им-муноадъювантные свойства при комбинированном введении с другими АГ. Материалы и методы Получение рекомбинантных белков стрептококков группы В. Рекомбинантные полипептиды СГВ Р6, SspB1, ScaAB и РЬ3а были клонированы в системе экспрессионных векторов pQE («Qiagen», США) с последующей очисткой с помощью аффинной хроматографии на Ni-сефарозе, как описано в работе [5]. Непосредственно перед вакцинацией все 4 белковых компонента были смешаны в эквивалентных концентрациях (10 мкг/белок/мышь). Получение живой противогриппозной вакцины с удаленным NS1-геном. Вакцинный вирус ΔNS1-H1N1 был получен методом обратной генетики, как описано в работе [7], с минимальными модификациями. Δ^1-H1N1 содержит поверхностные гликопротеины вируса гриппа А/ЫС/20/99, а оставшиеся 6 генетических сегментов, кодирующих белки РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS с удаленной открытой рамкой считывания NS1-гена, происходят от вакцинного штамма IVR-116, рекомендованного ВОЗ для производства гриппозных вакцин. Культивирование вакцинного вируса производили на клетках Vero, адаптированных к росту в бессывороточной среде (OptiPro SFM, «Invitrogen»). Иммунизация и контрольное заражение. В работе были использованы самки мышей линии Balb/c в возрасте 8-10 нед (питомник лабораторных животных ГОУ, филиал «Столбовая», Московская область). Все исследования выполнены согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 266 МЗ РФ от 19.06.03). Животным (по 10 мышей в группе) двукратно (0-й день, 21-й день) под легким эфирным наркозом интраназально в объеме 0,05 мкл вводили белки СГВ, ΔNS1-Н1N1-вакцину (1 · 106 ТИД50/мл/животное) или их комбинацию. В качестве контроля использовали физиологический раствор. Образцы сывороток крови собирали из нижнечелюстной вены до второй иммунизации (21-й день) и на 35-й и 42-й день от начала эксперимента. Сывороточные AT к ΔNS1-H1N1-вакцине определяли в реакции торможения гемагглютинации; AT к полипептидам СГВ-методом ИФА. На 43-й день все животные были заражены су-блетальной дозой контрольного вируса гриппа (В/Тюрингия 6:2 wt 1 · 105 ТЦЦ50/мл/животное), а через 24 ч (44-й день) всем животным интраназально были введены СГВ I be в дозе 2 · 108 КОЕ/животное. Через 5 и 24 ч после бактериального заражения был произведен забор легких и селезенок. Вирусную нагрузку определяли в 10% (m/V) гомогенатах легких методом предельных разведений на клетках Vero. Титр бактерий в легких и селезенках определяли, высевая 10-кратные разведения тканевых гомогенатов на 5% кровяной агар. Результаты и обсуждение Комбинированное интраназальное введение рекомбинантных полипептидов СГВ и живой противогриппозной вакцины с удаленным NS1-геном усиливает иммунный ответ к белкам СГВ. Оценку иммуногенности ScaAB 10OOOOOn t о 100000- 10000- 1000 Р6 21-й 35-й Ί I 42-й день SspBI РЬЗа t о Рис. 1. Динамика содержания бактериоспецифических антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных бактериальным и вирусно-бактериальным препаратами (по данным ИФА). Титры AT представлены как СГТ. Белые символы - группа, иммунизированная белками СГВ. Черные символы - группа, иммунизированная белками СГВ в комбинации с живой противогриппозной вакциной с удаленным ^1-геном. p < 0,05 (критерий Манна-Уитни). 29 рекомбинантных полипептидов СГВ проводили методом определения сывороточных IgG в ИФА (рис. 1). Наиболее высокие титры IgG наблюдались к белку Р6. Даже после первой иммунизации (21-й день) в группе, получившей только белки СГВ (Strepto), средний геометрический титр (СГТ) анти-Р6-IgG составил 3668 (2000-8000) и значительно возрос после повторной иммунизации (35-й день: СГТ 43 069 (8000-256 000) с тенденцией к дальнейшему увеличению (42-й день; СГТ 95 104 (32 000128 000)). Для других белков рост титров сывороточных AT выше базового уровня удавалось достичь только после двукратной иммунизации (35-й день). СГТ к ScaAB составил 14 254 (4000-32 000), к SspB1 - 11 314 (2000-16 000) и к РЬ3а - 16 000 (4000-32 000). Совместное интраназальное введение белков СГВ и живой противогриппозной вакцины с удаленным NS1-геном приводило к увеличению уровня сывороточных AT ко всем белкам СГВ и вакцины. Наиболее выраженный адъювантный эффект Δ^1^^™βι наблюдался для белка Р6: многократный прирост СГТ в группе Strepto + Δ^1 по сравнению с группой, иммунизированной белками СГВ отдельно (Strepto), составил 3 (21-й день), 15 (35-й день) и 7 (42-й день). Для белков ScaAB и SspB1 комбинированное введение препаратов также обеспечило более высокий и продолжительный IgG-ответ. Примечательно, что уровень IgG к этим белкам при использовании СГВ-полипептидов отдельно достиг максимума на 35-й день и не имел тенденции к дальнейшему увеличению, а в случае ScaAB даже несколько снижался к 42-му дню исследования, в то время как в группе, получившей оба препарата, наблюдался значимый прирост сывороточных AT к 35-му и 42-му дню исследования, а разница в СГТ между группами достигла статистической значимости (тест Манна-Уитнир < 0,05). Наиболее кратковременная выработка сывороточных AT и наименее выраженный адъювантный эффект Δ^1^^™βι был отмечен для РЬ3А-белка. Несмотря на то что на 35-й день в группе Strepto + Δ^1 произошло некоторое повышение СГТ IgG [23 776 (16 000-32 000)] по сравнению с группой, получившей СГВ-белки отдельно [СГТ 16 000 (4000-32 000)], к 42-му дню исследования уровень сывороточных AT 5 ч после заражения Содержание СГВ в легких мышей через 5 и 24 ч после заражения Группа 5 ч после заражения 24 ч после заражения число защищенных животных* средний титр СГВ** число защищенных животных* средний титр СГВ** ANS1 0/5 5,55 ± 0,65 3/5 2,24 ± 0,46*** Strepto 0/5 5,61 ± 0,03*** 5/5 < 1,5 Strepto + ANS1 1/5 2,98 ± 0,71*** 5/5 < 1,4 Контроль 0/5 5,13 ± 0,61 0/5 4,35 ± 0,33*** Примечание. * - мыши с бактериальной нагрузкой в тканях легких < 1,5 lg КОЕ/мл считались защищенными; ** - титры представлены в lg КОЕ/мл 10% суспензии гомогената ткани легких ± стандартная ошибка для группы из 5 животных. Образцы, в которых вирус не был обнаружен, оценивали как содержащие СГВ в дозе 1,5 lg КОЕ/мл для расчета средних титров; *** p < 0,05 по критерию Манна-Уитни. по отношению к белку РЬ3А в обеих группах снижался до базового уровня. В группе отрицательного контроля и в группе, получившей только ΔNS1-H1N1-вакцину, IgG-ответ к белкам СГВ не наблюдали. Комбинированное интраназальное введение рекомбинантных полипептидов СГВ и ANSl-HlNl-вакцины усиливает протективную эффективность в отношении СГВ. Для оценки эффективности комбинированной вакцинации мыши, получившие 2 дозы исследуемых препаратов, были подвергнуты вирусно-бактериальному заражению. Поскольку иммунизацию проводили вирусом гриппа A (H1N1), для провокации бактериальной пневмонии на фоне гриппозной инфекции был использован вирус гриппа В. Это позволило исключить возможность реализации защитного потенциала специфического противовирусного иммунитета, обусловленного вакциной подтипа H1N1. Через 48 ч после контрольного заражения вирус гриппа В определялся в легких животных всех исследуемых групп без значительного различия в титрах. Через 5 ч после бактериального заражения наименьшее содержание СГВ наблюдалось в группе Strepto+ Δ^1 (2,98 КОЕ/мл). В группах, в которых животные были иммунизированы отдельно полипептидами СГВ (Strepto) или ΔNS1-вакциной, и в группе контроля средний титр СГВ составил 5,5, 5,61 и 5,13 lg КОЕ/мл соответственно. Через 24 ч после бактериального заражения СГВ обнару- 24 ч после заражения 2 щ· 3- O ^2- CD 1_ О о. 1S о® ц Σ LJJ 3-O * эг- CD ι_ О Or 1S ANS1 Strepto ANSI+Strepto “Ί К ANSI Strepto ANSI+Strepto ~г~ К Рис. 2. Содержание СГВ в селезенках мышей через 5 и 24 ч после заражения (по данным титрования на кровяном агаре). NS1 - группа, иммунизированная живой противогриппозной вакциной; Strepto - группа, иммунизированная белками СГВ; Strepto + ANS1 - группа, иммунизированная белками СГВ в комбинации с живой противогриппозной вакциной с удаленным ^1-геном; К - контрольная группа. Индивидуальные титры бактерий, выраженные в lg КОЕ/мл, представлены отдельными символами; горизонтальные линии обозначают среднее значение. Пунктирной линией обозначен лимит чувствительности метода (1,5 lg КОЕ/мл). Мыши с бактериальной нагрузкой в тканях селезенки < 1,5 lg КОЕ/мл считались защищенными. живали только в группе контроля и группе, получившей одну Δ^1-вакцину (см. таблицу). В обеих группах, получивших полипептиды СГВ, как отдельно (Strepto), так и в комбинации с ΔNS1-вакциной (Strepto + Δ^1), стрептококк присутствовал только в легких. В контрольной группе и группе, вакцинированной ANS1-H1N1, СГВ обнаруживали также в селезенке, что свидетельствовало о бактериемии (рис. 2). 30 Хорошо известно, что большинство антигенов по-липептидной природы являются слабыми иммуногенами, особенно при условии мукозальной вакцинации. Вместе с тем такой способ вакцинации считается оптимальным для профилактики инфекций, вызываемых патогенами, которые колонизируют поверхности респираторного, желудочно-кишечного и урогенитального тракта [4]. В работе описан феномен повышения эффективности интраназальной иммунизации рекомбинантными белками СГВ при их одновременном введении с живой противогриппозной вакциной с удаленным NS1-геном. Ранее протективная эффективность рекомбинантных белков СГВ была показана при условии их подкожного введения с гидроокисью алюминия в качестве адъюванта [10]. Предпринятое нами совместное введение вируснобактериального препарата сопровождалось усилением системного иммунного ответа к бактериальным полипептидам, особенно после повторной иммунизации. Стимулирующий эффект гриппозной вакцины коррелировал с показателями собственной иммуно-генности рекомбинантных полипептидов, наивысший прирост наблюдали в отношении полипептида Р6. Самой слабой иммуногенностью при интраназальном введении обладал полипептид Pb3а, иммуногенность которого при подкожном способе вакцинации была ранее продемонстрирована [1]. Возможно, отсутствие иммунного ответа на этот полипептид обусловлено особенностями его структуры и связано с быстрым разрушением протеолитическими ферментами, которыми богаты слизистые секреты. Опосредованная введением гриппозной вакцины стимуляция иммунного ответа на бактериальные антигены сопровождалась повышением устойчивости мышей к заражению массированной дозой СГВ. У мышей, получавших вирусно-бактериальный препарат, наблюдалось ускоренное выведение СГВ из легких и полностью отсутствовала бактериемия. Адъювантный эффект ΔNS1-гриппозной вакцины может быть связан с тем, что при интраназальном введении вирусы с удаленным NS1-геном вызывают локальную выработку широкого спектра провоспали-тельных цитокинов, хемокинов и интерферонов 1-го типа, что приводит к эффективной активации специфического гуморального и клеточного иммунного ответа [9]. Следует отметить, что в группе мышей, получивших обе вакцины, по данным РТГА также наблюдалось повышение СГТ вирусспецифических сывороточных AT более чем в 2 раза по сравнению с группой, иммунизированной только ΔNS1-H1N1-вакциной ^NS1: 69,8 (8-256); Strepto + Δ№1: 139,6 (32-256)), что позволяет говорить о возможном эффекте синергизма при комбинированной вакцинации и рассчитывать на повышение защитного эффекта ΔNS1-вакцины в отношении вируса гриппа. В экспериментах для иммунизации был использован вирус гриппа A/H1N1, в то время как бактериальная инфекция проходила на фоне развития гриппозной инфекции, вызванной вирусом гриппа В. Мы намеренно исключили возможность реализации защитного потенциала противовирусного иммунитета, и протективная эффективность рекомбинантной по-липептидной вакцины против СГВ была изучена нами на модели смешанной вирусно-бактериальной инфекции. Одновременная интраназальная вакцинация вирусно-бактериальным комплексным препаратом обеспечила развитие СГВ-специфического иммунного ответа, способного ограничить развитие вторичной бактериальной инфекции. Примечательно, что вакцина ΔNS1-H1N1, не оказывая специфическое защитное действие на вирус гриппа В (через 48 ч после заражения вирус определялся в легких животных всех исследуемых групп без значительного различия в титрах), обеспечивала определенную степень неспецифической защиты от бактериальной инфекции. По сравнению с группой контроля у мышей, иммунизированных только гриппозной вакциной, наблюдались задержка в развитии бактериемии (см. рис. 2) и ускоренное очищение легких от СГВ (см. таблицу). Данное наблюдение требует дальнейшего изучения. Полученные нами результаты позволяют заключить, что комбинированное применение рекомбинантных белков СГВ и живой противогриппозной вакцины с удаленным ^1-геном приводит к повышению имму-ногенности бактериального препарата и усилению его защитных свойств в отношении СГВ инфекции, развивающейся на фоне гриппа. Совместное использование вакцинного препарата на основе рекомбинантных белков СГВ и ΔNS1-противогриппозной вакцины может не только быть средством профилактики заболеваний, вызванных СГВ, но и усиливать защитный эффект гриппозной вакцины за счет профилактики бактериальных осложнений гриппа.

References

Supplementary files