Pathogenic Effect of Pandemic influenza Virus H1N1 under Replication in Cultures of Human Cells

Full Text

В геноме вируса гриппа А закодировано 13 белков, из которых 10, так называемые структурные белки, входят в состав вирусных частиц [7, 29]. Два гликози-лированных белка, гемагглютинин (НА) и нейрами-нидаза (NA) локализованы на поверхности частиц и формируют так называемые наружные шипы. С помощью этих шипов вирус специфически распознает клетки-мишени и внедряется в них. Для выполнения функции внедрения большое значение имеет структурная форма гликопротеида НА. Этот белок синтезируется в форме предшественника НА0 (мол. масса 75 кД) и затем расщепляется клеточной протеазой трипсиновой специфичности на два фрагмента - НА1 (55 кД) и НА2 (20 кД), которые сохраняют дисуль-фидную связь. В вирионах могут присутствовать обе формы, НА0 и НА1/НА2, но при этом вирионы с НА0 Контактная информация: Жирнов Олег Петрович; e-mail: zhirnov@inbox.ru 20 не инфекционны и не способны внедряться в клетку-мишень, а вирионы, содержащие хотя бы часть молекул в расщепленной форме НА1/НА2, имеют высокую инфекционность для клеток [31]. Расщепление гликопротеида НА0 ^ НА1+НА2 зависит от наличия в клетках расщепляющей протеазы [31]. При ее наличии клетка, в которой размножается вирус, продуцирует инфекционные вирионы с НА1/ НА2, способные заражать соседние клетки и инициировать многоцикловый процесс размножения вируса. Напротив, клетки, лишенные вирусактивирующей протеазы, продуцируют неинфекционные вирионы с НА0, которые не способны инфицировать соседние клетки. Для поддержания многоцикловой инфекции вируса в таких клеточных культурах необходимо добавление экзогенного трипсина в культуральную жидкость для протеолиза НА0 ^ НА1 + НА2 и искусственной активации вновь синтезированного вируса. В настоящей работе исследовали культуры эпителиальных клеток человека для пассирования образцов клинических вирусов гриппа H1N1 и изучения их протеолитической активации при размножении в этих клетках. Актуальность исследования клеточных культур человека обусловливалась тем, что вирусы гриппа при размножении в организме человека адаптируются к факторам организма-хозяина. В частности, факторы хозяина имеют значение для функционирования практически всех вирусных белков, включая гликопротеиды НА и NA [21], нуклеопротеин NP [11, 15, 23], полимеразные белки PB1, PB2 и PA [10, 11], неструктурный белок NS1 [17, 33] и т. п. В результате такого приспособления вируса к факторам человека попытки пассирования вирусов из клинических материалов в культурах гетерологичного происхождения, таких как клетки почки собаки МDСК, часто оказываются малоэффективными. Для понижения этого адаптационного барьера в репликации клинических вирусов логично применить культуры клеток человека. Две такие культуры, Caco-2 и Calu-3, апробировали для характеристики размножения пандемического вируса гриппа H1N1. Этот вирус появился в популяции людей в 2009 г. и к настоящему моменту практически вытеснил из популяции людей доминировавший прежде вирус сезонного гриппа H1N1 [3]. Обнаружено, что при размножении в клетках Caco-2 и Calu-3 происходили заметное внутриклеточное разрезание НА0 ^ НА1 + НА2 и многоцикловая репродукция у всех исследованных штаммов вируса гриппа H1N1, что указывало на присутствие в этих клетках протеазы, активирующей вирусы гриппа. Такие культуры клеток человека позволяют оптимизировать выделение и пассирование клинических изолятов вируса пандемического гриппа H1N1. Материалы и методы клетки. Культуры эпителиальных клеток почки собаки (линии MDCK-2 и МDСК-Н) и кишечника (линия Сасо-2) человека культивировали в минимальной среде Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки коров (Gibco BRL) и антибиотиков гентамицина (25 мкг/мл), пенициллина (50 ЕД/ мл), стрептомицина (50 мкг/мл) [29]. Культуру клеток дифференцированного эпителия бронхов человека (линия Calu-3) выращивали в среде аналогичного состава с той лишь разницей, что использовали среду DМЕМ/F12 (Gibco BRL). Все клеточные линии получены из коллекции клеточных культур Института вирусологии Марбургского университета (Марбург, Германия). Вирусы. Вирус гриппа A/Moscow/501/2011 (H1N1) выделили в феврале 2011 г от больного, поступившего в инфекционную больницу № 1 Москвы. Для этого делали смыв из носоглотки фосфатным буферным раствором (ФБ; 10 мM Na2HP4/NaH2PO4, pH 7,2; 2,7 мM KCl; 137 мM NaCl), центрифугировали при 4000 об/мин, полученные клеточные осадки суспендировали в 250 мкл ФБ, обрабатывали ультразвуком в течение 2 мин для дезинтеграции конгломератов, вносили в культуру клеток Calu-3 и инкубировали в среде DМЕМ с антибиотиками без сыворотки. Через 72-96 ч определяли накопление вируса в культураль ной жидкости в титрах 24-26 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ) с эритроцитами человека группы I(0). Затем проводили дополнительный пассаж в культуре клеток МDСК-2 в присутствии трипсина (пассаж 1) и этот вирус использовали в экспериментах. Использовали вирус пандемического гриппа А субтипа H1N1 A/Hamburg/05/2009 (H1N1) (штамм изолирован в первую волну пандемии гриппа в Германии) и сезонного гриппа A/Moscow/450/2003 (H1N1), A/Memphis/14/96 (H1N1), A/WSN/33 (H1N1) и A/ Puerto Rico/8/34 (H1N1), которые пассировали в куриных эмбрионах. Очистка вирусов. Культуральную жидкость в объеме 2,5 мл центрифугировали при 8000 об/мин в течение 20 мин (5oC) для удаления клеточных обломков. Полученный супернатант наслаивали на 2,5 мл 20% сахарозы, приготовленной на ФБ, и центрифугировали в роторе SW 55.1 (Spinco L7) при 25 000 об/мин в течение 2 ч (10oC). Полученные вирусные осадки суспендировали в 1% растворе додецилсульфатата натрия (ДСН) и исследовали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПАГ). Электрофорез в ПАГ и вестерн-блот (ВБ)-анализ. Полипептиды зараженных клеток фракционировали в ПАГ, содержащем ДСН. Из геля белки переносили на нитроцеллюлозную бумагу Protran 0,45 мк (Schleicher & Schull) полусухим методом [24]. Мембрану промывали в ФБ, инкубировали 2 ч в 3% обезжиренном молоке и далее в течении 2 ч в ФБ, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина (Sigma) и специфические антивирусные антитела. Затем мембрану промывали ФБ и обрабатывали видоспецифическим конъюгатом пероксидазы хрена (Dako) с последующей идентификацией позитивных компонентов с помощью усиленной хемилюминесценции (ECL) с суперсубстратом (Pierce) [25]. анализ апоптозного профиля хроматиновой ДНк. Осадки клеток суспендировали в 50 мкл ФБ и смешивали с 250 мкл ФБ, содержащего 0,6% ДСН, 10 мМ EDТА и 15 мМ трис-НС (pH 8), к полученной суспензии добавляли 70 мкл 5 М NaCl. Полученную смесь оставляли на ночь при 4oC и центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 20 мин для удаления агломератов хроматина. Супернатант последовательно обрабатывали рибонуклеазой А (0,1 мг/мл) и про-теиназой К (0,5 мг/мл) при 37oC по 30 мин каждой. Суспензию смешивали с тремя объемами 96% этанола, инкубировали при -20oC в течении 2 ч. Сформированные преципитаты ДНК осаждали при 14 000 об/мин 20 мин, растворяли в 10 мМ трис-HCl (pH 8) и анализировали в 1% агарозном геле, как описано ранее [25]. Метод вирусных центров в клеточной культуре. Двудневную культуру клеток МDСК инкубировали в течение 1 ч при 37oC с разведениями исследуемых вирусов, приготовленными на среде DMEM. Через 7-8 ч клеточные культуры фиксировали 4% параформальдегидом и последовательно инкубировали с антителами анти-НА(Н1) и антивидовым конъюгатом пероксидазы хрена. Единичные инфицированные клетки (вирусные центры) окрашивали тетраметил-бензидиновым субстратом "True Blue" (KPL). Цен-тробразующие единицы (ЦОЕ) подсчитывали на 1 мл исследуемой суспензии в световом микроскопе при 75-кратном увеличении [30]. 21 Результаты В первой части работы исследовали вирус гриппа A/Moscow/501/2011 (H1N1), выделенный от больного в феврале 2011 г. Для этого вирусом заражали клетки Calu-3, из клеток выделяли РНК, проводили обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) с праймерами, специфичными для сегментов НА, NA, NP, PB2 вирусов гриппа А [13]. Полученные ДНК-фрагменты фракционировали в агарозном геле и после экстракции из геля определяли последовательность нуклеотидов (GenBank KC895861, KC895862, KC895863). Данные секвени-рования показали, что изолированный вирус имел антигенную формулу H1N1 и относился к вирусам пандемического гриппа человека. После идентификации клинического изолята изучали его размножение в различных клеточных культурах и сравнивали с другими штаммами вируса пандемического и сезонного гриппа субтипа H1N1: A/Hamburg/05/2009 (H1N1), A/Moscow/450/2003 (H1N1),A/Memphis/14/96 (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Далее исследовали протеолитическую активацию вирусов пандемического и сезонного гриппа H1N1 в культурах клеток человека Сасо-2 и Calu-3. Вирусы выращивали в культуре клеток, инкубируемых после заражения в среде без сыворотки, и определяли ин-фекционность синтезируемого вируса с применением теста искусственной активации вируса обработкой трипсином in vitro. Тест основан на том, что обработка трипсином приводит к повышению инфекционно-сти неактивированного вируса с НА0 в 50 раз и более и не оказывает влияния на инфекционность активированного вируса с НА1/НА2 [22]. Оказалось, что все штаммы как пандемического, так и сезонного вируса гриппа H1N1, синтезируемые в клеточных культурах Calu-3 и Caco-2, имели высокоактивированную инфекционную форму, которая не активировалась после обработки трипсином (табл. 1). Напротив, при размножении в культуре МЭСК-Н указанные вирусы имели низкую инфекционность, которая повышалась под действием трипсина более чем в 50 раз. Обращали внимание более низкие титры во всех клеточных культурах вируса A/Hamburg/05/2009 (H1N1), который выделен в первую волну пандемического гриппа H1N1, по сравнению с таковыми современного изолята A/Moscow/501/2011 (H1N1). Это указывало на улучшение генного соответствия у современных штаммов, что вело к повышению продуктивности Таблица 1 Инфекционные титры пандемических вирусов H1N1 при размножении в различных клеточных культурах Культура клеток и вирусы Инфекционный титр (ЦОЕ/мл) без обработки трипсином с обработкой трипсином Calu-3 A/Hamburg/05/2009 (H1N1) 0,2 105 0,3 105 A/Moscow/501/2011 (H1N1) 0,6 106 0,9 106 A/Moscow/450/2003 (H1N1) 0,3 107 0,5 107 A/Memphis/14/96 (H1N1) 0,1 108 0,2 108 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 0,6 107 1,4 107 Caco-2 A/Hamburg/05/2009 (H1N1) 0,4 105 1,0 105 A/Moscow/501/2011 (H1N1) 0,2 107 0,4 107 A/Moscow/450/2003 (H1N1) 0,8 107 0,5 107 A/Memphis/14/96 (H1N1) 0,1 108 0,3 108 MD^-H A/Hamburg/05/2009 (H1N1) 0,2 103 0,5 105 A/Moscow/501/2011 (H1N1) 0,5 104 1,1 107 A/Moscow/450/2003 (H1N1) 0,5 105 1,3 107 A/Memphis/14/96 (H1N1) 1,7 106 0,8 107 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 0,7 107 1,4 108 Примечание. Клеточные культуры заражали вирусами МИ около 0,1 и культивировали в среде без сыворотки. Через 24 (МЭСК-Н) и 40 (Calu-3 и Caco-2) ч после заражения определяли инфекционный титр вируса в культуральной жидкости методом единичных центров без и с предобработкой трипсином. пандемических вирусов H1N1 в ходе их эволюции в популяции людей. Полученные результаты говорили о том, что в культуре клеток Calu-3 и Сасо-2 происходило расщепление вирусного белка НА0 ^ НА1 + НА2, ведущее к продукции инфекционных вирионов. Для того чтобы проверить этот вывод, исследовали профиль белков НА0/НА1/НА2 в вирусе с помощью метода ПАГ-ВБ (рис. 1, а). Полученные результаты подтвердили этот вывод и показали присутствие в вирусах, выращенных в Calu-3 и Сасо-2, существенного количества расщепленной формы НА1/НА2. Результаты исследования инфекционной активности препаратов вируса подтверждали этот вывод и указывали на синтез в клеточных культурах Calu-3 и Cаco-2 высокоинфек- Рис. 1. Расщепление белка НА0 в клетках Calu-3, зараженных вирусами гриппа H1N1. Культуру клеток Calu-3 заражали вирусами A/Hamburg/05/2009 (H1N1), A/Moscow/501/2011 (H1N1), A/Moscow/450/2003 (H1N1), A/Memphis/14/96 (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/WSN/33 (H1N1) с МИ около 1. Через 35 ч после заражения из культуральной жидкости выделяли вирус методом центрифугирования. Белки препаратов вируса и инфицированных клеток подвергали электрофорезу в ПАГ с последующей идентификацией белков НА0, НА1, М1 и М2 с помощью метода ВБ и антител, специфичных к белку НА (а), М1 и М2 (б) вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). 1 - клетки; 2 - вирусы. 22 а б 1 2 3 4 1 2 Рис. 2. Профиль белков НА0 и НА1 в вирусах H1N1, выращенных в культуре МЛСК-Н и МЛСК2. Культуру клеток MDСK-H (а) и MDCK2 (б) заражали вирусами A/Moscow/501/2011 (дорожки 1, 3) и A/Moscow/450/2003 (2, 4) с МИ около 1. Через 17 ч после заражения культуральную жидкость делили на две части, одну из которых не обрабатывали (1, 2) и обрабатывали трипсином (5 мкгр на мл в течение 1 ч при 37oC) (3, 4). Далее из культуральной жидкости выделяли вирус методом центрифугирования. Белки препаратов вируса подвергали электрофорезу в ПАГ с последующей идентификацией белков НА0, НА1 и НА2 методом ВБ с усиленной хе-милюминесценцией с помощью антител, специфичных к белку НА вируса A/PR/8/34. ционных вирионов, которые не нуждались в активации трипсином (см. табл. 1). У различных вирусов субтипа H1N1 выявляли существенные вариации электрофоретической подвижности трансмембранного белка ионных каналов М2 и его содержания в инфицированных клетках и вирусных частицах (рис. 1, б). Наиболее высокую подвижность в геле имел белок М2 вирусов A/PR/8/34 и A/WSN/33 (H1N1), тогда как у вирусов A/Hamburg/05/2009 (H1N1), A/Moscow/501/2011 (H1N1), A/Moscow/450/2003 (H1N1) и A/Memphis/14/96 (H1N1) отметили его низкую подвижность. Такие различия в подвижности белка М2 между вирусными штаммами могут служить маркером для идентификации и характеристики вирусов. В зависимости от содержания белка М2 в инфицированных клетках и вирусе штаммы можно разделить на две группы: A/WSN/33 (H1N1), A/Moscow/501/2011 (H1N1), A/Hamburg/05/2009 (H1N1) - с высоким содержанием и A/Memphis/14/96 (H1N1) и A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) - c низким. Содержание М2 оценивали относительно уровня белка М1 (см. рис. 1, б). Поскольку белок М2 играет важную роль в индукции клеточной аутофагии [12] и воспаления [14], различия в уровне его внутриклеточного накопления у вирусных штаммов могут определять штаммоспецифические вариации в стимулировании аутофагии и воспалительного действия вирусов и влиять на патогенез процесса в инфицированных клетках. Интересное наблюдение сделано при размножении вирусов в культуре МDСК-2. Эта линия клеток была получена ранее для изучения клеточной поляризации [9]. Вирусы, выращенные в этой клеточной культуре, имели незначительное количество расщепленной формы НА1/НА2, которое варьировало от штамма к штамму (рис. 2). При количественной оценке, выполненной на основе сканирования ВБ-мембраны, установили варьирующее содержание белка НА1 в диапазоне 5-20% (относительно НА0) для различ ных вирусных штаммов. Такой уровень расщепления НА0 ^ НА1 + НА2 был достаточным для поддержания многоцикловой репродукции вирусов в культуре МDСК-2 без добавления экзогенного трипсина в культуральную среду. По сравнению с линией МDСК-2 клетки МDСК-Н имели более низкий протеазный потенциал по расщеплению НА0 ^ НА1 + НА2 и активации синтезируемого вируса для подавляющего большинства вирусных штаммов (табл. 2). Аналогичная оценка содержания НА1, выполненная для вирусов в культуре Calu-3 и Caco-2, давала величину 30-50%. Полученные данные позволяли сделать вывод о том, что клеточные культуры клеток МDСК, используемые в различных лабораториях, могут иметь существенные фенотипические вариации в уровне протеаз, активирующих вирусы гриппа, и существенно различаться по способности поддерживать многоцикловую репродукцию вирусов гриппа. В заключительной части работы исследовали цито-патическое действие вирусов гриппа НШ1 в культурах клеток человека. Все исследованные вирусы оказывали выраженное цитопатическое действие (ЦПД) как в МDСК, так и в Calu-3 и Caco-2 (рис. 3, а-в). Выраженное цитопатическое действие развивалось через 30-45 ч после заражения и характеризовалось округлением и фрагментацией клеток и их откреплением от матрикса. В клетках МDСК вирусиндуциро-ванное ЦПД развивалось быстрее и формировалось уже к 15-18 ч после заражения (см. рис. 3, в). При молекулярном анализе в незараженных клетках отмечали значительное образование липидизированной формы белка микротрубочек LC3-II, что указывало на высокий эндогенный уровень аутофагии в культуре клеток Calu-3 и Сасо-2 (рис. 4, а, б). Напротив, в клетках МDСК эндогенный уровень LC3-II был минимальным и значительно возрастал после инфекции вирусами гриппа H1N1 (рис. 4, в), что говорило о выраженной стимуляции аутофагии в клетках МDСК после вирусной инфекции. При инфекции вирусами гриппа H1N1 не отмечалось заметного прироста ли-пидизированной формы LC3-II, что указывало на отсутствие значимой стимуляции аутофагии в инфицированных клетках. Заметный прирост накопления обе- Таблица 2 Вариации в содержании расщепленного НА1/НА2 в вирусе гриппа, выращенного в клетках МDСK-Н и МDСK-2 Вирусный штамм Наличие расщепленного НА1/ НА2 в вирусе* МDСК-Н МDСК-2 A/Ramburg/05/09 (H1N1) + A/Moscow/501/11 (H1N1) - ± A/Memphis/14/96 (H1N1) + + A/Moscow/450/03 (H1N1) - + A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) ± + A/Aichi/2/68 (H3N2) - + Примечание. Вирусы выращивали в клеточных культурах МЭСК-Н и МДСК-2 без добавления трипсина в течение 17 ч, выделяли вирус из культуральной жидкости и анализировали профиль белков НА0 и НА1 с помощью электрофореза в ПАГ и ВБ-анализа. Обнаружение расщепленной формы НА1 в вирусе в количестве более и менее 15% относительно НА0 показано знаками + и ± соответственно. Пробы, в которых не удавалось выявить расщепленный НА1/НА2, показаны знаком -. 23 Рис. 3. Цитопатическое действие в клетках Calu-3 и МDСК-2, зараженных вирусами гриппа H1N1. Культуру клеток Calu-3 (а, б) и МБСК2 (в) заражали штаммами пандемического A/Moscow/501/2011 (H1N1) (2), сезонного A/Moscow/450/2003 (H1N1) (3) вирусов гриппа H1N1 с МИ около 1. Через 18 (а, в) и 35 (б) ч после заражения клеточные культуры незараженных (1) и зараженных клеток фотографировали в световом микроскопе. Ув. 250. их форм, LC3-I и LC3-II, наблюдали в клетках Calu-3 и Caco-2, инфицированных лабораторным штаммом A/PR/8/34 (см. рис. 4, а, б), что говорит о возможных вирусспецифических особенностях, влияющих на регуляцию аутофагии в инфицированных клетках. Вполне вероятно, что такие особенности штаммов обусловлены вариациями гена М, кодирующего белки М1 и М2, из которых М2 взаимодействует с программой клеточной аутофагии [12]. Важно отметить, что вирусы H1N1 пандемического и сезонного гриппа, включая штамм A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), имеют гены М соответственно птичьего и человеческого происхождения, обусловливающие вирусспецифические различия в белке М2. В зараженных клетках Calu-3 обнаруживали образование продуктов активной каспазы 3 а по сравнению с их отсутствием в незараженных клетках. Однако отмечали преимущественное формирование промежуточных форм ее активации (продукты р35 и р32) в отличие от клеток МОСК, где при заражении вирусами гриппа доминировали конечные продукты активации р28 и р17 (рис. 4, г). Это наблюдение указывало на неполноценное развитие апоптоза в Calu-3 по сравнению с таковым в клетках МВСК при их инфекции вирусами гриппа H1N1 (см. рис. 4, г). Сходную слабую индукцию каспаз наблюдали в культуре Сасо-2 при заражении вирусами гриппа H1N1 (не показано). Неполноценное развитие апоптоза в инфицирован ных клетках Calu-3 Caco-2 подтверждалось также отсутствием его главного признака - ступенчатой деградации хроматиновой ДНК. В клетках МВСК, инфицированных вирусами гриппа H1N1, обнаруживали характерный апоптозный профиль, так называемую ДНК-лестницу, тогда как в инфицированных клетках Calu-3 (рис. 4, д) и Caco-2 (не показано) в сравнении с незараженными клетками не выявили ступенчатой деградации ДНК. Эти результаты указывали на отсутствие выраженных апоптозных признаков в клетках Calu-3 и Caco-2 при их гибели под действием вирусов гриппа, включая вирус пандемического гриппа H1N1. Активация клеточных каспаз, как известно [24], определяет расщепление белка NP в сайте каспазного нарезания у всех вирусов гриппа человека. Обнаружили, что уровень активации каспаз в клетках Calu-3 был достаточным для расщепления белка NP в ка-спазном сайте и накопления апоптозной формы белка aNP при инфекции вирусами сезонного гриппа при отсутствии такового у пандемических вирусов (рис. 5). Аналогичный профиль накопления aNP у вирусов сезонного гриппа и его отсутствие у вирусов пандемического вируса H1N1 наблюдали в культуре клеток МБСК-Н и МБСК-2 (не показано). Отсутствие внутриклеточного расщепления белка NP у вирусов пандемического гриппа A/Hamburg/05/2009 (H1N1) и A/Moscow/501/2011 (H1N1) хорошо коррелирова- 24 LC3-I LC3-II LC3-I LC3-II А4 1 2 3 4 5 6 2Г <ь° <ь° Jp LC3-I LC3-II ^ Ш р35 р32 р28 р17 Рис. 4. Профиль аутофагосомного белка LC3-II, активированной каспазы 3а и хроматиновой ДНК в клетках МDСК-Н, Calu-3 и Сасо-2, зараженных вирусами гриппа H1N1. Клетки МDСK-Н (а), Caco-2 (б) и Calu-3 (в) заражали вирусами A/Hamburg/05/2009 (H1N1), A/Moscow/501/2011 (H1N1), A/Moscow/450/2003 (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) при МИ около 1. Через 17 (МОСК-Н) и 35 (Calu-3, Caco-2) ч после заражения равное количество по белку клеточного лизата подвергали электрофорезу в ПАГ с последующей идентификацией белков LC-3 (а-в) и активированной каспазы 3а (г) методом ВБ с использованием техники усиленной хемилюминесценции со специфическими антителами анти-LC3 и анти-3а, а также анализу профиля хроматиновой ДНК в агарозном геле (д); г - клетки Calu-3 (1-3) и МБС^ (4-6), незараженные (1, 4) и зараженные вирусами A/Moscow/501/2011 (2, 5) и A/PR/8/34 (3, 6); д - клетки МDСK (1-3) и Calu-3 (4-7), незараженные (1, 4) и зараженные вирусами A/Moscow/501/2011 (2, 5), A/Moscow/450/2003 (6) и A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (3, 7). ло с птичьим происхождением их гена NP, который, как известно, лишен полноценного каспазного сайта в белке NP [2, 23]. Путем секвенирования гена NP мы установили, что NP вирусов сезонного гриппа человека имел полноценный сайт каспазного расщепления QMETD16|G, тогда как у пандемических вирусов H1N1, включая вирус A/Moscow/501/2011 (H1N1), так же, как у вирусов птиц, NP имел нерасщепляемый мотив QMETG16G птичьего типа. Обсуждение Клеточные культуры широко используют для выделения вирусов гриппа от больных пациентов. При таком выделении важно сохранить исходную популяцию вирусных квази-видов, присутствующую в организме человека, и избежать искусственной селекции вирусных видов в результате адаптации к той или иной гетерологичной клеточной культуре, исполь зуемой для его выделения. Такая клеточная селекция вирусного варианта может проходить при взаимодействии со специфическими клеточными рецепторами, факторами внутриядерной миграции вирусного РНП, клеточными кофакторами для вирусной полимеразы и другими факторами, имеющими структурнофункциональные особенности, специфичные для вида животного, из которого получена клеточная культура. Поэтому поиск клеточных культур человека, чувствительных для размножения вирусов гриппа, представляет научный и практический интерес. В настоящее время спектр клеточных культур человека, которые чувствительны и высокопродуктивны для вирусов гриппа, крайне ограничен. К таким клеточным культурам человека, применяющимся для размножения вирусов гриппа, можно отнести линии клеток кишечного (Caco-2) и бронхиального (Calu-3) эпителия человека [1, 6, 8, 20, 28, 30, 32]. Результа- 25 Рис. 5. Профиль белка NP в клетках Calu-3, зараженных вирусами гриппа H1N1. Клетки Oalu-3 заражали вирусами A/Hamburg/05/2009 (H1N1), А/ Moscow/501/2011 (H1N1), A/Moscow/450/2003 (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) с МИ около 1. Через 35 ч после заражения инфицированные клетки подвергали электрофорезу в ПАГ с последующей идентификацией белка NP с помощью метода ВБ и антител, специфичных к этому белку. ты настоящей работы показывают, что обе клеточные линии высоковосприимчивы для вирусов пандемического гриппа H1N1 и поддерживают репродукцию этих вирусов на высоком уровне. Дополнительное достоинство использованных в работе клеток Сасо-2 и Calu-3 заключается в их способности расщеплять вирусный белок НА0. Такое расщепление НА0 ^ НА1 + НА2 говорит о наличии в этих культурах компетентных протеаз, способных осуществлять этот протеолиз. Примечательно, что эти протеазы расщепляют белок НА0 вирусов гриппа Н1Ш, для которых характерно наличие единичного остатка Arg в протеолитическом сайте НА0. Роль таких протеаз в респираторном тракте человека, по всей видимости, выполняют мембранно-связанные клеточные сери-новые протеазы, TMPRSS-2, TMPRSS-4, HAT, эпите-лиазин, имеющие трипсиноподобную специфичность расщепления по остатку Arg или Lys [4, 5, 31]. Эти про-теазы синтезируются в эндоплазматическом ретику-луме и мигрируют внутри клеток тем же мембранносвязанным маршрутом, что и вирусный белок НА0. Такая совместная миграция приводит к расщеплению части молекул белка НА0 уже в инфицированных клетках, в результате чего инфицированные клетки продуцируют в культуральную среду уже активированный вирус. Сходная внутриклеточная активация эпидемических вирусов человека H1N1, включая вирус пандемического гриппа H1N1, H3N2, H2N2, по всей видимости, имеет место в эпителии респираторного тракта больных гриппом людей [27, 30, 31]. При размножении вирусов гриппа H1N1 в культурах Calu-3 и Caco-2 обращало внимание более позднее развитие ЦПД по сравнению с таковым в культуре МВСК. Поскольку клеточные культуры Сасо-2 и Calu-3 имеют опухолевое происхождение, в них имеются повреждения и дисбаланс биохимических путей, регулирующих пролиферацию и гибель клеток. В частности, в клетках Caco-2 не выявляли существенной индукции каспаз-ных апоптозных путей, тогда как в культуре МВСК отмечали их массивную активацию и обнаруживали типичные признаки апоптоза на поздних сроках инфекции вирусом гриппа H1N1 [25, 26]. В динамике развитие аутофагии, поддерживающей выживание клеток, также различалось в клетках Сасо-2 и Calu-3, с одной стороны, и клетках МВСК - с другой. В первых двух культурах отмечали высокий эндогенный уровень аутофагии, который слабо изменялся в результате инфекции большинством вирусов гриппа H1N1, и лишь вирус A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) вызывал заметный подъем аутофагии в этих культурах. Такие вирусза-висимые влияния на аутофагию, вероятно, связаны со свойствами мембранного вирусного белка М2 [12]. В культуре МВСК выявляли слабый эндогенный уровень аутофагии, который претерпевал значительный подъем при инфекции всеми изученными вирусами гриппа. Известно, что супериндукция аутофагии может провоцировать апоптоз клеток [16], и, возможно, аналогичный механизм мог иметь место в клетках МВСК в ответ на вирусную инфекцию, индуцирующую ауто-фагию. Возможно, что повреждение апоптозных путей и высокий уровень аутофагии в клетках Сасо-2 и Calu-3 обусловливали более позднее развитие гибели инфицированных клеток, которая развивалась преимущественно по некротическому (неапоптозному) типу. Отсутствие признаков апоптоза и развитие некротической гибели клеток Сасо-2 обнаруживали ранее при инфекции лабораторными штаммами вирусов гриппа субтипов H1N1 и H3N2 [28]. Совокупность этих данных указывает на то, что вирус гриппа может вызывать гибель инфицированных клеток посредством многочисленных молекулярных механизмов и вовлекать в этот процесс многие биохимические пути и провоцировать их специфические сочетания в различных типах клеток. Для более детального понимания закономерностей процесса клеточной гибели необходимы дальнейшие исследования его молекулярных основ. Полученные в работе результаты имеют прикладное значение для преодоления затруднений, возникающих нередко при изоляции вирусов гриппа от больных людей в культуре клеток собак МВСК, которые наиболее широко используются в мире для этих целей. Эти трудности связаны, в частности, со слабой рецепцией ряда вирусов гриппа человека в данной клеточной культуре и отсутствием протеаз, активирующих вирусное потомство, что делает невозможной многоцикловую репродукцию вирусов [18, 19, 29]. Культуры клеток человека Calu-3 и Caco-2 лишены указанных недостатков и представляются более адекватными для выделения вирусов гриппа от людей в плане как эффективности изоляции вирусных штаммов, так и сохранения исходной популяции вирусных квази-видов в получаемых препаратах вирусов гриппа людей.

References

Supplementary files