The Influenza Viruses and Their Surface Proteins Impact on the Metabolism of Human Blood Vessel Endothelium Cells

Full Text

Общеизвестно, что поражение вирусом гриппа кровеносных сосудов, приводящее к тромбогеморрагическому синдрому, является одним из признаков тяжело протекающей гриппозной инфекции [8]. Однако этому аспекту патогенеза гриппа ранее уделялось недостаточ но внимания. За последнее десятилетие появился ряд данных, указывающих на взаимодействие вируса гриппа с эндотелием кровеносных сосудов, в частности на возможность репродукции вируса в клетках эндотелия с последующим развитием их дисфункции [2, 3, 11]. Контактная информация: Жилинская Ирина Николаевна, д-р биол. наук, вед. науч. сотр., ст. науч. сотр.; e-mail: irina@influenza.spb.ru 25 Вместе с тем не только сам вирус, но и отдельные белки могут оказывать действие на эндотелиальные клетки, вызывая нарушение их жизнедеятельности [4—7]. Цель нашей работы состояла в сравнительном исследовании влияния вирусов гриппа А и их поверхностных белков на метаболизм эндотелиальных клеток перевиваемой линии EAhy926. Материалы и методы Вирусы. Исследовали 3 штамма вирусов гриппа: эпидемический штамм вируса гриппа человека А/Брисбен/10/2007 (H3N2); реассортантный штамм вируса гриппа птиц А/курица/Курган/5/05 NSl-81/5:3 (этот штамм получен методом обратной генетики; геном включает следующие гены: а) полимераз РВ2 и PA, нуклеопротеина (NP), неструктурных белков (NS) от вируса A/PR/8/34(H1N1); полимеразы РВ1 от вируса А/Техас/1/77 (H3N2); б) гемагглютинина (НА) от дикого штамма А/курица/Курган/5/05 (H5N1), модифицированного по сайту расщепления; в) нейрамини-дазы (NA) и мембранных белков (М) от дикого вируса птиц А/курица/Курган/02/05 (H5N1)); пандемический штамм A/Санкт-Петербург/2/2009(HlNlpdm). Все вирусы получены из лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа. Определение инфекционной активности вируса гриппа в культуре клеток. Инфекционную активность вирусов гриппа определяли титрованием вируссодержащего материала в суточной культуре EAhy926 с коэффициентом 10 и рассчитывали по методу Рида и Менча (1938). Инфекционную активность вирусов оценивали по ТЦД50 и в РГА с куриными эритроцитами по общепринятому методу через 72 ч после заражения. Клеточные культуры. Репродукцию вирусов изучали на культуре клеток эндотелия человека EAhy926, любезно предоставленной д-ром Корой Джин Эйджел из Отдела патологии университета Северной Каролины. Клеточная линия EAhy926 воспроизводит основные морфологические, фенотипические и функциональные характеристики, присущие эндотелиальным клеткам сосудов [9]. Белки вируса гриппа. Гемагглютинин (НА) и ней-раминидазу (NA) выделяли из концентрированного и очищенного вируса гриппа. С этой целью вирусы ресуспендировали в Na-ацетатном буфере (50 мМ ацетата NA, 2 мМ NaCl, 0,2 мМ EDTA; pH 7,0) и разрушали 7% октилглюкозидом в течение 2 ч при 4oC. Затем материал центрифугировали при 15 000 об/мин в течение 1 ч (ротор Beckman SW50.1). К суперна-танту, содержащему НА и NA, добавляли 2% водный раствор бромида цетримония (СТАВ, «Sigma») до конечной концентрации 0,1%. Образец наносили на анионообменную колонку (1 x 3 см; сорбент DEAE-Sephadex А-50; «Pharmacia Fine Chemicals»), предварительно уравновешенную стартовым буфером (50 мМ трис-HCl, 0,1% октилглюкозид; рН 7,0 (для штамма А/курица/Курган/05/2005 и тот же буфер с рН 7,5 для штамма А/Брисбен/10/2007). NA элюировали 20 мл стартового буфера, НА - 20 мл элюирующего буфера (50 мМ трис-HCl, 0,5 M NaCl, 0,1% Triton X-100; pH 7,5). Каждую фракцию диализова-ли против буфера STE в течение 72 ч для удаления остатков октилглюкозида и Triton Х-100. Контроль чистоты выделенного материала осуществляли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле по методу Лэммли с последующим анализом гелей на денситометре GS-800 («Bio-Rad Laboratories»). Метаболизм клеток эндотелия оценивали с помощью метилтетразолиевого теста (МТТ) на общую активность внутриклеточных дегидрогеназ, который широко используется для биохимической оценки выживаемости клеток в культуре [10]. Метод основан на восстановлении диметилтиазолил-дифенилбромид тет-разолия митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами метаболически активных клеток. Клетки EAhy926 вносили в 96-луночные планшеты в концентрации 32 000 кл/лунка в 100 мкл культуральной среды. На следующий день клетки либо заражали вирусами по общепринятой методике, либо обрабатывали поверхностными белками исследуемых вирусов в разной концентрации при разном времени экспозиции. После экспозиции клеток или с вирусом, или с белком культуральную среду удаляли, к клеткам добавляли раствор МТТ-реактива в бессывороточной культуральной среде в концентрации 5мг/мл и инкубировали 3 ч в СО2-инкубаторе. Затем раствор красителя сливали и заменяли 96o спиртом на 30 мин. Далее планшету помешали в спектрофотометр Thermofisher VarioScan и снимали показания при длине волны 540 нм. Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Excel. η I CO I £ CD ο ί & k E ° I ra VO O 120η 100 80 60 40 20 O O 18 24 48 72 Время после заражения, ч ----0,01 ТЦЦ50 кл 0,001 ТЦД50 кл Рис. 1. Изменение общей дегидрогеназной активности в культуре клеток EAhy926 при воздействии исследуемых вирусов гриппа типа А. а - вирус гриппа А/Брисбен/10/2007(ЮМ2); б - вирус гриппа А/курица/Курган/5/05 NS1-81/5:3(H5N1); в - вирус гриппа A/Canra-- Петербург/2/2009(ШШр^). 26 \о О 120η 100 80 60 40 20 0 ® 120η t=^· ■ I*100- § 120—і g £ 80-\ --- Q. 5 N 3 O 60- \ \ S I \ 40g S 20- \D 0 V ~ g S 8°n4 Ig 60- I і 4°- I І 20- VO 0 0 24 48 72 Время после воздействия, О 24 48 72 Время после воздействия, О 24 48 72 Время после воздействия, ч ----100 мкг 50 мкг ------10 мкг НА 50 мкг ........NA 50 мкг Рис. 2. Изменение общей дегидрогеназной активности в культуре клеток EAhy926 при воздействии поверхностных белков вирусов гриппа типа А. а - Влияние НА вируса гриппа на изменение общей дегидрогеназной активности в культуре клеток FAhy926; б - влияние NA вируса гриппа на изменение общей дегидрогеназной активности в культуре клеток EAhy926; в - изменение общей дегидрогеназной активности в культуре клеток EAhy926 при воздействии NA и НА. Достоверность различий оценивали, используя дисперсионный анализ [1]. Результаты и обсуждение Изменение общей дегидрогеназной активности регистрировали при двух дозах заражения клеток исследуемыми вирусами. На рис. 1 видно, что снижение общей дегидрогеназной активности при заражении вирусами в дозе 0,01 ТЦД50/кл значительно превосходило тот же показатель при меньшей дозе заражения 0,001 ТЦД50/кл и зависело от времени репродукции вирусов. Так, через 18 ч после заражения вирусом метаболизм клеток снижался в среднем на 40% при дозе 0,01 ТЦД50/кл и на 20% при дозе 0,001 ТЦД50/кл. Через 48 ч после заражения метаболизм клеток снижался на 70% при дозе 0,01 ТЦД50/кл и на 40% при дозе 0,001 ТЦД50/кл. Существенные различия в активности воздействия трех вирусов не отмечены. Как видно на рис. 1, кривая активности дегидрогеназ имеет две области, отражающие изменение жизнеспособности клеток: область сравнительно малого изменения жизнеспособности клеток - от 0 до 24 ч и область более резкого изменения жизнеспособности клеток - от 24 до 48 ч. Поскольку МТТ-тест оценивает активность и митохондриальных, и цитоплазматических дегидрогеназ, ингибирование их активности только через 24 ч после заражения клеток, возможно, указывает на необходимость накопления достаточного количества зрелых вирусных частиц. Изменение общей дегидрогеназной активности в культуре клеток EAhy926 при воздействии НА и NA. Необходимо отметить, что воздействие и НА, и NA на клетки эндотелия также приводило к изменению активности клеточных дегидрогеназ. Через 1 сут после воздействия НА в концентрации 100 мкг/мл снижение общей дегидрогеназной активности составляло 60%, в концентрации 50 мкг/мл - 20%, в концентрации 10 мкг/мл снижение не выявлено (рис. 2, а). НА в концентрации 10 мкг/мл оказывал воздействие на клетки только через 48 ч, снижая метаболизм клеток на 5%, и через 72 ч - на 30%. Статистически значимые различия в активности НА исследуемых вирусов не обнаружены. Воздействие NA на исследуемые клетки графически отражено на рис. 2, б. Через 24 ч NA в концентрации 100 мкг/мл вызывала снижение общей дегидрогеназной активности клеток на 60%, в концентрации 50 мкг/мл - на 50%. Статистически значимые различия в актив ности NA исследуемых вирусов не обнаружены. Сравнение активности НА и NA в концентрации 50 мкг/мл по воздействию на метаболизм клеток эндотелия показано на рис. 2, в. Из рисунка видно, что через 24 ч после воздействия NA подавляла общую дегидрогеназную активность на 48%, а НА - на 21%, через 48 ч - на 57 и 29% соответственно. На основании этого можно заключить, что NA активнее снижает метаболизм эндотелиальных клеток, чем НА. Таким образом, можно говорить о том, что как цельный вирус, так и поверхностные белки (НА и NA) достоверно снижают общую дегидрогеназную активность клеток эндотелия, которая характеризует такие важные аспекты клеточного метаболизма, как процесс клеточного дыхания и продукция АТФ, т. е. приводит к развитию гипоксии клетки. Подобная активность вируса гриппа и его поверхностных белков в отношении эндотелия кровеносных сосудов представляется нам важной для понимания механизмов патогенеза гриппозной инфекции.

References

Supplementary files