Molecular-Genetic Characterization of the Bhanja Virus (BHAV) and the Razdan Virus (RAZV) (Bunyaviridae, Phlebovirus) Isolated from the Ixodes Ticks Rhipicephalus Bursa (Canestrini and Fanzago, 1878) and Dermacentor Marginatus (sulzer, 1776) in Transcaucasus

Full Text

Введение Семейство Bunyaviridae объединяет пять родов (Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus и Tospovirus) оболочечных, РНК-содержащих вирусов, с сегментированным геномом отрицательной полярности. Геном буньявирусов представлен тремя сегментами, кодирующими белок нуклеокапсида (N, S-сегмент), два оболочечных гликопротеида (Gn Gc, М-сегмент) и РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp, L-сегмент). За исключением тосповирусов (вирусы растений) большинство буньявирусов являются природно-очаговыми зоонозами и в основ Контактная информация: Альховский Сергей Владимирович; e-mail: salkh@ya.ru 14 ном арбовирусами, т. е. передаются позвоночным хозяевам при укусе членистоногими переносчиками. Описано более 350 буньявирусов. Из них более 40 вирусов входят в группу неклассифицированных буньявирусов, не отнесенных к определенному роду вследствие слабых антигенных связей и отсутствия геномных данных [1]. Вирус Бханджа (Bhanja virus - BHAV) впервые изолирован в Индии от клещей Haemaphysalis intermedia и отнесен к группе неклассифицированных буньявирусов [2]. В Европе BHAV выделяли от клещей H. punctata и H.sulcata в Болгарии, Хорватии, Словакии, Румынии, Италии [3-6]. Серологически близкий к BHAV вирус Палма (Palma virus - PALV) выделен в Португалии от клещей H. punctata [7]. В Африке также от клещей, помимо BHAV, выделены два близкородственных вируса - Кисмайо и Форекария (Kismayo virus - KISV; Forecariah - FORV) [8, 9]. На основании перекрестных серологических реакций данные вирусы объединены в серогруппу Бханджа [9]. Серологически (выявление антител у животных и людей) циркуляция вирусов группы BHAV выявлена во многих странах Средиземноморья, Ближнего Востока, Азии, Африки [10]. Геномы нескольких штаммов BHAV, а также FORV секвенированы и отнесены на основании филогенетического анализа к роду Phlebovirus [11, 12]. Круг позвоночных хозяев BHAV включает копытных животных, в том числе домашних коров, овец и коз. Обычно инфекция BHAV у взрослых животных протекает бессимптомно, но является патогенной для молодняка, вызывая поражения ЦНС [13]. У людей инфекция BHAV в основном также протекает бессимптомно, однако описаны несколько случаев лихорадочного заболевания и менингоэнцефалита [14, 15]. Модельная инфекция BHAV у макак (Macaca mulatta) протекает с поражением ЦНС в виде менингоэнцефа-лита [16]. Широкое распространение вирусов группы BHAV и их патогенный потенциал для животных и людей позволяют причислить их к проблеме новых и вновь возвращающихся инфекций. Количество новых бу-ньявирусов, вызывающих опасные инфекции у человека и животных, растет. В Европе в 2011 г. обнаружен новый, поражающий копытных домашних животных, ортобуньявирус Schmallenberg [17]. В 2009 г. новый флебовирус (SFTS virus, SFTSV - от Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome virus), связанный с клещами, идентифицирован во время эпидемической вспышки лихорадочного заболевания с синдромом тромбоцитопении в Китае [18]. В США в 2012 г. от пациентов с острой лихорадкой выделен и описан близкий к SFTSV флебовирус Heartland [19]. В 1972 г. BHAV (штамм LEIV-Az1818) был выделен от иксодовых клещей Rhipicephalus bursa Canestrini & Fanzago, 1878, собранных с коров в Исмаилинском районе Азербайджана. Вирус Раздан (Razdan virus -RAZV; штамм LEIV-Arm2741), был выделен в 1973 г. от иксодовых клещей Dermacentor marginatus Sulzer, 1776, снятых с овец в окрестностях с. Солак (Раздан-ский район) в Армении, и отнесен к неклассифицированным буньявирусам [20, 21]. В настоящей работе проведено полногеномное секвенирование и анализ геномов вирусов BHAV (LEIV-Az1818) и RAZV (LEIV-Arm2741). В результате мы впервые определили таксономическое положение вируса RAZV и охарактеризовали вирусы группы BHAV, выделенные в Закавказье. Материалы и методы Использованные вирусы и выделение РНк. Вирусы BHAV (штамм LEIV-Az1818) и RAZV (штамм LEIV-Arm2741) получены из Государственной коллекции вирусов РФ при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизованной 10% мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4 сут) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных, одобренных комиссией Института по этике экспериментов с животными. Фрагменты мозга (около 50 мг) помещали в 350 мкл лизирующего буфера RTL (QIAGEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделяли набором RNeasy mini kit (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориметра Qubit (Invitrogen, США). Подготовка библиотек и секвенирование. 100 нг тотальной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы (50 мМ tris-HCl (pH 8,3 at 25oC), 50 мМ KCl, 4 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, dNTP (1 мМ каждого) и гексапраймер (0,2 мкг)) при 85 oC в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scientific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25oC 10 мин, далее при 42oC 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70oC 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с использованием набора MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор TruSeq DNA Sample Prep Kits v2 (Illumina, США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза QIAxcel Advanced System (QIAGEN, Германия). Измерение молярности полученных библиотек проводили методом ПЦР в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (BioRad, США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Сиквенс библиотек осуществляли на приборе MiSeq (Illumina, США) с использованием набора MiSeq Reagent Kits V2 (300PE) в соответствии с инструкцией производителя. Концевые области генома амплифицировали c использованием набора Mint RACE cDNA amplification set («Евроген», Москва). Секвенирование пробелов и концевых областей проводили на генетическом анализаторе ABI 3130 (Applied Biosystem, США). биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов осуществляли, используя программы CLC Genomics Workbench 5.5 (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью сервиса BALSTX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ Lasergene Core Suite (DNAstar, США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму ClustalW. Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли, используя программу MEGA5. Поиск сайтов гликозилирования, 15 Уровень идентичности аминокислотных последовательностей белков вирусов RAZV и BHAV (LEIV-Az1818) с другими флебовирусами Вирус RdRp (L-сегмент) G (М-сегмент) N (S-сегмент) (Ss N сегмент) RAZV BHAV RAZV BHAV RAZV BHAV RAZV BHAV RVFV 32,1 31,8 18,4 19,4 34,3 37,4 13,2 13,2 TOSV 34,4 34,1 16,5 16,8 32,3 35,9 13,9 11,9 aguv 34,8 34,8 17,3 17,9 33,5 39,8 10,7 11,1 uukv 34,8 34,8 19,0 19,0 26,3 29,3 13,6 14,0 SFTSV 40,4 40,7 25,3 25,7 40,5 43,2 20,0 19,3 BHAV_IG690 95,9 99,3 89,0 99,2 92,5 99,0 88,8 99,0 BHAV_ibAr2709 94,7 93,7 84,5 86,2 93,2 94,9 87,2 84,0 BHAV_M3811 98,3 96,3 94,9 90,7 94,7 97,1 92,3 86,6 BHAV_R1819 98,2 96,0 93,7 90,1 93,6 96,3 91,7 86,9 PALV 98,1 96,5 92,5 90,5 92,5 96,2 92,7 86,3 FORV 93,9 93,6 84,9 86,2 92,8 95,6 87,5 83,7 BHAV LEIV-Azn1818 95,8 - 90,3 - 92,5 - 87,9 - RAZV LEIV-Arm2741 - 95,8 - 90,3 - 92,5 - 87,9 Примечание. Серым цветом выделены вирусы группы BHAV. RVFV - Rift Valley Fever virus; TOSV - Toscana virus; UUKV - Uukuniemi virus; AGUV - Aguacate virus; SFTSV - Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus; PALV - Palma virus; FORV - Forecariah virus. сайтов нарезания сигнального пептида и трансмембранных доменов проводили с помощью on-line ресурсов NetNGlyc1.0, SignalP и TMHMM2.0 соответственно (сайт CBS Prediction Servers http://www.cbs. dtu.dk/services). Результаты Полногеномное секвенирование. ДНК-библио-теки вирусов BHAV и RAZV были секвенированы в составе 24 индексированных библиотек. Всего для BHAV получено 556 312 коротких фрагмента («риды» - от англ. reads), из которых 1755 (0,32%) после de novo сборки формировали контиги, соответствующие геному вируса. Для ДНК-библиотеки RAZV получено I 022 514 рида, из которых 7158 (0,7%) соответствовали последовательностям вирусного генома. При сборке de novo для RAZV получены последовательности практически полностью (более 80%) перекрывающие геном вируса. Перекрытие генома BHAV при de novo сборке составило не более 40%. При картировании ридов на референсную последовательность (mapping) получено 99% перекрытие для RAZV и около 70% для BHAV. Средняя глубина покрытия (average coverage) при этом составила 31, 136 и 124 для трех разных сегментов (S, M, L) RAZV. Для BHAV средняя глубина покрытия составила только 6, II и 9 соответственно. Наблюдаемую разницу при de novo сборке и картировании вирусов BHAV и RAZV можно объяснить их разным содержанием (титром) в исходном материале. Для заполнения пробелов в геноме BHAV были получены соответствующие ПЦР-фрагменты, которые были секвенированы по Сенге-ру. Перекрытие генома RAZV составило около 99%, однако концевые последовательности были нами получены методом RACE и секвенированы независимо. В результате определены полные нуклеотидные последовательности всех трех сегментов каждого вируса (GenBank # KC335496, KC335497, KC3354978). Поскольку концевые последовательности других штаммов BHAV были определены ранее, для вируса BHAV RACE не проводили. Полученные концевые последовательности RAZV совпали с последовательностями вирусов группы BHAV и флебовирусов в целом. Канонические концевые последовательности геномной РНК у флебовирусов представлены 3'-UGUGUUuC и GAAACACA-5' [1]. У RAZV так же, как и других вирусов группы BHAV, концевые последовательности сохраняют консервативность, за исключением 3'-конца РНК L-сег-мента (3'-UGUGUCU) и 5'-конца S-сегмента (GAGA-CACA-5’). Длина сегментов генома RAZV составила 6333 н.о. (L-сегмент), 3304 н.о. (M-сегмент) и 1871 н.о. (S-сегмент) соответственно. Филогенетический анализ. При сравнении геномов RAZV и BHAV (штамм LEIV-Ar1818) обнаружили, что уровень идентичности между ними по аминокислотным последовательностям вирусных белков составляет 87,9-95,8% (см. таблицу), на основании чего RAZV мы отнесли к группе BHAV. На рис. 1 представлены дендрограммы, построенные в результате филогенетического анализа последовательностей трех сегментов буньявирусов животных. Как видно, вирусы группы BHAV формируют отдельную филогенетическую группу в составе рода Phlebovirus. Ближайшими соседями группы BHAV на дендрограмме являются две группы флебовирусов, переносимых клещами, - группа SFTSV и группа UUKV (Uukuniemi virus). Характеристика S-сегмента. S-сегмент у RAZV и BHAV (1871 н.о.) имеет две открытые рамки считывания (ОРС), расположенные в противоположных ориентациях (ambisense-стратегия) и разделенные межгенным участком длиной 139 н.о. Такая структура S-сегмента является характерной для флебовирусов [1]. Нуклеокапсидный белок (N), кодируемый 5' частью (+)РНК включает 247 а.к. и имеет расчетную массу 27 кД. В белке N можно выделить РНК-связывающий домен, сформированный консервативными для флебовирусов мотивами в районе 64, 67 и 74 а.к. Уровень идентичности белка N вируса RAZV с другими флебовирусами (не входящими в группу BHAV) составляет 34,8-45,6%. Среди вирусов BhAV уровень идентичности белка N составляет 90,2-99,2%. Наиболее высокий уровень идентичности (94,7%) белок N у RAZV имеет с европейским изолятом BHAV (M3811). Неструктурный белок NSs кодируется ОРС, расположенной в геномной (-)РНК. NSs у RAZV и BHAV представлен 313 а.к. Длина NSs у разных флебовирусов может варьировать (273, 293 и 316 а.к. у UUKV, SFTSV и вируса Toscana (TOSV) соответственно). 16 Рис. 1. Дендрограммы, построенные на основе сравнения последовательностей белков BHAV и RAZV с другими буньявирусами. а - РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp, L-сегмент); б - полипротеин, предшественник оболочечных белков Gn и Gc (M-сегмент); в - белок нуклеокапсида (N, S-сегмент). Здесь и на рис. 2: RVFV - Rift Valley Fever virus; TOSV - Toscana virus; UUKV - Uukuniemi virus; AGUV - Aguacate virus; PPV - Precarios Point virus; SFTSV - Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus; HEAV - Heartland virus; PALV - Palma virus; FORV - Forecariah virus; GOUV - Gouleako virus; SFSV Sandfly Fever Sicilian virus; CANV -Candiru virus; ZTV - Zaliv Terpenia virus). Функция NSs буньявирусов до конца не ясна, но известно, что он может подавлять защитное действие интерферонов при развитии иммунного ответа у позвоночных хозяев. NSs является наименее консервативным белком флебовирусов, а уровень его идентичности между флебовирусами разных антигенных групп составляет 9-15%. NSs у RAZV обладает 87,2-92,7% идентичности с вирусами BHAV. Характеристика М-сегмента. М-сег-мент у вирусов RAZV и BHAV содержит одну протяженную рамку считывания ОРС длиной 3210 н. о., кодирующую полипротеин длиной 1069 а.к. ОРС начинается с 24 н.о., причем старт-кодон дублирован. Полипротеин является предшественником двух структурных оболочечных белков Gn и Gc, которые образуются в результате его разрезания клеточными протеазами. В полипротеине вирусов BHAV и RAZV был найден сигнальный пептид, связанный с транспортом в аппарате Гольджи. Нарезание сигнального пептида, вероятно, происходит между 17 и 18 а.к. полипротеина (AVAC/DD). Вероятный сайт разрезания Gn/Gc определен в позиции 559/560 (мотив MHMALC/CDESRL). Дипептид CD (подчеркнут) в сайте нарезания характерен для вирусов группы BHAV, а также для SFTSV и Heartland, тогда как у остальных флебовирусов, включая UUKV, в данной позиции расположен консервативный дипептид CS. Таким образом, длина аминокислотных последовательностей оболочечных белков Gn и Gc вирусов RAZV и BHAV определена как 537 и 510 а.к. соответственно. Расчетная масса Gn и Gc составила 56 и 55 кД. Четыре потенциальных сайта гликозилирования в Gn (позиции 41, 114, 268 и 283) и один в Gc (позиция 947) найдены у RAZV и у BHAV. Отметим, что у вирусов FORV и BHAV (штамм ibAr2709), выделенных в Суб-Сахарной Африке, потенциальный сайт гликозилирования в позиции 114 отсутствует. У флебовирусов, переносимых москитами, М-сегмент вместе с белками Gn и Gc кодирует дополнительный неструктурный белок NSm c расчетной массой 30 кД. Белок NSm также присутствует у ортобуньявирусов и тосповирусов [1]. Вирусы группы BHAV и другие флебовирусы, связанные с клещами (группа UUKV и SFTSV), белка NSm не имеют. Профиль гидрофобности полипротеина RAZV позволяет выявить трансмембранные домены, расположенные на С- конце белков Gn и Gc. У белка Gn выявили два трансмембранных домена в позициях 457-474 и 481-498 а.к. (по полипротеину). Трансмембранный домен 17 RVFV TOSV AGUV UUKV PPV SFTSV HEAV FORV BHAV (M3811) BHAV (ibAr2709) BHAV (IG690) BHAV (R1819) PALV (М3443) BHAV (LEIV-Azl818) RAZV (LEIV-Arm2741) GOUV 983 V W T С A T S D D A R H E - V - H E - V G N I N N V N - L С S I T I M V M I M V M I M I M I M I M I к s - L - L - L - L - L - L - L N V N Q G H F - - Y - - С - - С Рис. 2. Структура мотива А в RdRp флебовирусов. Рамкой обозначен консервативный дипептид KW, замена в котором характерна для вирусов группы BHAV. белка Gc обнаружили в позиции 1027-1049 (по полипротеину). Характеристика L-сегмента. L-сегмент буньявиру-сов кодирует вирусный фермент РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp) [1]. У вирусов RAZV и BHAV, как и у других буньявирусов, L-сегмент имеет одну протяженную ОРС. Длина ОРС составляет 6249 н.о., что соответствует аминокислотной последовательности RdRp длиной 2082 а.к. Расчетная масса RdRp 236 кД. RdRp является консервативным белком. Среди флебовирусов разных антигенных групп уровень идентичности RdRp составляет не менее 29%. Среди вирусов группы BHAV минимальный уровень идентичности составляет 93,9%. Максимальным уровнем идентичности (98,1%) RdRp вируса RAZV имеет с PALV (см. таблицу). В структуре RdRp-вирусов с негативным геномом выделяют три домена, из которых первых два (I и II) сформированы вокруг консервативных дипептидов HD и PD соответственно [22]. У RAZV и других вирусов группы BHAV эти дипептиды мы обнаружили в позициях 81HD и 112PD, что в целом совпадает с другими флебовирусами (79HD и 110PD у вирусов UUKV и RVFV). Третий домен RdRp, включающий полимеразный активный центр, состоит из нескольких мотивов (preA, A, B, C, D, Е). В этих областях наблюдается наибольший уровень гомологии среди буньявирусов. Мотив preA сформирован вокруг консервативной позиции 924K (919K и 922K для RVFV и UUKV соответственно) и включает сайт связывания вирусной РНК. Структура этого сайта у RAZV и BHAV представлена 941RMIQFSIELLAR. Структура сайта варьирует у разных флебовирусов, но при этом сохраняются консервативные позиции 941R, 944Q, 948E, 952R (948E является консервативной для всех буньявирусов). Уникальную замену мы обнаружили у вирусов группы BHAV в структуре мотива А. Здесь расположен сверхконсер-вативный дипептид 994KW (по RVFV). Этот дипептид строго консервативен для RdRp-вирусов с негативным геномом. У вирусов группы BHAV дипептид представлен 1000TW (по RAZV). Из известных в настоящее время буньявирусов изменения в этой позиции в виде 448VW найдены только у неклассифицированного (близкого к флебовирусам) буньявируса Gouleako (рис. 2) [23]. Мотивы В - Е в третьем домене RdRp у вирусов группы BHAV практически полностью сохраняют структуру, характерную для всех флебовирусов. Таким образом, структура RdRp у вирусов RAZV и BHAV является характерной для флебовирусов. Обсуждение Классификация буньявирусов основана на перекрестных реакциях связывания комплемента или торможения гемагглютинации. При этом критерием определения вида Международным комитетом по таксономии вирусов принята 4-кратная разница в нейтрализации при двунаправленных разведениях сыворотка - антиген. Вирусы группы BHAV не отнесены к определенному роду сем. Bunyaviridae вследствие отсутствия перекрестных иммунных реакций с классифицированными буньявирусами [9]. В результате анализа полных последовательностей генома, проведенного в настоящей работе и одновременно другими авторами [11, 12], вирус группы BHAV отнесен нами к роду Phlebovirus. Несмотря на низкий уровень идентичности белков BHAV с другими флебовирусами (13,2-40%), структура генома BHAV, включая консервативные концевые последовательности, является характерной для флебовирусов. Структура М-сегмента соответствует флебовирусам, передающимися клещами (UUKV и SFTSV). Филогенетически вирусы группы BHAV формируют обособленную группу в составе флебовирусов, из которых наиболее близкими является группа SFTSV. Эти данные подтверждаются наличием слабой антигенной связи BHAV и SFTSV [12]. SFTSV в свою очередь обладает антигенными связями с некоторыми вирусами группы UUKV [24]. Неклассифицированный буньявирус RAZV [20, 21] на основании высокой гомологии (более 90%) генома отнесен нами к группе BHAV. Уровень идентичности среди европейских штаммов BHAV вместе с вирусами PALM и RAZV превышает 90%. Вирусы группы BHAV, для которых доступны геномные данные, представляют собой достаточно гомогенную группу, в которой уровень идентичности превышает в среднем 84%. Вместе с тем имеются основания сохранить RAZV в статусе самостоятельного вируса в группе BHAV, учитывая экологические особенности, связанные с горно-аридным типом ареала RAZV на Армянском нагорье.

References

Supplementary files