Immunogenicity of Recombinant Proteins Including Ectodomain of M2 Influenza Virus A

Full Text

Консервативные белки вируса гриппа (M2, HA2, M1, NP) вызывают повышенный интерес исследователей как объект разработки рекомбинантных вакцин нового поколения [3, 5, 10, 16]. Ряд рекомбинантных вакцин на основе эктодомена белка М2 (М2е) вируса гриппа успешно прошли доклинические испытания и клинические испытания фазы I, II. Показана их безопасность и высокая иммуногенность [7, 17, 19, 20]. Пептид М2е практически идентичен для всех вирусов гриппа, циркулировавших в человеческой популяции, включая пандемические вирусы А/Сингапур/1/57 (H2N2) и А/ Гонконг/1/68 (H3N2), вызвавшие пандемии соответственно в 1957 и 1968 гг., что и создает предпосылки для разработки универсальной вакцины на его основе. Вместе с тем аминокислотная последовательность М2е вируса гриппа A/H1N1/pdm09 и высокопатогенного вируса гриппа птиц A/H5N1 отличается от таковой вирусов гриппа человека на несколько аминокислот и индуцирует слабый перекрестный ответ. Пептид М2е является слабым иммуногеном, что, видимо, связано с его малым размером (24 а. к.) и низкой плотностью на вирусной мембране. Введение М2е с адъювантом или М2е, конъюгированного с белковым носителем, однако, стимулирует образование специфических антител, которое коррелирует с защитой от заражения летальной дозой вируса [1, 2, 4, 7, 9, 13, 15]. Перспективными белковыми носителями для сла-боиммуногенных антигенов являются бактериальный белок флагеллин - лиганд toll-like 5 рецептора (TLR5) и core-антиген вируса гепатита В (HBc). Флагеллин посредством активации TLR5 является мощным индуктором врожденного иммунитета, стимулирует созревание дендритных клеток с последующим усилением адаптивного иммунитета и может быть использован одновременно как белковый носитель и адъювант при создании противовирусных вакцин на его основе [6, 11, 13]. Белок HBc способен к самосборке в вирусоподобные частицы. Химерные частицы НВс-антигена, экспонирующие на своей поверхности чужеродные эпитопы, индуцируют высокий иммунный ответ на встроенные пептиды и защищают экспериментальных животных от заражения патогеном [1, 4, 9, 10, 18]. Встраивание пептидов в НВс возможно на “генетическом” уровне либо in vitro, в результате нековалентного связывания с немодифицированными HBc частицами [4]. Целью настоящей работы были конструирование и оценка иммуногенности двух рекомбинантных белков, включающих М2е разных субтипов вирусов гриппа А на основе белковых носителей (HBc, фла-геллин) при парентеральном введении. Материалы и методы Конструирование экспрессионного вектора pQE30-flg-3M, выделение и очистка рекомбинантного белка Flg-3M. Для создания экспрессионного вектора, обеспечивающего продукцию флагеллина с присоединенными к нему тремя копиями М2е, была использована плазмида pQE30-3MP [3], в которой клонирован искусственный ген, кодирующий гибридный белок, включающий 2 копии М2е штамма A/Duck/ Potsdam1402-6/1986(M2ep) с копией М2е штамма A/ Chicken/Kurgan/05/2005 (M2ek) между ними (BamHI-M2ep-PstI-M2ek-SalI-M2ep-KpnI). На первом этапе последовательность 5’-концевого M2ep вырезали из pQE30-3MP по сайтам BamHI и PstI и замещали ее синтетической последовательностью, кодирующей “человеческий” М2є. Затем по сайтам SalI и KpnI вырезали 3’-концевую копию M2ep и заменяли ее синтетической последовательностью, кодирующей М2є вируса “свиного” гриппа. В результате был получен вектор pQE30_3M(h + k + s). На следующем этапе последовательность гена фла-геллина была получена в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров FlgBH_F (AT GGA TCC GCA CAA GTA ATC AAC ACT AAC AGT CTG T) и FlgBH_R (AT GGA TCC ACG TAA CAG AGA CAG CAC GTT CTG C) и геномной ДНК Salmonella typhimurium в качестве матрицы. ПЦР фрагмент клонировали в векторе pQE30_3M(h + k + s) по сайту BamHI, отбирая клоны с «прямой» ориентацией вставки. Полученный экспрессионный вектор pQE30-flg-3M использовали в дальнейшей работе. Отсутствие обусловленных ПЦР мутаций в клонированном фрагменте было подтверждено с помощью секвенирования. Для получения штамма-продуцента рекомбинантного белка Flg-3M плазмиду pQE30-flg-3M вводили в клетки Escherichia coli штамма DLT1270 с помощью трансформации. Штамм DLT1270, являющийся производным штамма DH10B, содержит ген репрессора лак-тозного оперона lacI, интегрированный в хромосому. 22 Очистку белка Flg-3M, содержащего N-концевой полигистидиновый таг, проводили методом металл-аффинной хроматографии. После элюции с Ni-NTA смолы (Promega) препарат рекомбинантного белка диализовали против 20 мМ фосфатно-солевого буфера pH 8,0, содержащего 145 мМ раствор NaCl. В результате был получен препарат белка Flg-3M с чистотой более 95% (рис. 1). Конструирование экспрессионного вектора pQE30-flgP, выделение и очистка комплекса рекомбинантных белков 3MP + HBc + FlgP. Последовательность гена, кодирующего флагеллин с присоединенным к нему аптомерным пептидом GSLLGRMKGA, обеспечивающим связывание с НВс частицами [4] была получена в результате ПЦР с использованием праймеров FlgBH_F (AT GGA TCC GCA CAA GTA ATC AAC ACT AAC AGT CTG T) и FlgA_Sal (AT GTC GAC TTA CGC GCC TTT CAT ACG GCC CAG CAG GCT GCC ACG TAA CAG AGA CAG CAC GTT) с использованием ДНК pQE30-flg-3M в качестве матрицы. Полученный ПЦР-фрагмент обрабатывали BamHI и SalI и клонировали в экспрессионном векторе pQE30, обработанном теми же ферментами. Полученный экспрессионный вектор pQE30-flgР использовали в дальнейшей работе. Рекомбинантный белок FlgР экспрессировали в штамме DLT1270 и очищали методом металл-аффинной хроматографии. Белковый комплекс 3MP + HBc + FlgP получали смешиванием препарата 3MP-HBc и очищенного FlgP [4]. Синтетические пептиды М2е. В работе использовали синтетические пептиды G11, G26, G37 (НПО Верта, Санкт-Петербург), аминокислотная последовательность которых соответствовала М2е штаммов, A/Kurgan/05/2005(H5N1) - SLLTEVETP-TRNEWECRCSDSSD, A(H1N1)pdm09-SLLTEVETP-TRSEWECRCSDSSD и консенсусной последовательности вирусов гриппа А человека - SLLTEVE-TPIRNEWGCRCNDSSD. Животные. Были использованы мыши линии Balb/c (самки) в возрасте 7-8 нед (массой 16-18 г), полученные из питомника «Столбовая» ГУ Научный центр биомедицинских технологий РАМН. Животных содержали в виварии НИИ гриппа в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (1977). Иммунизация. Мышей иммунизировали троекратно с интервалом в 2 нед внутримышечно одним из рекомбинантных белков в дозе 50 мкг/мышь. Контрольной группе вводили PBS (фосфатный буферный раствор рН 7,2). Образцы крови, бронхоальвеолярные лаважи (БАЛ) забирали у 5 мышей каждой группы через 2 нед после третьей иммунизации и исследовали индивидуально. Определение сывороточных антител к синтетическим пептидам М2е в иммуноферментном анализе. Иммуноферментный анализ проводили общепринятым методом [13]. Использовали 96-луночные планшеты для иммуноферментного анализа с высокой сорбционной способностью (Greiner, Германия). Синтетические пептиды М2е G-26, G-37, G-11 сорбировали в концентрации 5 мкг/мл (в фосфатном буфере pH 7,2-7,4). В качестве конъюгатов использовали моноклональные крысиные антимышиные IgG (Invitrogen, USA) в разведении 1:1000, меченные пероксидазой хрена, моноклональные крысиные биотинилирован- 12 3 4 1*1 Рис. 1. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка Flg-3M 1 и 3 - маркер молекулярной массы (кДа); 2 - белковый препарат, выделенный из штамма-продуцента после индукции; 4 - очищенный белок Flg-3M. ные антимышиные IgG1, IgG2a в разведении 1:500 (BD Bioscience, USA) и стрептавидинпероксидазу в разведении 1:1000 (BD Biosciences, USA). В качестве субстрата использовали тетраметилбензидин (BD Bioscience, USA). Учет реакции проводили при длине волны 450 нм. За титр принимали наибольшее разведение сыворотки, которое дает оптическую плотность по крайней мере в 2 раза больше, чем сыворотка не-иммунизированных мышей в том же разведении. Выделение вируса из легких. Через 2 нед после третьей иммунизации мышей заражали вирусом гриппа A/PR/8/34 (H1N1). Вирус вводили интраназально в дозе 1 LD/50 (доза, вызывающая гибель 50% контрольных животных) в объеме 50 мкл/мышь под легким эфирным наркозом. Репродукцию вируса в легких мышей определяли по инфекционному титру путем титрования 10% суспензии легких мышей, полученной на 6-е сутки после заражения, на культуре клеток MDCK. Зараженные клетки инкубировали в течение 72 ч при 360 С в СО2-инкубаторе. Уровень репродукции вируса оценивали по тканевому цитопатическому действию (в lg ТЦД/50) в реакции гемагглютинации эритроцитов. Инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча. Статистическая обработка данных. Значимость различий титров М2е в сыворотках, БАЛ и инфекционной активности вируса в легких оценивали с использованием ^-критерия Манна-Уитни. Результаты и обсуждение Сконструированы 2 рекомбинантных препарата на основе флагеллина (генетически слитый белок Flg-3M) и комплекс белков, полученный в результате сборки in vitro 3MP+HBc+ FlgP. Внутримышечная иммунизация рекомбинантными белками стимулировала прирост анти-М2е специфических IgG; при этом титры антител к пептидам G-11, G-26, G-37 были практически одинаковы (рис. 2 а). Уровень продукции анти-М2е IgG после иммунизации генетически слитым белком 3M2eFlg был в среднем в 7,5 раз выше, чем после иммунизации комплек- 23 Титр IgG 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 У/. 7/. G-11 G-26 Flg3M в G-37 Титры IgG в БАЛ 450-, 45035030025020015010050-O- Выделение вируса из легких мышей на 6-е сутки после заражения летальной дозой вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1) LL У/. G-11 G-26 G-37 Титры подклассов IgG в сыворотке 250000 200000 150000 100000 50000 0 Титры подклассов IgG в сыворотке 4000-, 35003000250020001500 -10005000— I IgGi I lgG2a I Контроль Рис. 2. Титры анти-М2е IgG в сыворотке крови (а), БАЛ (б), подклассов IgG (IgG1, IgG2a) (в, г) к синтетическим пептидам G-11-1 (М2е H5N1), G-26 (М2е H1N1pdm), G-37 (М2е консенсусный) у мышей после третьей иммунизации рекомбинантными белками Flg-3M, 3МР + HBc + FlgR а - различия титров IgG в опытных и контрольной группах достоверны (р < 0,01 и р < 0,05 соответственно), в опытных группах достоверны (p < 0,05); б - различия титров IgG в опытных и контрольной группах достоверны (р < 0,01), достоверных различий в опытных группах нет (р > 0,05); в - анти-М2е (G-11-1) IgG1 и IgG2a после третьей иммунизации Flg-3M; г - анти-М2е (G-11-1) IgG1 и IgG2a после третьей иммунизации 3МР + HBc + F^. сом белков 3MP + HBc + FlgP. Ранее было показано, что ковалентная сшивка флагеллина с целевым антигеном является определяющим фактором для имму-ногенности препарата [12]. Уровень анти-М2е IgG в БАЛ (рис. 2 б) был также в 2,5 раза выше у мышей, иммунизированных Flg-3M, по сравнению с мышами, иммунизированными белковым комплексом 3MP + HBc + FlgP. Иммунизация генетически слитым белком может стимулировать антигенспецифический, как В- так и Т-клеточный, иммунный ответ с образованием анти-генспецифических антител семейства IgG1 и IgG2a [12]. Защита от летальной гриппозной инфекции у мышей, иммунизированных рекомбинантными белками с М2е, коррелирует с высокими уровнями IgG2a [9, 10, 15]. Это объясняется способностью IgG2a связываться с тремя Fc рецепторами ^γΜ, FcγRШ, FcγRIV) [15] и эффективно участвовать в антитело зависимой клеточной цитотоксичности - основном механизме анти-М2е-иммунитета [14]. IgG1 менее эффективны в элиминации вируса через антителозависимую клеточную цитотоксичность. Отношение подклассов IgG1/IgG2a в нашем исследовании при иммунизации 3M2eFlg составляло в среднем 24,5 Иммунизация Доза заражения вирусом гриппа A/PR/8/34 (H1N1) Репродукция вируса в легких, lg ТЦД/50 3MP + HBc + FlgP (50 мкг 1LD/50 1,25 ± 0,0* внутримышечно) Flg-3M (50 мкг внутримышечно) 1LD/50 1,25 ± 0,4* Контроль 1LD/50 2,10 ± 0,3 Примечание. * - достоверное (р < 0,01) различие между опытными и контрольной группами. (рис. 2 в), что свидетельствует о формировании иммунного ответа по ТЬ2-типу с преимущественной продукцией интерлейкина 4. Иммунизация 3МP + HBc + FlgP стимулировала более сбалансированный ТЬ1/ТЬ2-ответ. Отношение IgG1/IgG2a в сыворотке составило 3,8 (рис. 2 г). Таким образом, очевидно влияние белкового носителя на синтез подклассов анти-М2е-IgG. Выявлено, что репродукция вируса в легких мышей, иммунизированных обоими белками, была достоверно ниже, чем у контрольных мышей (см. таблицу), что свидетельствует об ограничении вирусной репликации в легких и снижении тяжести инфекции. Полученные данные свидетельствуют о потенциальной эффективности исследуемых рекомбинантных белков против вирусов гриппа А различных субтипов. Следует отметить, что внутримышечный путь иммунизации рекомбинантных белков на основе фла-геллина не является оптимальным, так как известно, что на дендритных клетках слизистых оболочек экспрессия TLR5 значительно выше, чем на дендритных клетках селезенки [8], т. е. предпочтительным путем вакцинации является мукозальный и интраназальная иммунизация Flg-3M, будет более эффективной за счет как повышения иммуногенности препарата, так и формирования местного иммунитета. Тем не менее, в нашей работе показана возможность получения вакцинного препарата, обладающего одновременно одинаковой иммуногенностью как против вирусов гриппа А человека, так и против высокопатогенных вирусов гриппа птиц. Авторы выражают благодарность заместителю директора Центра «Биоинженерия» РАН, заведующему лабораторией систем молекулярного клонирования, доктору биологических наук Н. В. Равину за помощь в подготовке статьи.

References

Supplementary files