Vaccines against Highly Pathogenic influenza Viruses of the avian Origin

Abstract

Worldwide spreading of H5 and H7 highly pathogenic influenza viruses of the avian origin, which periodically infect and kill humans without prior adaptation, poses a constant threat of the new pandemic. The effectiveness of the pandemic prevention completely depends on the quality of the existing influenza vaccines. Typical methods of the vaccine production from the antigenically relevant strains are problematic in case of high virulent H5 and H7 viruses. Therefore, new approaches to the construction of the vaccine strains and production technologies are required in order to protect the population.

Full Text

Во время вспышки, вызванной высокопатогенным вирусом гриппа птиц подтипа H5N1 на птичьих фермах Гонконга в 1997 г., вирус преодолел межвидовой барьер и без предварительной адаптации инфицировал 18 человек с 6 смертельными исходами [42]. Быстрое уничтожение всех домашних птиц в этом районе позволило остановить распространение инфекции. Однако в 2002 г. в Гонконге было отмечено появление нового антигенного варианта вируса H5N1, который в апреле 2005 г. в Китае в районе оз. Цинхай вызвал массовую гибель диких птиц с последующим распространением вируса по всему земному шару [12]. До настоящего времени вирус продолжает циркулировать, заражая и убивая птиц и периодически людей. По данным ВОЗ, уже выявлены 535 случаев инфицирования людей вирусом H5N1, из них 316 со смертельным исходом, и это число постоянно растет [2]. Кроме того, периодически регистрируются случаи инфицирования людей птичьими вирусами подтипа Н7. Так, в 2003 г. в Нидерландах во время наиболее широкомасштабной вспышки птичьего гриппа, вызванного высокопатогенным вирусом R7N7, было инфицировано 89 людей, из которых 1 человек умер [28]. До последнего времени случаи инфицирования людей птичьими вирусами гриппа рассматриваются как зоонозы, однако их высокая патогенность и беспрецедентное распространение по всему миру создают опасность возникновения нового пандемического штамма. Эффективность предотвращения пандемии находится в прямой зависимости от качества применяемых вакцинных препаратов [4, 5, 55]. Большинство лицензированных противогриппозных вакцин являются инактивированными (ИГВ), представляя собой суспензию очищенных инактивированных вирионов (цельновирионная вакцина), разрушенного детергентом вируса (сплит вакцины) или очищенных вирусных поверхностных гликопротеинов (субъединичные вакцины). Лицензирована также живая холодоадаптированная (ХА) вакцина против гриппа (ЖГВ). Основной субстрат для производства вакцин в настоящее время - куриные эмбрионы. Однако в процессе репликации высокопатогенных вирусов гриппа птиц эмбрионы погибают, что создает определенную сложность для производства. Поэтому возникла необходимость разработки новых концепций конструирования вакцинных штаммов и производства вакцин против высокопатогенных вирусов гриппа птичьего происхождения. Первая вакцина против вируса подтипа H5N1 получена на основе низкопатогенного для птиц штамма A/ Контактная информация: Романова Юлия Романовна, канд. биол. наук, вед. науч. сотр.; e-mail: j.romanova@greenhillsbiotech.com 4 Duck/Singapore-Q/F119-3/97 (H5N3), антигенно родственного циркулирующему вирусу H5N1. Субъеди-ничный препарат был произведен на куриных эмбрионах и испытан на волонтерах. Иммуногенность этой вакцины оказалась очень низкой и защитный уровень антител был достигнут только при введении вакцины с адъювантом MF-59 [34]. При этом защитная эффективность вакцины на модели мышей при реинфицировании гетерологичными штаммами достигала 100% даже при введении без адъюванта [53]. При испытаниях ИГВ, приготовленной на основе реассортанта с поверхностными антигенами другого низкопатогенного штамма А/Duck/Primorie/2621/2001(H5N2), уровень гетерологичной защиты составлял лишь 80% [6]. Таким образом, несмотря на возможность заблаговременного производства, что является преимуществом данного подхода, в случае антигенного несовпадения вакцинного и пандемического штаммов, кросс-специфическая защита может оказаться недостаточно эффективной. Второй подход предусматривает генно-инженерную модификацию сайта расщепления гемагглютинина (НА) высокопатогенных вирусов H5N1. Высокая вирулентность этих вирусов для людей, птиц (включая куриные эмбрионы) и других животных определяется наличием множественной последовательности основных аминокислот в месте разрезания НА, что обеспечивает активацию НА различными протеаза-ми, в том числе фурином, присутствующими почти в каждой клетке. Таким образом, репликация высокопатогенных вирусов H5N1 не ограничивается клетками респираторного или желудочно-кишечного тракта, как в случае вирусов гриппа человека или низковирулентных вирусов гриппа птиц, и вирус способен диссеминировать в различные органы. В связи с этим было предложено модифицировать сайт расщепления, удалив часть аминокислот методом обратной генетики. Так, было получено и проверено в клинических испытаниях несколько вакцинных кандидатов, представляющих собой 2:6-реассортанты, приготовленные на основе высокорепродуктивного донора A/ Puerto Rko/8/34(H1N1) (PR8) с НА (модифицированный сайт расщепления) и нейраминидазой (NA) изолированных от людей высокопатогенных вирусов се-ротипа H5N1 [22, 41, 54]. Суммируя результаты проведенных клинических испытаний, можно заключить, что инактивированные вакцины этого типа оказались также недостаточно иммуногенны. Только двукратная иммунизация субвирионной вакциной с двойным количеством антигена (30-45 мкг НА) обеспечивала протективный иммунитет у привитых [9, 47]. При такой эффективности в случае пандемии потребуется в 4 раза больше вакцины, чем обычно при вакцинации сезонными штаммами. Цельновирионная вакцина оказалась более иммуногенной и вызывала защитный уровень нейтрализующих антител уже в дозе 7,5-15 мкг при двойной иммунизации [15], вероятно, за счет адъювантного эффекта содержащейся в ней РНК [18]. Однако недостатком цельновирионных вакцин является повышенный уровень побочных реакциий, особенно часто наблюдаемый у детей [55]. Добавление лицензированных адъювантов (гидроксид или фосфат алюминия) улучшало иммуноген-ность цельновирионных, но не субъединичных вакцин [25, 35]. Применение ряда новых адъювантов, полученных на основе водно-масляных эмульсий, позволило повысить специфичность индуцируемых антител к конформационным эпитопам первой субъединицы НА [26] и иммуногенность субъединичных ШШ-вакцин в целом [8, 32-34, 38]. С целью повышения защитной эффективности вакцин за счет индукции местного иммунитета, в том числе антител класса IgA в мукозе респираторного тракта, проводили исследования интраназального введения ИГВ [49]. В опытах на мышах полной защиты от вирусов H5N1 удалось добиться только при двукратном введении вакцины с адъювантом - термолабильным токсином LT(R192G) E. coli [41]. В клинических испытаниях интраназальной ИГВ, содержащей 7,5 мкг НА (H5N3) и 30 мкг энтеротоксина LTK63, повышение уровня местных IgA-антител отмечено у 47% вакцинируемых при двукратной иммунизации, которая, однако, не вызывала достоверные приросты сывороточных нейтрализующих антител [40]. Необходимо отметить, что при подготовке инактивированных H5N1 вакцин, например из штамма NIBRG-14, отмечалась низкая репродуктивная активность вируса в куриных эмбрионах по сравнению с донором PR8 [22] и низкое содержание НА в получаемом на выходе препарате [20]. Изучение вирусов, содержащих химерный НА, в котором отдельные участки гена Н5 были заменены на соответствующие участки гена НА вируса PR8, позволило предположить, что пониженное содержание НА в препарате очищенного вируса определяется свойствами Н5-белка [19]. Повышение уровня репродукции вируса в куриных эмбрионах наблюдали при включении в состав вириона полимеразы PB1 птичьего вируса [6]. Таким образом, производство необходимого количества доз вакцины для полноценной защиты населения может потребовать значительно больше времени, чем при производстве вакцин из сезонных штаммов вируса гриппа. Еще одна возможность усовершенствования технологии производства вакцин подтипа H5N1 состоит в замене куриных эмбрионов на тканевые культуры. Преимуществом тканевых культур является возможность культивирования летальных для эмбрионов высокопатогенных штаммов, а также независимость производства от наличия большого количества свободных от патогенов куриных эмбрионов, что особенно актуально в случае пандемии птичьего вируса гриппа. Две клеточные линии - MDCK и Vero уже лицензированы в отдельных странах для производства ИГА - Novartis (Швейцария) и Baxter (Австрия). Клинические испытания ШШ-вакцины, произведенной на культуре клеток Vero из немодифицирован-ного высокопатогенного штамма А/Vietnam/1203/04, показали ее безопасность и иммуногенность, схожие с аналогичными свойствами классических Н5-препаратов [15]. В стадии разработки находится полностью охарактеризованная и стандартизованная клеточная линия человеческого происхождения PER. C6® [29]. Однако клинические испытания вакцины, произведенной на линии клеток PER.C6® из штамма с поверхностными антигенами высокопатогенного вируса серотипа H7N1, показали очень низкую иммуно-генность препарата [13]. В последнее время ведется усиленная работа, чтобы обеспечить возможность получения антигенов вируса гриппа экспрессией в клетках насекомых, 5 растений или грибов. Данный подход является безопасным и позволяет произвести вакцину достаточно быстро в необходимом количестве, поэтому выбор оптимального антигена может быть отложен до проявления более четкой эпидемиологической ситуации. Рекомбинантные белки - это высокоочищенные продукты и полученные на их основе вакцины менее ре-актогенны. Высокая эффективность данной системы позволяет произвести большое количество вакцины в короткие сроки. Кроме того, использование рекомбинантной технологии дает возможность контролировать сиквенс гена НА и избежать нежелательные адаптационные мутации. Рекомбинантная вакцина, состоящая из НА вируса A/Hong Kong/156/97(H5N1), экспрессированного в клетках насекомых Sf9, была одной из первых пандемических вакцин, испытанных на волонтерах. Испытания показали, что только двукратная иммунизация в дозе 90 мкг НА приводила к 4-кратным приростам нейтрализующих антител у 50% привитых [48]. Повышение иммуногенности препаратов рекомбинантного Н5 НА было отмечено в экспериментах на мышах при использовании для иммунизации НА олигомеров вместо тримеров [52] или химерных молекул эктодомена НА с пришитым фрагментом IgG2a-Fc. Причиной усиления иммуно-генности, вероятно, является дополнительная активация Fcy-рецепторов [56]. Одновременная экспрессия нескольких вирусных белков, например НА и М вируса гриппа, может приводить к образованию вирусоподобных частиц (ВПЧ). Полученные с помощью бакуловируса в клетках насекомых ВПЧ имеют округлую форму и морфологически похожи на вирионы. Преимуществом ВПЧ является презентация антигенов в нативной конформации, а также стимуляция эффективного захвата антигена дендритными клетками [11]. Недостатком ВПЧ является сложный и пока несовершенный процесс очистки от клеток Sf9, клеточных составляющих и остаточного бакуловируса, который инактивируют Р-пропиолактоном. Помимо бакуловируса, ВПЧ также могут быть получены на основе нереплицирую-щегося кора ретровируса лейкемии мышей. Подобные ВПЧ, содержащие HA, NA и M2 вируса гриппа подтипов Н5Ш и Н7Ш, вызывали высокие титры нейтрализующих антител у мышей [45]. В доклинических испытаниях ВПЧ активировали Т- клеточный иммунный ответ 1 типа и превосходили препараты рекомбинантного НА подтипа Н5 по иммуногенности и протективной эффективности при реинфицировании гетерологичным штаммом [10]. Клинические испытания (фаза I) вакцины H5N1 на основе ВПЧ показали ее безопасность и относительно высокую иммуноген-ность. При двукратном введении относительно малой дозы (20 мкг НА) без адъюванта вакцина удовлетворяла 2 из 3 критериев CPMP (European Committee for Proprietary Medicinal Products) [17, 31]. Мечтой исследователей остается создание универсальной вакцины против гриппа, которая могла бы вызывать защиту на многие годы от любого возможного варианта вируса. Наиболее разработан подход. основанный на использовании высококонсервативного эктодомена белка М2 вируса гриппа, который в незначительном количестве представлен на поверхности вирусной частицы, но обильно синтезируется в инфицированной клетке. Недостаток этого подхода состоит в том, что антитела к М2-белку не нейтрализуют вирус, а только способствуют элиминации инфицированных клеток, что определяет более слабый защитный эффект по сравнению с эффектом лицензированных вакцин. В доклинических испытаниях вакцинного препарата на основе M2e была продемонстрирована защита мышей только от гибели, но не от реинфицирования летальными вирусами H5N1 [57]. Изучается возможность включения нескольких доменов М2е различных штаммов в липосомы, что может повысить защитный эффект препарата [16]. Еще одно направление представляют ДНК-вакцины. С точки зрения производства, ДНК-вакцины обладают всеми преимуществами рекомбинантных вакцин: простотой производства, экономичностью, безопасностью, контролем нуклеотидной последовательности антигена. Кроме того, экспрессия антигена осуществляется в клетках организма, что способствует его презентации в MHC-I-комплексе и выработке CTL-клеточного ответа [51]. Недостаточно изученным остается вопрос безопасности вакцин, связанный с возможной интеграцией целевой ДНК в геном клетки хозяина. В испытаниях на мышах ДНК-вакцина, несущая ген НА Ш-сероподтипа, проявила слабую иммуногенность даже после повторного введения, но защищала 100% животных от летальной реинфекции [27]. Ограниченные клинические испытания Ю-ДНК-вакцины также показали ее низкую иммуногенность в отношении индукции антигемагглютинирующих антител (только 50% ответчиков после двукратного введения в дозе 1 мг с адъювантом), однако положительную индукцию длительного T-клеточного ответа у 75-100% вакцинированных [39]. Ведется также разработка векторных вакцин. По сравнению с ДНК-вакцинами они обеспечивают более эффективную доставку и длительную экспрессию целевой ДНК в клетках. В доклинических испытаниях протестированы Ю-векторные вакцины на основе дефектного по репликации аденовируса, поксвируса, вируса болезни Ньюкасла, альфа-вируса [23, 44, 50]. Вакцина на основе аденовирусного вектора, несущего ген НА Н5, обеспечивала эффективную защиту мышей, предотвращая размножение гетерологичного вируса после двух внутримышечных иммунизаций [21]. Живые аттенуированные вакцины принципиально отличаются от инактивированных, индуцируя местный и клеточный иммунитет. Иммунизация живыми вакцинами вызывает более длительную защиту не только против вакцинного штамма, но и против антигенных вариантов того же сероподтипа [7]. Кроме того, живая вакцина также эффективна при вакцинации детей и лиц, не контактировавших ранее с гриппом, уже после однократной иммунизации [1]. Эти преимущества обеспечивают возможность значительно скорее защитить население в случае пандемии. Существенным недостатком живых вакцин является длительная репродукция отдельных вакцинных штаммов в респираторном тракте людей, которая может привести к нежелательному распространению вакцинного вируса или его генетического материала в популяции людей. Результаты испытаний живой ХА вакцины, подготовленной из вирусов гриппа сероподтипа Н5, дали противоречивые результаты. В доклинических исследованиях на хорьках вакцинных кандидатов, полученных на основе донора A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) и 6 содержащих поверхностные антигены вирусов H5N1 A/Vietnam/1203/04 или A/Hong Kong/213/03, показана их иммуногенность (после двукратной вакцинации), несмотря на слабую репродукцию вируса в верхнем отделе респираторного тракта животных [43]. Однако при иммунизации волонтеров выявлено почти полное отсутствие репродукции вируса в респираторном тракте и очень слабый иммунный ответ у большинства привитых [24]. Другая ХА-вакцина, приготовленная на основе донора А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), содержащая НА низкопатогенного птичьего штамма A/Duck/Potsdam/1402-6/86(H5N2), показала значительно более высокую иммуногенность после однократного введения мышам [3]. При иммунизации людей вакцинный штамм интенсивно реплицировался в верхнем отделе респираторного тракта привитых (до 11 дней) и вызывал прирост антител у 31% вакцинируемых [37]. Промежуточное положение занимают результаты испытаний ХА-вакцины на основе A/Ann Arbor/6/60 с поверхностными антигенами низкопатогенного вируса подтипа H7N3, в которых отмечено умеренное выделение вируса привитыми и прирост антител у 14% вакцинированных после однократной и у 62% после двукратной иммунизации [46]. Причины таких различий в иммуногенности живых вакцин до настоящего момента не выяснены. Представляет интерес новый тип живой интрана-зальной вакцины, предусматривающий объединение сильных сторон живой и инактивированной вакцин. Этот подход основан на производстве аттенуированных штаммов, дефектных по репродукции в интерфе-ронкомпетентных клетках за счет удаления открытой рамки считывания белка NS1 [14]. В доклинических испытаниях на мышах и макаках показана безопасность и полная кросс-специфичная защитная эффективность delNS-вакцинного штамма, полученного из вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Несмотря на полное отсутствие репликации, вакцина вызывала сероконверсию у 100% макак уже после однократной иммунизации. На мышиной модели иммуногенность была гораздо ниже [36]. Улучшить иммуногенность вакцины удалось путем повышения стабильности трехмерной структуры вирусного НА за счет введения точечной мутации (K58I) во вторую субъединицу НА [30]. В заключение стоит отметить, что для профилактики высокопатогенного гриппа птичьего происхождения разработано и апробировано большое количество классических, а также абсолютно новых типов вакцин. Однако проблема низкой иммуногенности данных вакцин остается нерешенной. Если учесть, что высокопатогенные вирусы продолжают циркулировать до настоящего момента среди диких водоплавающих птиц и периодически инфицировать людей, исследования в данной области по-прежнему актуальны.