Etiology of Fatal Pneumonia Caused by influenza A(H1N1)pdm2009 Virus during the Pandemic in Russia

Full Text

В середине апреля 2009 г. после 40-летнего периода эпидемической активности вирусов гриппа типа А сотрудниками Центров по контролю за заболеваемостью и профилактике (CDC&P), Атланта, США, были детектированы 2 случая инфицирования новым для человека вирусом гриппа A(H1N1)pdm2009, представлявшим собой реассортант вирусов гриппа свиней A(H1N1), циркулирующих на Евроазиатском и Американском континентах. Новый вирус достаточно быстро распространился по странам и континентам, что стало основанием для экспертов ВОЗ объявить 11 июня 2009 г. шестой, самый высокий, уровень пандемии [11]. Усиление эпидемиологического надзора за случаями гриппа и ОРВИ в нашей стране, особенно у лиц, прибывающих из стран, наиболее вовлеченных в эпидпро-цесс, позволило детектировать первый случай заболевания россиянина, прибывшего из США 21 мая 2009 г., а первый тяжелый случай инфекции, закончившейся летально, - в конце августа 2009 г. [4, 5, 7]. Периоды пиковой активности пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm2009 в ноябре 2009 г. и Контактная информация: Лаврищева Валентина Владимировна, мл. науч. сотр.; e-mail: chohla@gmail.com 17 феврале 2011 г. сопровождались увеличением числа случаев тяжелых форм инфекции с развитием пневмонии с летальным исходом. По официальным данным Минздравсоцразвития России, в 2009-2011 гг. было зарегистрировано 1943 летальных случая, причиной которых чаще всего была инфекция A(H1N1) pdm2009. В ЦЭЭГ ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России были изучены материалы от 161 пациента с летальной пневмонией и в результате выявлены штаммы с измененной рецепторной специфичностью и молекулярными маркерами высокой патогенности [6]. В продолжение начатых исследований определенный интерес представляла оценка возможной роли других вирусных и бактериальных инфекций в этиологии тяжелых пневмоний с летальным исходом. Материалы и методы Клинический материал. В работе использованы 10% супернатанты гомогенизированного секционного материала (ткани трахеи, бронхов, легких) с лабораторно подтвержденной РНК вируса A(H1N1)pdm2009 в ОТ-ПЦР в реальном времени. Изоляцию вирусов гриппа проводили на перевиваемой клеточной линии почки собаки (MDCK) и в полости 9-11-дневных развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) [6]. Антигенные свойства изучали с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА) по общепринятой методике с диагностическими сыворотками к референс-штамму А/California/07/2009(H1N1) и первому российскому штамму АIIV-Moscow/01/2009/ (H1N1)swl, полученными в НИИ вирусологии им Д.И. Ивановского. Индикацию РНК вирусов гриппа в первичных пробах методом ОТ-ПЦР в реальном времени проводили с использованием следующих тест-систем: «Ампли-сенс Рибо-ПРЕП», «Амплисенс Реверта-L”, “Ампли-Сенс Influenza virus A/B-FL”, “АмплиСенс® Influenza virus А/Ш-swine-FL”, (из “Интерлабсервис”, Москва). Амплификацию и секвенирование фрагментов гемагглютинина в первичных пробах, а также секве-нирование генома из выделенных штаммов выполняли согласно методикам, описанным ранее [5]. Индикацию возбудителей ОРВИ и бактериальных возбудителей ОРЗ в первичных пробах проводили с использованием тест-систем «АмплиСенс ® ОРВИ-скрин-FL» (респираторно-синцитиального вируса, метапневмовируса, вирусов парагриппа типов 1, 2, 3 и 4, коронавирусов, риновирусов, аденовирусов групп B, C, E и бокавируса), «АмплиСенс® Enterovirus-FL» (энтеровирусов), «АмплиСенс Mycoplasma pneumoniae/ Chlamydophila pneumoniae-FL» (Mycoplasma pneumoniae и Chlamydophila pneumoniae), «АмплиСенс Streptococcus spp.-Eph» (Streptococcus spp.), «Ам-плиСенс® Legionella pneumophila-FL» (Legionella pneumophila) (из «Интерлабсервис», Москва). Результаты и обсуждение Известно, что гриппозная инфекция может осложниться как первичной вирусной пневмонией, так и вторичной бактериальной пневмонией. Как показало изучение материала вскрытия жертв предыдущих пандемий, причиной большинства случаев смерти послужило то, что инфекция вирусом гриппа типа А была осложнена бактериальной пневмонией [12]. Во время пандемии 1918-1919 гг., когда не использовались антибактериальные препараты для лечения пневмонии, гистологические и бактериологические исследования свидетельствовали о том, что случаи смерти от гриппа чаще всего были обусловлены развитием вторичной бактериальной пневмонии [16]. Большинство исследователей считали, что между 1890 и 1950 г. летальные случаи гриппа были связаны с развитием полибактериальной инфекции, этиологическим агентом которой служили микроорганизмы с низкой патогенностью (такие как Bacillus influenzae), действовавшие совместно с пневмококками и стафилококками. Исследования на моделях лабораторных животных (хорьках, мышах, крысах), проводимые в 40-х годах XX столетия, показали, что вирус гриппа в сочетании с любым микроорганизмом, поражающим легкие, действует синергично и вызывает более высокую заболеваемость и смертность. В настоящую работу включены результаты применения вирусологических и молекулярно-генетических методов исследования секционного материала (ткань легкого) от 61 пациента с диагнозом «пневмония», поступившего в ЦЭЭГ Института вирусологии им. Д.И. Ивановского в сезонах 2009-2010 гг. (44 образца) и 2010-2011 гг. (17 образцов). Подавляющее большинство материалов (86,9%) направлено в ЦЭЭГ из лабораторий европейской части России, остальные 13,1% были переданы из учреждений, расположенных на Урале. Анализ данных в распределении по возрасту, полу и сопутствующим заболеваниям выявил некоторые особенности, которые, возможно, могли послужить отягощающими факторами течения гриппозной инфекции. Частота регистрируемых случаев пневмоний с летальным исходом в разных возрастных группах не различалась между двумя эпидемическими сезонами (см. рисунок). Средний возраст умерших пациентов составил 39,2 ± 14,7 года. Наибольшее количество летальных случаев наблюдали среди пациентов 18-49 лет (77% от числа обследован- 50-, 45- 40- Л 35- Ц У 30- ίϊ" 25я Q. П 20- О OQ 15- 10- 5- 0- 2000-2010 гг. 2010-2011 гг. Всего Эпидемические сезоны Ц 0-4 года Ц] 5-17 лет □ 18-49 лет H 50-64 года Ц от 65 лет и старше Распределение летальных случаев по возрастам. 18 Таблица 1 Антигенная характеристика штаммов пандемического вируса гриппа, выделенных в ЦЭЭГ из секционного материала в РТГА Штамм A/IIV Moscow/01/09 (H1N1)swl A/California/ 7/09(H1N1)swl Последовательность аминокислот в позиции 222 гемагглютинина A/IIV-Vladimir/35/2011 (H1N1)v 1/4 1/2 G/N (GGT/AAT) A/IIV-N.Novgorod/41/2011 (H1N1) v 1/4 1/2 D/G (GAT/GGT) A/IIV-Bryansk/54/2011 (H1N1)v 1 1 D (GAT) A/IIV-Vladimir/69/2011 (H1N1)v 1 н/и D/G (GAT/GGT) A/IIV-Vladimir/67/2011 (H1N1)v 1 н/и D (GAT) A/IIV-Vladimir/68/2011 (H1N1)v 1/8 1/8 D (GAT) A/IIV-Mary-El/182/09 (H1N1)swl 1/4 1 G/N (GGT/AAT) A/IIV-Mary-El/178/09 (H1N1)swl 1/2 1 G/N (GGT/AAT) A/IIV-Mary-El/177/09 (H1N1)swl 1 A G/N (GGT/AAT) A/IIV-Mary-El/180/09 (H1N1)swl 1/8 A G/N (GGT/AAT) Примечание. н/и - не исследовали. Таблица 2 Результаты тестирования секционного материала на наличие вирусных и бактериальных инфекций Город, республика Количество материалов Выявление инфекционной РНК и ДНК методом ПЦР Выде ление Результаты молекулярнов эпидемическом сезоне грипп А и В ОРВИ виру генетических исследова ний 2009-2010 2010-2011 + - + - сов Москва 8 2 1 9 1 9 0 н/и Новгород - 1 0 1 0 1 0 н/и Владимир 6 6 12 0 2 10 4 3/6* Ярославль 1 3 3 1 1 3 0 н/и Пенза - 1 1 0 0 1 0 н/и Оренбург 8 - 4 4 1 7 0 1/3 Тула 1 - 1 0 0 1 0 0/1 Удмуртия 3 - 3 0 0 3 0 н/и Тверь 6 - 6 0 1 5 0 2/3 Брянск 2 2 3 1 0 4 1 0/1 Марий Эл 9 - 9 0 6 3 4 9/9 Нижний Новгород - 2 2 0 0 2 1 1/1 Всего ... 44 17 45 16 12 49 10 16/24 Примечание. * - количество мутантов/количество исследованных материалов; н/и - фрагмент гемагглютинина исследовать не удалось. ных), тогда как среди детей в возрасте 0-4 и 5-17 лет было зарегистрировано только по 1 (1,6%) случаю, среди взрослых 50-64 лет - 10 (16,4%) случаев, пациентов старше 65 лет - 2 (3,3%) случая. Самому младшему пациенту было 2,8 года, самому старшему - 72 года. Среди обследованных 50,8% составляли женщины, причем 19,3% из них были беременными на разных сроках гестации. Различные сопутствующие заболевания и состояния имели 34,4% умерших пациентов из числа обследованных. Ожирением страдали 11,5% обследованных, заболеваниями сердечно-сосудистой системы - 8,2%, болезнями почек - 4,9%, печени - 3,3% всех обследованных. Были также зарегистрированы такие сопутствующие заболевания как сахарный диабет, хронические заболевания дыхательной системы (например, ХОБЛ), миеломная болезнь и хроническая алкогольная интоксикация. На долю этих патологий приходилось по 1,6%. Длительность заболевания составила в среднем 8,4 ± 5,1 дня. Максимальная длительность заболевания была отмечена у беременной пациентки из Владимира - 25 дней, минимальная (2 дня) была зарегистрирована у нескольких пациентов. В 70,5% секционных материалов, включенных в данное исследование, было подтверждено наличие РНК пандемического штамма вируса гриппа A(H1N1)pdm09, в 1,2% была обнаружена РНК вируса гриппа В. Все поступившие в ЦЭЭГ материалы были взяты на выделение вирусов в чувствительных системах культуры клеток MDCK и РКЭ. Было изолировано 10 штаммов вируса пандемического гриппа A(H1N1)pdm09, 4 из них были выделены в эпидемическом сезоне 2009-2010 гг., 6 - в сезоне 2010-2011 гг. Следует отметить, что в эпидемическом сезоне 2009-2010 гг. изоляция штаммов из секционного материала была более эффективна в системе РКЭ, тогда как в сезоне 20102011 гг. - в культуре клеток MDCK. Ни одного штамма вируса гриппа типа В из секционного материала изолировать не удалось. При изучении антигенных свойств большинство выделенных штаммов были близкородственны эталону A/ Califomia/7/09(H1N1)swl; изоляты реагировали со штаммоспецифической сывороткой от 1 до A гомологичного титра. Исключение составляет штамм A/nV-Vladimir/68/2011(H1N1)v, в отношении которого регистрировали снижение ингибирующей активности референс-сывортками до 1/8 гомологичного титра (табл. 1). Молекулярно-генетическими методами изучены 24 материала из 61. При анализе нуклеотидных последовательностей установлено, что описанные в литературе мутации в рецепторсвязы-вающем сайте субъединицы HA1 гемагглютинина в положении 222 имели место в 66,6% случаев. Это совпадает с литературными данными. В материале сезона 2009-2010 гг. мутация D222G (замена аспарагиновой кислоты на глицин) обнаружена в 16,6% случаев, D222N (аспарагиновая кислота на аспарагин) - в 23,5%, D222E (аспарагиновая кислота на глутаминовую кислоту) - в 4,2%, смесь мутантов - в 25% случаев; в материале эпидемического сезона 2010-2011 гг. мутанты пандемического гриппа с заменами D222G обнаруживали в 8,4%, а смесь мутантов - в 4,2% случаев [3]. 19 При исследовании ткани легких от умерших больных выявлено наличие коинфекции только в 12 (19,7%) случаях с летальной пневмонией (табл. 2). В 1 (8,3%) случае в материале была обнаружена ДНК бокавируса и в 2 случаях - ДНК аденовируса. РНК парагриппа типов 2 и 4 тоже обнаружили только в 1 случае, причем парагриппозная инфекция, вызванная вирусом типа 4, осложняла течение инфекции, вызванной пандемическим штаммом вируса гриппа, а в другом случае вирус парагриппа типа 2 был обнаружен вместе с инфекцией вирусом гриппа типа В. Бактериальная коинфекция, вызванная стрептококком, была детектирована только в 1 случае, что, по-видимому, объясняет быстрое течение пневмонии у умершего пациента (7 дней). У 6 умерших пациентов из Республики Марий Эл в ткани легкого была обнаружена РНК риновируса. Бокавирус человека, вероятно, является важной причиной острых инфекций верхних и нижних дыхательных путей у детей младшего возраста [1]. Частота выявления бокавируса в составе микстинфекций ОРВИ, по данным исследователей из разных стран мира, варьирует от 10 до 90%. По мнению авторов, высокая частота встречаемости бокавируса человека в составе сочетанных инфекций может быть обусловлена сохранением вируса в респираторном тракте после недавно перенесенной острой HBoV-инфекции. Высказано также предположение, что большой процент микстинфекций может свидетельствовать о реактивации вируса или усилении его детекции другими респираторными вирусами [13]. Влияние бокавируса на течение гриппозной инфекции оценить невозможно потому, что в настоящее время патогенез бокавируса человека изучен недостаточно. Исследователи предполагают, что аденовирусы могут выступать в роли сенсибилизаторов, способствующих возникновению аллергической реакции на другие вирусы или бактерии [8]. Наряду с этим аденовирусы способны проникать в нижние дыхательные пути, размножаться в эпителии слизистой оболочки бронхов и альвеол и вызывать пневмонию. На основании имеющихся в настоящее время данных можно утверждать, что в патогенезе аденовирусной инфекции ведущее значение имеет поражение слизистых оболочек дыхательного тракта, нарушение деятельности вегетативной и эндокринной систем с последующими сосудистыми расстройствами и глубокими нарушениями обмена (белкового, минерального, кислотно-щелочного и витаминного) [8], что наряду с поражением сосудистой системы, возникающим в результате токсического действия вируса гриппа и проявляющимся повышением проницаемости сосудов, ломкостью их стенок и нарушением микроциркуляции [9], могло привести к утяжелению течения заболевания. Парагриппозная инфекция занимает одно из первых мест в респираторной патологии детей и в меньшей степени - взрослых. Характерным для па-рагриппозной инфекции является также вовлечение в процесс нижних дыхательных путей, где развиваются бронхиты, наблюдавшиеся, по данным Е. С. Кетиладзе (1965), у 13,5% взрослых и 17,5% детей, а также пневмонии, часто осложняющие парагриппоз-ную инфекцию [8]. Такие характерные для патогенеза парагриппа явления, как отек и набухание слизистой оболочки гортани и бронхов возможно могли послужить предрасполагающим фактором развития тяжелой гриппозной пневмонии. Хотя, по литературным данным, при неосложненных формах парагриппа чаще всего идентифицируют серотип 2 вируса, при поражении нижних дыхательных путей - 1 и 3, а серо-тип 4 встречается редко [2], в данном исследовании были обнаружены вирусы серотипов 2 и 4. Данное явление вероятно связано с тем, что оба случая па-рагриппозной инфекции были идентифицированы у беременных женщин. Однако данный вопрос требует дальнейшего изучения. Нет никаких оснований полагать, что сочетанное инфицирование риновирусом и гриппом может привести к утяжелению инфекции и летальному исходу, так как для риновируса характерно поражение эпителия верхних дыхательных путей. Инфицирование риновирусом 4 пациентов из Марий Эл можно объяснить как возможным развитием внутрибольничной инфекции с участием данного возбудителя, так и тем, что материалом для исследования в этих случаях служила ткань и легкого, и трахеи. Вторичная бактериальная пневмония - частая причина смерти от сезонного гриппа. Поскольку пандемия - сравнительно редкое явление, существует много данных о бактериальной инфекции, связанной с сезонными штаммами гриппа А. Коинфекция была обнаружена примерно в 25% летальных случаев гриппозной инфекции [17]. S. pneumoniae является самым распространенным возбудителем внебольничной пневмонии и бактериальной коинфекции при гриппе. Ретроспективные исследования связанной с гриппом педиатрической смертности в США показали, что в сезоне 2003-2004 гг. S. aureus был изолирован в 46% случаев [10]. В исследованиях, проведенных в Новой Зеландии [14], установлено, что в 15% случаев внебольничной пневмонии, осложнившей течение ОРВИ, присутствует вирусно-бактериальная инфекция. Совместно с инфекцией, вызванной штаммами вируса гриппа типа А, чаще всего обнаруживали S. pneumoniae (67%) и H. influenzae (11%), однако в 22% случаев были обнаружены нетипичные микроорганизмы (Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila). Случаи инфицирования стрептококками группы А были немногочисленны, и вирусную коинфекцию обнаруживали крайне редко. Наиболее часто вместе с гриппом встречалась инфекция, вызванная аденовирусом и респираторносинцитиальным вирусом [15]. Суммируя полученные результаты, можно сделать вывод, что появление и активное распространение нового штамма вируса гриппа A(H1N1)pdm09 определило особенности вовлеченности в пандемию 2009 2010 и 2010-2011 гг. возрастных групп населения, а также утяжеление клинического течения заболевания. В группе особо высокого риска оказались лица в возрасте 18-49 лет, пациенты с сопутствующими заболеваниями (особенно с ожирением и сердечнососудистой патологией) и беременные женщины. В подавляющем большинстве случаев летальной пневмонии этиологическим агентом был вирус гриппа и лишь менее чем в 20% случаев у пациентов была обнаружена вирусная или бактериальная коинфекция. Именно поэтому в период эпидемических подъемов 20 заболеваемости необходимо проведение ранней этиологической диагностики и назначение своевременного лечения с помощью этиотропных препаратов, в спектре которых эффективными являются арбидол, ингавирин, озельтамивир (ТамифлюТМ) и занамивир (РелензаТМ).

References

Supplementary files