Genetic Diversity and Molecular Evolution of the Influenza A Viruses in Russia during 2006-2012

Full Text

Грипп является заболеванием, вызываемым вирусом, постоянная эволюция которого приводит к непрекра-щающимся ежегодным эпидемиям. В основе эволюции вирусов гриппа лежит накопление мутаций, вызывающих антигенный дрейф и возникновение новых вариантов вируса, что обеспечивает гетерогенность вирусной популяции и лежит в основе формирования различных генетических линий [8]. На протяжении последних десятилетий отмечается динамическое преобладание определенных филогенетических линий вирусов гриппа, связанное с их географическим распространением. Особенности генетической структуры позволяют вирусу гриппа эволюционировать путем реассортации геномных сегментов различных штаммов [13]. Появление в 2009 г. нового пандемического штамма вируса гриппа А H1N1pdm2009 подтвердило потенциал эволюционных возможностей вируса гриппа. Настоящая работа посвящена молекулярной эволюции вирусов гриппа А, циркулировавших в России начиная с 2006 г. Материалы и методы В работе использовали более 280 штаммов вирусов гриппа А, выделенных из клинического материала (мазки из носоглотки и зева, бронхоальвеолярный лаваж, секционный материал) в лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития России. Секвенирование. Выделение РНК проводили с использованием коммерческих наборов RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия). Обратную транскрипцию РНК выполняли с помощью набора Реверта-L («Интерлаб-сервис», Россия). Амплификацию кДНК осуществляли стандартным методом с использованием оригинальных праймеров. Секвенирование фрагментов генома вирусов гриппа А (генов НА, NA, М, NS и NP) проводили на приборе ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США) с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1. Филогенетический анализ. Обработку и анализ последовательностей осуществляли с помощью программы Vector NTI v10.1.1 («Invitrogen») и MEGA 5 (PSU, США). Для построения филогенетических древ использовали метод максимального правдоподобия (ML). Выбор эволюционной модели осуществляли по значению критерия Акаике (AIC) с помощью программы ModelTest v3.7 [12]. Для поиска сайтов положительной селекции использовали алгоритм SLAC [7]. представителей клады 2С - мутаций S36N, K82R, R145K, R188M, А189Т и Т193К. Различия в антигенной структуре представителей этих двух клад, по-видимому, обусловлены мутациями в антигенных сайтах Са2 (K145R), СЪ (K82R) и Sb (Т193К). Штаммы клады 2В 2008-2009гг. отличались от вы- ■A/Khabarovsk/39/2009 ■ A/Moscow/37/2009 -A/Moscow/08/2009 I A/Khabarovsk/36/2009 ■ A/Khabarovsk/04/2009 ■ A/Khabarovsk/16/2009 ■A/Khabarovsk/01/2009 551-A/Saint-Petersburg/66/2009 A/Ulan-Ude/04/2009 A/Irkutsk/08/2009 - A/Vladivostok/84/2008 А189Т G185A - » S141N ■ ■> 52 A/Vladivostok/86/2008 56' A/Vladivostok/85/2008 A/Saint-Petersburg/86/2008 H A/Samara/94/2008 A/Samara/78/2008 52'A/Samara/60/2008 A/Kaliningrad/26/2008 A/Saint-Petersburg/71/2008 - A/Saint-Petersburg/87/2008 A/Saint-Petersburg/04/2008 — A/Saint-Petersburg/76/2008 A/Saint-Petersburg/72/2008 63'-A/Tula/31/2008 A/Astrakhan/16/2008 A/Astrakhan/14/2008 -A/Rostov-na-Donu/01/2008 A/Astrakhan/72/2008 A/Moscow/117/2008 A/Voronezh/21/2008 A/Moscow/121/2008 A/Tula/55/2008 82 >- A/Tula/53/2008 2B £ D3SN K145R R188K r. j—; П_Г A Я? I - A + A/Brisbane/59/2007 A/Kaliningrad/02/2008 A/Kaliningrad/15/2008 A/Chelyabinsk/10/2008 A/Moscow/04/2008 -A/Astrakhan/09/2008 -A/Novosibirsk/09/2009 I— I— 851 |-A/C I47K E68G K82R 97 — A/Khabarovsk/15/2009 I, A/Khabarovsk/08/2009 sin A/Khabarovsk/03/2009 -A/Vladivostok/83/2008 A/Khabarovsk/515/2007 A/Rostov-na-Donu/03/2007 hny Novgorod/03/2007 A/Moscow/16/2007 A/Astrakhan/23/2007 K140E R188M T193K 90 S36N A189T 76 2C Т82К Y94H R14SK R208K R145K I— M/r\OS ^jr A/Nizh 6Ц A/Mo: fifil— A/A A/Khabarovsk/33/2006 A/Khabarovsk/02/2006 A/Chelyabinsk/01/2006 -A/Saint-Petersburg/07/2006 — A/Saint-Petersburg/06/2006 A/Khabarovsk/21/2006 K73R K140E ^A/Solomon lslands/03/2006 2A ■ A/Krasnoyarsk/29/2005 A/Novosibirsk/05/2005 ■A/Florida/03/2006 ■ A/Nizhny Novgorod/210/2006 Y2S2F I—М/ГЮПС ^irA/l' 7ol- i ■ A/Moscow/50/2006 70'-A/Ryazan/13/2006 >A/New Caledonia/20/1999 -1 Рис. 1. Филогенетическое древо по гену гемагглютинина вируса гриппа А подтипа H1N1. Здесь и на рис. 2 и 3: древо построено методом максимального правдоподобия (ML), эволюционная модель GTR+G. Бутстреп-анализ 1000 репликаций. Знаком ♦ отмечены вакцинные штаммы. Результаты и обсуждение С целью изучения генетического разнообразия и особенностей молекулярной структуры вирусов гриппа А, циркулирующих на территории Российской Федерации в эпидемические сезоны 2006-2012 гг., нами была проанализирована охарактеризованная по антигенным свойствам репрезентативная выборка штаммов вирусов гриппа А. Вирус гриппа А подтипа H1N1. В 2006-2007 гг. в России циркулировали вирусы гриппа А подтипа H1N1, относящиеся к двум генетическим группам - клайдам 1 и 2. Штаммы, относящиеся к кладе 1, были подобны вакцинному штамму А/Новая Каледония/20/1999 (рис. 1). Вирусы, содержащие характерные замены Т82К, Y94H, R145K, R208K, R225K в гемагглютинине (НА) и V234M, D382N в нейраминидазе (NA), являлись эволюционным продолжением вирусов клады 1 и формировали генетически гетерогенные группы вирусов клады 2. На территории РФ в этот период практически не отмечена циркуляция вирусов гриппа А клады 2А, подобных вакцинному штамму А/Соломоновы 0строва/3/06. Вирусы, циркулировавшие в России в этот период, образовывали обособленную группу и явились предшественниками вирусов клады 2С, появившихся в 2007 г., с характерными заменами S36N, А189Т в НА и S82K, M1881 в NA. В 2007 г. на территории РФ была отмечена незначительная циркуляция вирусов гриппа A (H1N1), подобных штамму А/Брисбен/ 59/07 (клада 2В). В эпидемический сезон 20082009 гг. в России грипп был вызван преимущественно вирусами, близкими к вакцинному штамму А/Брисбен/59/2007, относящимися к кладе 2В. Преобладание вирусов клады 2В среди вирусов гриппа A (H1N1) было характерно не только для России, но и для всего мира [6]. Среди исследованных нами штаммов выделенных на Дальнем Востоке и в Сибири, были также обнаружены представители клады 2С (А/Владивосток/83/08, А/ Хабаровск/3/09, А/Новосибирск/9 /09 и др.), которые интенсивно циркулировали в Азиатско-Тихоокеанском регионе [6]. Нами было показано, что для НА российских представителей клады 2В характерно наличие мутаций D35N, R188k, K145R, а для Рис. 2. Филогенетическое древо по гену гемагглютинина вируса гриппа А подтипа H1N1pdm2009. Жирным шрифтом отмечены референс-штаммы генетических групп (i-vii). деленных ранее представителей этой клады заменой А189Т. В последовательности НА представителей клады 2В нами было выявлено 2 кодона, находящихся (с вероятностью более 95%) под действием положительного отбора (кодоны 186 и 227). По данным рентгеноструктурного анализа остаток 186 входит в состав рецепторсвязывающего сайта НА (спираль 190), предположительно участвуя в образовании водородной связи с сиалопентасахаридом [9, 14]. i-iv - генетические группы. Для последовательностей NA штаммов клады 2В характерны мутации G249K и T287I, а для штаммов клады 2С-мутации Ml881, I267M, L367I. Мутации M1881, G249K, T287I и L367I расположены в так называемых филогенетически значимых областях D, F, Н и L соответственно. Известно, что область L в N1 является антигенным сайтом [4]. Большая часть последовательностей N1 штаммов клады 2В имели мутацию устойчивости к озельтамивиру H275Y, однако имеющие эту мутацию штаммы не образовывали отдельную филогенетическую группу в пределах клады 2В. Среди представителей клады 2С устойчивые к озельтамивиру штаммы не выявлены. Среди штаммов клады 2В не был обнаружен ни один штамм, имевший мутацию, определяющую устойчивость к ремантадину (S31N) в М2, в отличие от представителей клады 2С, устойчивых к этому препарату. Рис. 3. Филогенетическое древо по гену гемагглютинина вируса гриппа A подтипа H3N2. Исследованные представители клады 2С несли в последовательности белка Ml замену S207N, характерную для штаммов вируса гриппа А подтипа H5N1 цинхайской группы [Qinghai-like, например A/bar-headed goose/Qinghai/12/2005 (H5N1)]. Однако какова возможная роль данной замены в белке M1 вируса гриппа A (H1N1) человека, остается неясным. Известно, что мутации в С-концевом домене белка M1 могут возникать при адаптации вируса к мышам и связаны с повышением патогенности вирусов гриппа А [11]. Эпидемия гриппа A/H1N1pdm2009 в России началась в середине сентября 2009 г. и носила моноэтиологи-ческий характер. В эпидемическом сезоне 2010-2011 гг. вирусы гриппа A/H1N1pdm2009 также доминировали. Популяция штаммов была генетически однородна и эволюционно связана с пятью филогенетическими группами [15] доминирующей в мире клады 7 с характерной заменой S203T в НА (рис. 2). Все вирусы, кроме относящихся к кладе 1, содержали в НА замену P83S. Примечательно, что данные штаммы имели остаток валина в положении 321, которое находится вблизи сайта расщепления молекулы НА. Однако у значительного числа российских изолятов 2009 г. наблюдалась реверсия V321I в НА. У ряда штаммов 2009-2011 гг. были выявлены замены в антигенных сайтах Са, Sb и Sa. Для выделенных в 2010-2011 гг. штаммов были характерны мутационные изменения, которые являлись следствием адаптации вируса к иммунизированной человеческой популяции. Значительные изменения в генетической структуре генов НА, NA, М, NS, NP данных штаммов выявлены не были [1]. Ни один из штаммов не имел мутации устойчивости к озельтамивиру H275Y, но все штаммы несли мутацию устойчивости к ремантадину S31N в М2. В рецепторсвязывающем сайте НА большинства штаммов (82%), выделенных от умерших, обнаруживали замену D222G, приводящую к расширению рецепторной специфичности. Проведенный анализ сайтов, подверженных положительной селекции, выявил 3 кодона в последовательности НА вируса гриппа A/H1N1pdm2009 - 239, 289 и 391. Мутации в положении 222 НА1 (кодон 239) влияют па рецепторную специфичность. Кодон 391 (положение 47 в НА2) находится в районе эпитопа CR6261, который распознается одноименным антителом. Нейтрализующее действие этого антитела на конформационные перестройки связано со слиянием мембран [3]. В работах по молекулярному моделированию показано, что мутация Е391К теоретически должна способствовать усилению взаимодействия между субъединицами НА, ослабляя внутрисубъеди-ничные взаимодействия [10]. Вирусы гриппа подтипа H3N2 эпидемиологического сезона 2006-2007 гг. отличались значительным генетическим разнообразием (рис. 3). С одной стороны, циркулировали вирусы, подобные штамму А/ Висконсин/67/2005, которые имели ряд замен в НА (Т128А, R142G, К173Е). Замена Т128А приводит к утрате потенциального сайта гликозилирования. Замены К173Е, R142G были характерны для штаммов, выделенных в предыдущие годы (например, А/ Иоханнесбург/33/99). Данные замены приводят к смене заряда аминокислотного остатка. У ряда вирусов из этой группы была выявлена замена L157S в антигенном сайте В1, замена N145KJ в сайте А и замена D188E в сайте В2. Также была отмечена циркуляция вирусов, содержащих замену S193F в антигенном сайте В2, N216S в сайте D, и вирусов, содержащих замены V1121 и К173Е. Еще одну группу составили штаммы, подобные штамму А/Брисбен/10/07, рекомендованному ВОЗ для производства вакцин на 2008 г. и имеющие новые существенные замены G50E и К1401. Вирусы гриппа А подтипа H3N2 эпидемических сезонов 2007-2009 гг. были генетически родственны вакцинному штамму А/Брисбен/10/2007 (см. рис. 3). Для этих штаммов были характерны аминокислотные замены G50E в антигенном сайте С и K140I в сайте А последовательности НА; N93D, H150R и Y194I - в последовательности NA; последовательности белков Ml и М2 не несли специфические замены. Большинство проанализированных штаммов 2007 г. несли мутацию устойчивости к ремантадину (S31N) в белке М2. В пределах данной генетической клады по последовательностям генов НА и NA наблюдался небольшой отдельный кластер, состоявший из ряда московских изолятов (например А/Москва/118/2008). Для последовательностей НА этого кластера была характерна мутация K92R, для NA - две синонимичные мутации 351 A>G (в кодоне Т117) и 408 G>A (в кодоне Q136). Практически все последовательности Ml штаммов 2008 г. имели мутацию K174R. Среди проанализированных штаммов не было выявлено ни одного, относящегося к новой филогенетической линии А/Перт/16-подобных штаммов. Таким образом, штаммы вируса гриппа A (H3N2) 2008-2009 гг. являлись эволюционным продолжением штаммов эпидемического сезона 2007-2008 гг. Следует отметить, что в последовательностях NA вирусов гриппа А(Ю№)2008 г. и всех вирусов 2009 г. была обнаружена мутация D147N в сайте гликозилирования. Известно, что гликозилирование в положении 130 N1 (что соответствует 146 в N2) А/ Висконсин/33 (H1N1) нарушает взаимодействие NA с плазминогеном и снижает патогенность вируса [5]. Подавляющее большинство исследованных штаммов вируса гриппа А подтипа H3N2 2008 г. несли в последовательности С-концевого домена белка Ml мутацию K174R, которая увеличивает склонность данного участка белковой цепи к образованию а-спирали [2]. Белок М2 всех изученных штаммов 2008 г. содержал мутацию устойчивости к ремантадину S31N. В течение эпидемического сезона 2009-2010 гг. вирус гриппа A (H3N2) на территории России в эпидемическом процессе не участвовал, а в сезоне 2010-2011 гг. не имел эпидемического значения, единичные случаи выявления вирусов данного подтипа были отмечены в европейской части России, а в Сибири и на Дальнем Востоке вирус гриппа A (H3N2) проявлял слабую активность. Все вирусы, выделенные на востоке РФ, относились к генетической группе А/Виктория/210/2009/ (R261Q) клады А/Перт/16/2009 (E62K, N144A). НА этих вирусов содержал ряд замен в антигенном сайте Е2. Вирусы, циркулировавшие в европейской части РФ, относились к генетической группе А/Перт/10/2010 клады А/Виктория/208/2009 и имели замены в антигенном сайте С. Вес исследованные штаммы вируса гриппа A (H3N2) 2010-2011 гг. содержали в гене М мутацию, определяющую устойчивость к ремантадину (S31N). Исследованные вирусы A (H3N2) эпидемического сезона 2011-2012 гг. относятся к генетической группе А/Стокгольм/18/2011 (V223I) клады А/Виктория/208/2009 и имеют аминокислотную замену N312S. Данные штаммы можно разделить на две подгруппы с характерными заменами N145S в антигенном сайте A, D487N и Q33R, S45N с возникновением потенциального сайта гликозилирования, T48I, N278K - в антигенном сайте С, T128N, А198Р - в антигенном сайте В2 соответственно. При анализе последовательностей NA штаммов вируса гриппа A (113N2), циркулировавших в РФ в 2006-2012 гг., мутации устойчивости к озельтамивиру E119V не была обнаружена. Таким образом, нами было изучено молекулярногенетическое разнообразие вирусов гриппа А, циркулировавших в России в 2006-2012 гг. За этот период произошли существенные изменения генетической структуры циркулирующих на территории РФ вирусов гриппа, их чувствительности к противовирусным препаратам и филогенетической принадлежности. Кроме того, начиная с лета 2009 г. на территории России начал распространяться новый пандемический вирус гриппа А (H1N1pdm2009). Для предсказания антигенного дрейфа и направления эволюционной изменчивости вирусов гриппа целесообразно проводить исследования по выявлению кодонов, находящихся под действием положительного отбора in silico в генах, кодирующих поверхностные белки вируса гриппа. Непрерывный мониторинг мутационной изменчивости и филогенетический анализ циркулирующих штаммов играют важную роль в выборе вакцинных штаммов для специфической профилактики гриппа и противовирусных препаратов для его лечения. Филогенетический анализ является мощным инструментом выявления новых реассортантов, обладающих эпидемическим или пандемическим потенциалом.

References

Supplementary files