Molecular-Genetic Analysis of the Field Isolates of Avian Leucosis Viruses in the Russian Federation

Full Text

Вирус лейкоза птиц (ВЛП) является представителем лейкозно-саркомной группы (ЛСГ), которая относится к роду птичьих ретровирусов и подразделяется на 7 подгрупп: A, B, C, D, E и J [17]. Подгруппы выделены на основании различий: в последовательностях гена вирусного оболочечного гликопротеина евд, моделях проникновения вируса в восприимчивый организм, инфекционности вирусов для ряда мишеней (in vitro и in vivo) [17]. Вирусы подгрупп A, B, C, D, J являются экзогенными, а подгруппы E - эндогенными. Среди структурных полипептидов (р27, р19, р15, р12 и р10), присутствующих у всех членов ЛСГ ретровирусов, включая эндогенные и экзогенные ВЛП, превалирующим является р27 [8]. Факт наличия у эндогенных и экзогенных вирусов общего группоспецифического антигена р27 весьма затрудняет дифференциальную диагностику ВЛП с использованием методов, основанных на его выявлении [15, 23]. Другие методы, включая молекулярные, не базирующиеся на детекции общего для эндогенных вирусов антигена, широко используются для подтверждения лей-козной инфекции в пораженных стадах птиц [9, 15]. Экзогенные ВЛП способны индуцировать различные новообразования [12]. Самым распространенным видом опухолей, вызываемых этой подгруппой вирусов, является лимфоидный лейкоз (ЛЛ), или В-клеточная лимфома, первично образующаяся в фа-брициевой сумке и инициирующая образование метастазов в висцеральных органах. В большинстве случаев от пораженных птиц выделяют вирус подгруппы А [4, 5]. Однако подгруппа J, впервые описанная в Англии в 1989 г., а позже и в других странах, была первично выделена при заболевании миелоидным лейкозом (МЛ) кур мясных пород [8, 16]. Экзогенные ВЛП передаются как вертикально, так и горизонтально, при наличии полной инфекцион-ности вируса. Эндогенные ВЛП обычно передаются генетически в зародышевых клетках обоих полов. Многие из них являются генетически дефективными. Именно поэтому они не могут привести к развитию инфекционных вирионов. Однако некоторые из них могут экспрессироваться в инфекционную форму в эмбрионах или у вылупившихся птенцов [10]. Экономические потери от заболеваний, индуцированных ВЛП, объясняют двумя основными причинами. Во-первых, непосредственно общая смертность птиц составляет около 1-2%, а в совокупности со случайными потерями может достигать 20% и более [18]. Во-вторых, инфицирование ВЛП, которому подвергается большинство голов в птичьей стае ввиду высокой патогенности вируса, оказывает подавляющее влияние на некоторое число важных производственных показателей, включая продукцию яиц и их качество [10, 21]. На данный момент лечение ретровирусных инфекций не приводит к сколько-нибудь значительному положительному результату, также не получены эффективные вакцины против ВЛП. В настоящее время данных о распространении ВЛП на территории РФ крайне мало, они нуждаются в дополнении. В связи с этим диагностика заболевания и молекулярно-генетический анализ полученных вирусных изолятов позволяют оценить распространение различных штаммов ВЛП на территории РФ. Существует необходимость поиска птицеводческих хозяйств, свободных от ВЛП, для последующего использования эмбрионов в производстве различных препаратов, в том числе вакцин. Целью данного исследования были составление карты географической локализации очагов распространения лейкоза птиц, выделение отечественных полевых изолятов в культуре клеток и их молекулярногенетическая характеристика. Материалы и методы Сбор образцов. Для выявления вирусных антигенов ВЛП биологические образцы после сбора при транспортировке были помещены на лед и до исследований хранились при -700 C. Для тестирования методом им-муноферментного анализа (ИФА) образцы хранили в фосфатном буферном растворе (PBS), содержащем 0,1% твина-80. Для исследования методом ПЦР образцы хранили в замороженном состоянии без добавления дополнительных реагентов. Для анализа использовали цельную кровь, сыворотку, клоакальные смывы, альбумин, фрагменты новообразований и другие ткани. Выделение вируса. С целью исследования и выделения ВЛП в гепаринизированные шприцы отбирали пробы крови птиц с клиническими признаками неопластических заболеваний. Результаты исследования проб крови фического антигена р27 ВЛП таблица 1 на наличие группоспеци-с помощью ИФА Регион Количество исследованных проб Количество положительных проб, на наличие p27-антигена Процент положи тельных проб Московская обасть 25 14 56 Владимирская область 15 8 53 Нижегородская область 15 7 46 Свердловская область 10 6 60 Ростовская область 11 6 55 Новосибиская область 12 7 58 Республика Мордовия 13 8 61 тульская область 15 7 46 Республика Марий Эл 14 9 64 Липецкая область 12 7 58 Ленинградская область 15 8 53 Самарская область 10 0 0 Оренбургская область 10 0 0 Рязанская область 9 0 0 Итого... 186 87 47 Полученные образцы сепарировали центифугиро-ванием в градиенте Ficoll-Pac («Amersham Biosciences», Швеция) для получения лейкоцитарной фракции крови. Пробы тестировали на наличие группоспецифического p27-антигена ВЛП посредством ИФА. Положительные пробы в дальнейшем использовали для вирусовыделения [11] Культура клеток. Для выделения изолятов ВЛП использовали первичную культуру клеток фибробла-стов, полученную от 11-дневных свободных от патогенной флоры (СПФ) куриных эмбрионов («Logh-man», Германия), применяя стандартную процедуру трипсинизации. С целью заражения культуры клеток в культуральную среду вносили лейкоцитарную фракцию и инкубировали в течение 7-14 дней. В качестве ростовой и поддерживающей сред использовали среду МЕМ с фетальной сывороткой крупного рогатого скота, выращивание проводили при 38°С с содержанием в воздухе 4% СО2. В качестве контроля служили матрацы с неинокулированной культурой клеток куриных фибробластов. Иммуноферментный анализ. Обнаружение присутствия вируса и подтверждение выделения вирусных изолятов выполняли с использованием коммерческого ИФА-набора («АВИВАК», Россия) для определения группоспецифического антигена р27 по методике производителя. Выделение РНК. Суммарную РНК выделяли из монослоя зараженных вирусом клеток с помощью три-зола (Trizol, «Gibco BRL», США) и коммерческого набора («Ветбиохим», Россия) с использованием неорганического сорбента по методике производителей. От-ПЦР проводили в одной пробирке. Реакционная смесь в конечном объеме 25 мкл содержала 1 мкл РНК, 10 пмоль каждого праймера, 2,5 ед. TaqI-полимеразы («Gibco BRL», США), 2,5 ед. MMLV обратной транс-криптазы («Gibco BRL», США), 10 мМ трис-HCl (pH таблица 2 Изоляты ВЛП, выделенные на территории РФ Обозначение изолята Дата выделения Регион 132 Июнь 2010 Липецкая область 346 Январь 2010 Московская область 138 Сентябрь 2010 Ростовская область 130 Январь 2010 Свердловская область 76 Март 2010 Ростовская область 11 Июнь 2011 Владимирская область 9 Июнь 2011 II II 7 Июнь 2011 II II 5 Июнь 2011 II II 2 Июнь 2011 II II 3 Июнь 2011 II II 8 Март 2011 Нижегородская область 9,0 при 250C), 50 мМ KCl, 0,1% тритона X-100, 1,5 мМ MgCl2. Использовали следующие параметры От-ПЦР: 50оС - 45 мин, 95оС - 5 мин - 1 цикл , 950С - 1 мин, 510С - 1 мин, 720С - 1 мин - 5 циклов; 950С - 30 с, 510С - 30 с, 720С - 45 с - 30 циклов. Праймеры. Для индикации генома ВЛП в ПЦР использовали праймеры от тест-системы обнаружения ВЛП («Ветбиохим», Россия). Секвенирование. Продукты ПЦР очищали в геле, используя набор для очистки продуктов ПЦР из геля (Geneclean), и секвенировали. Первичную последовательность определяли на автоматическом ДНК-секвенаторе (ABI-377, США) и анализировали с помощью компьютерных программ MacVector/AssemblyLign (Oxford Molecular Group, США) и PHYLIP (Felsenstein, 1993). Результаты В ходе исследования было собрано 177 проб сыворотки крови из 14 племенных и промышленных птицеводческих хозяйств в различных регионах Российской Федерации. Кровь брали у птиц в возрасте от 100 до 400 дней с выраженными клиническими признаками неопластической болезни, а также у птиц в регионах с неблагоприятной эпизоотической обстановкой. Сыворотку крови исследовали с помощью ИФА на наличие группоспецифического антигена р27 ВЛП (табл. 1). Как видно из результатов, представленных в табл. 1, из 14 обследуемых регионов только в трех не был обнаружен ВЛП (Самарская, Оренбургская и Рязанская области). В остальных 11 регионах из 186 исследуемых проб 87 были положительными, при этом средний показатель составил 47%. Процент положительных проб варьировал от 46 (Новосибирская область) до 64 (Республика Марий Эл), причем только в двух регионах этот показатель составил 46%, в остальных он равнялся 50% и более. Выделенную из проб крови лейкоцитарную фракцию использовали для дальнейшей изоляции вирусов в культуре клеток СПФ ФЭК с целью создания банка вирусных изолятов и изучения их культуральных и молекулярно-генетических свойств. Необходимо отметить, что ВЛП не вызывает цитопатоморфологиче-ских изменений культур клеток, что усложняет его выявление. Поэтому в мировой практике для обнаружения ВЛП прибегают к таким методам, как ИФА и ПЦР [9, 20]. Мы также проверяли наличие ВЛП с использованием ПЦР и ИФА [14] после 7-14 дней культивирования вируса на клетках куриных фибробластов. -с Из 186 проб удалось выделить 12 (6,5%) изолятов из различных областей Российской Федерации (табл. 2). Для выявления генома ВЛП из инокулированных культур клеток была выделена РНК, которую исследовали в ПЦР. В результате амплификации с праймерами для лейкоза A-D синтезировали специфический фрагмент кДНК размером 314 п. н. и фрагмент размером 738 п. н. - в результате амплификации с праймерами для лейкоза J. Данные праймеры были разработаны ранее и использованы для исследования птиц на наличие вируса лейкоза [1]. с Определение и сравнительный анализ структуры амплифициро-ванных фрагментов кДНК показал, что все исследованные пробы содержали фрагменты генома ВЛП. 19.8 18 16 14 12 10 8 6 Nucleotide Substitutions (x100) 0 Рис. 1 Филогенетическая дендрограмма, построенная на основании анализа фрагмента гена env вируса лейкоза птиц. Для выявления генетических различий между полученными нами изолятами ВЛП был проведен анализ нуклеотидных последовательностей амплифицированного ПЦР-фрагмента гена env. Нуклеотидные последовательности выделенных ранее ВЛП получали из банка данных GenBank (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/). Необходимо отметить, что молекулярно-генетическое исследование различных подтипов ВЛП в последние годы получило широкое распространение [22, 25]. На рис. 1 представлена филогенетическая дендрограмма, построенная на основании сиквенса фрагмента последовательности гена env ВЛП. Анализ дендрограммы показал, что изоляты 130, 76, 132, 138, 8, 346 образуют с известными ранее изолятами (AY013303, EF467236, DQ500007, AY013304, EU070900, EU070901, EU070902, M37980, NC_001408, DQ365814, AY350569, AB303223, AB112960) одну генетическую группу с уровнем внутригрупповых различий не более 5%. В данной группе представлены эндогенные и рекомбинантные ВЛП, выделенные на территории США, Китая, Франции и Японии с 1993 г. по настоящее время. Изоляты 9, 7, 2, 5, 3, 11, 138 и 346 образуют вторую обширную генетическую группу с изолятами ВЛП подгруппы J, выделенными на территории Китая, Франции и США. Внутригрупповые различия в данной группе превышают 10%. Из дендрограммы видно, что изоляты 138 и 346 одновременно входят в обе группы. Это объясня ad76.seq ad132.seq ad138.seq E F467236 S D0501. seq AY013303 ev-1.seq AD#8.seq DQ500007 ev-C1 Iseq AY013304 ev-3.seq ad346 .seq Leicos Vladimir AD.seq M37980 RSA.seq NC_001408RSA.seq EU 070900 PDRC-1039. seq EU 070901 PDRC-3246.seq EU070902 PDRC-3249.seq DQ365814 MQNCSU.seq ad 130 .seq AY350569 LR-9gag protein.seq A В112960 RNA.seq A В 303223 RNA.seq J9.seq J346 .seq J7.seq J5.seq J2.seq J138t.seq AY 158693. seq J3.seq J11.seq YJ_Vladimir.seq EU264064 SD07LK1 envelope precursor pro EU264065 SD07LK2.seq FJ216405 SD07LK1.seq DQ115805 NX0101.seq Z46390 HPRS1 03 (subgroup J).seq MJ_V lad im ir.se q ется тем, что ВЛП подгруппы J являются рекомбинантными вирусами. Рекомбинация может происходить между изолятами экзогенной подгруппы J, возможна также рекомбинация дефективных эндогенных вирусов (подгруппа Е) с вирусами подгруппы А [6, 13, 19]. Обсуждение Полученные нами результаты указывают на то, что ВЛП широко распространен на территории Российской Федерации. Он был обнаружен в 79% исследуемых регионов РФ (в 11 из 14). Это свидетельствует о том, что ВЛП остается одной из самых актуальных проблем вирусологии. Регионы, в которых был выделен ВЛП, представлены на схеме карты Российской Федерации (рис. 2). В результате наших исследований были изолированы и охарактеризованы 12 изолятов ВЛП в первичной культуре клеток куриных фибробластов. Изоляты были идентифицированы методами ИФА и ПЦР, проведен молекулярно-генетический анализ. При проведении филогенетических исследований важным является вопрос о выборе участка генома, на основании которого выполняется анализ. Нами был выбран участок гена env, поскольку основные подгруппы ВЛП были выделены на основании различий в последовательностях гена вирусного обо-лочечного гликопротеина env. Эти различия также определяют разное поведение вирусных подтипов в реакции нейтрализации, различие в моделях проникновения вируса в восприимчивый организм и в инфекционности вирусов для ряда мишеней (in vivo и in vitro) [4, 6]. Рис. 2. Распространение вируса лейкоза птиц на территории Российской Федерации (11 регионов). Исследуемые полевые изоляты формируют две обширные группы, в каждую из которых входят российские изоляты. Одна группа изолятов образована экзогенными и эндогенными ВЛП, в ней представлено 4 российских изолята: 76, 132, 8, 130. Ко второй группе ВЛП подгруппы J относятся 8 изолятов: 138, 346, 2, 3, 5, 9, 7, 11. Из генетического сравнения видно, что большинство выделенных изолятов (8), представляют подгруппу J, которая состоит из рекомбинантных вирусов, образованных путем рекомбинации между эндогенными и экзогенными ВЛП. В результате данной рекомбинации могут образовываться штаммы с различными генетическими подгруппами, существенно отличаясь друг от друга [24]. Геномные различия между российскими и зарубежными изолятами внутри соответствующих групп составляют от 5 до 10%, для некоторых штаммов возможно наличие общего предшественника. В связи с этими данными для успешной профилактики необходимо проводить исследования для выявления ВЛП в птицеводческих хозяйствах, выбраковку птиц, положительных на ВЛП, и особенное внимание уделять дезинфекции помещений и содержанию птиц. Кроме того, полученные данные необходимо учитывать при использовании сырья из хозяйств, положительных на наличие ВЛП, в изготовлении препаратов ветеринарного и медицинского назначения.

References

Supplementary files