Molecular-Genetic characterization of the HIV-1 Variants abundant in Kirghizia

Abstract

The results of the molecular epidemiological analysis of HIV-1 circulating in Kirghizia were presented. In the area of Kirghizia this type of the work was performed for the first time. Two main genetic variants were discovered: variant IDU-A dominating in the area of the former Soviet Union, as well as recombinant form cRF02_AG. The possibility of further recombination process between these two variants of HIV-1 was suggested.

Full Text

Проблема ВИЧ-инфекции в странах бывшего СССР с момента своего возникновения по сегодняшний день остается одним из самых острых вопросов здравоохранения данных государств, однако молекулярно-эпидемиологическая ситуация в указанных странах изучена неодинаково. В странах, где слежение за распространением ВИЧ-1 организовано в достаточной степени (Россия, Украина, Белоруссия, Казахстан, страны Балтии), имеется большое количество данных по распространению различных подтипов вируса и мутаций лекарственной устойчивости [1, 2, 4, 6, 9, 10]. Известно, что на территории большинства этих стран доминирует вариант IDU-A, получивший свое название по основному пути передачи -среди потребителей инъекционных наркотиков (intravenous drug users), а также распространены подтип B и рекомбинантный вариант CRF03_AB [1]. Очевидно, сходная картина эпидемии ВИЧ-инфекции в указанных странах обусловлена тесными социально-экономическими связями между ними. В большинстве стран бывшего СССР вариант подтипа B ВИЧ-1 в основном распространен среди гомосексуалистов. Вариант IDU-A в настоящее время вышел за пределы группы риска и все чаще передается гетеросексуальным путем. В Узбекистане отмечено распространение рекомбинантного варианта CRF02_AG (9,2%) [5]. Молекулярная картина эпидемии ВИЧ-инфекции в Киргизии до сих пор практически не изучена. Известно, что к началу 2010 г. число зарегистрированных случаев ВИЧ-инфекции в стране составило 2561. Изначально вирус распространялся среди потребителей инъекционных наркотиков, причем число зараженных мужчин втрое превышало число зараженных женщин. В дальнейшем увеличилась роль гетеросексуального пути передачи и возросла доля зараженных женщин, кроме того, стали регистрироваться случаи заражения вертикальным путем [3]. таблица 1 Праймеры, адаптированные для варианта IDU-A ВИЧ-1 Праймер По следовательно сть Регион Координаты полученного фрагмента Дли на, п.н. EnvF1 5’-GATGCATGAGGATATAATCAGTTTATGGGA-3’ EnvR1 EnvF2 5’-ATTGATGCTGCGCCCATAGTGCT-3’ 5’-AGTTTATGGGACCAAAGCCTAAAGCCATGT-3’ env 6556-7792 1237 EnvR2 5’-ACTGCTCTTTTTTCTCTCTCCACCACTCT-3’ P0M 5’-CCCTAGGAAAAAGGGCTGTTGGA-3’ R2726 F2111 5’-TGGAGTATTGTATGGATTTTCAGGC-3’ 5’-CAAAGGGAGGCCAGGAAATTT-3’ PR 2133-2610 478 polR1 5’-TCTCTTCTGTTAATGGCCATTGTTTAA-3’ F 2491 5’-CCCCTGTCAACATAATTGGA-3’ RT2A RT1A 5’-TCTGTATATCATTGACAGTCCAGC-3’ 5’-GTTGACTCAGCTTGGTTGTAC-3’ RT1 2540-3251 712 R 3271 5’-ACTGTCCATTTGTCAGGATG-3’ P5M 5’-ACAGGGATGGAAAGGATCACC-3’ P13A F3077 5’-AATTGTTTTACATCATTAGTGTGAGCA-3’ 5’-GAAATAGTTATCTATCAATACATGGATGACTT-3’ RT2 3110-3558 449 3RES-A 5’-ACTGTCCATTTGTCAGGATG-3’ Int1L 5’-AggAgCAgAgACTTTCTATgTAgATgg-3’ Int1R Int2L 5’-TTCTTCCT gCCATAgg AgAT gCCTAAg-3’ 5’-g AggAAAT gAACAAgTAgAT-3’ IN 4230-4991 762 Int2R 5’-gAT gT gTACTTCT gAACTTA-3’ Целью настоящего исследования был молекулярногенетический анализ вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории Киргизии. Подобное исследование в данной стране было проведено впервые. Материалы и методы В работе было использовано 22 образца от ВИЧ-инфицированных пациентов из разных регионов Киргизии, зарегистрированных с диагнозом ВИЧ-инфекции в период с 2003 по 2009 г. и давших информированное согласие на участие в исследовании. Возраст пациентов варьировал от 24 до 49 лет, соотношение полов 1:1. Выявление факторов риска, возможных мест заражения, а также эпидемиологических связей с другими ВИЧ-инфицированными лицами проводили путем опроса пациентов при сборе эпидемиологического анамнеза. Кроме того, регистрировали возраст, пол пациента, дату забора клинического материала, дату и регион постановки диагноза ВИЧ-инфекции. Выделение ДНК из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) проводили с помощью автоматической системы DNA/RNA Extractor Quicube («QIAGEN», Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Для амплификации фрагментов гена gag с координатами 1576-2040 (координаты здесь и далее даны для варианта ВИЧ-1 НХВ2, регистрационный номер GenBank K03455) использовали праймеры HIG777/ HIP202 и H1Gag1584/g17 [7] для первого и второго раундов соответственно. Для анализа области гена env и области pol был подобран и использован специфический для варианта IDU-A набор праймеров, позволяющих амплифици-ровать отдельные участки данного гена, кодирующие протеазу (PR), обратную транскриптазу (RT) и инте-гразу (IN) (табл. 1). Секвенирование полученных ампликонов выполняли с использованием автоматического секвенатора (ABI Prism 3130, «Applied Biosystems», США). Полученные нуклеотидные последовательности обрабатывали с помощью программы BioEdit. Работу по определению подтипа вируса по исследуемой области генома проводили с применением on-line программ COMET v.0.1 (http://comet. retrovirology.lu/), REGA v.2.0 (http://dbpartners. таблица 2 Результаты молекулярно-эпидемиологического анализа вариантов ВИЧ-1, выделенных от пациентов в киргизии Пол Потребление инъекционных наркотиков Гетеросексуальный путь подтип A1 рекомбинант AG подтип A1 рекомбинант AG М. 8 2 0 1 Ж. 0 0 8 3 Страны обнаружения Камерун, Эквадор, Франция, Нигерия, США, Узбекистан Группа Карта генома 3198 4208 4926 2222 gag pol 8261 8626 env 8383 8697 2735 3210 4138 4926 Камерун, Сенегал США 8356 8760 4219 4883 Камерун, Узбекистан 2237 3198 4148 4926 Камерун, Сенегал Рис.1. Структура генома вариантов CRF02_AG. Цифрами обозначены точки рекомбинации. stanford.edu/RegaSubtyping/) и HIVdb Program (http://hivdb.stanford.edu/pages/algs/sierra_sequence. html) базы данных Стэндфордского университета. В работе также была использована программа для определения точек рекомбинации Recombinant Identification Program (RIP, http://www.hiv.lanl.gov/ content/sequence/RIP/RIP.html). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей выполняли методом «ближайших соседей» с использованием пакета программ MEGA 4.0. Результаты и обсуждение Результаты молекулярно-эпидемиологического анализа образцов, собранных на территории Киргизии от 22 лиц, представлены в табл. 2. Как следует из этих данных, в 16 образцах выявлен вариант вируса подтипа A1 и в 6 - рекомбинантный вариант CRF02_AG. Стоит отметить, что для женщин в данной выборке характерен только гетеросексуальный путь передачи, в то время как мужчины в основном относятся к группе потребителей инъекционных наркотиков. Примечательно, что распределение подтипов ВИЧ-1 не зависело от пути передачи инфекции. Особый интерес представлял циркулирующий рекомбинантный вариант CRF02_AG. Из данных литературы известно по меньшей мере о 4 формах AG-рекомбинанта [8], различающихся по локализации точек рекомбинации в генах gag, env и pol (рис. 1). Перед исследователями стояла задача определить, принадлежат ли выявленные в Киргизии рекомбинанты к каким-либо уже известным формам. На основании полученных в данной работе последовательностей можно было сделать лишь предварительные выводы по этому вопросу. Чтобы определить принадлежность вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории Киргизии, к одной из форм/подгрупп рекомбинантов, для филогенетического анализа были выбраны 3 области генома - область гена pol, кодирующая IN (данная область во всех вариантах рекомбинантной формы AG относится к подтипу G), а также области генов gag и env. Первой была проанализирована область IN. На рис. 2 показано, что образцы KYR1, KYR4, KYR17, KYR19 образуют один общий кластер с образцами подтипа G ВИЧ-1 и рекомбинанта AG из разных стран (Африка, Европа), а также субкластер с образцами рекомбинанта AG из Узбекистана. Для остальных полученных последовательностей данной области характерно расположение на одной ветви с образцами подтипа A из стран СНГ. Для определения подтиповой принадлежности гена gag было построено второе филогенетическое дерево (рис. 3). Как видно из рисунка, образцы KYR4, KYR7, KYR19, KYR23 кластеризуются на одной ветви с AG-рекомбинантными формами ВИЧ-1, выделенными в Узбекистане, и входят в общий кластер образцов, принадлежащих рекомбинанту AG. Образец KYR17, по результатам анализа IN относящийся к подтипу AG, вместе с прочими образцами из Киргизии расположен на одной ветви с последовательностями, полученными в СНГ и относящимися к подтипу A. При побуквенном сравнении с другими использованными последовательностями этот образец также продемонстрировал принадлежность к подтипу А. Только в одной позиции (1726) образец соответствовал рекомбинанту AG (рис. 4, а). С учетом того что подобная последовательность не имеет аналогов среди исследуемых образцов, вариант контаминации исключен. Это означало, что образец KYR17 по гену gag действительно принадлежит к подтипу A. Анализ последовательностей, кодирующих PR, в образцах, отнесенных к рекомбинантам AG, также показал отличие образца KYR17 в исследуемой области от прочих. При побуквенном сравнении оказалось, что большая часть этой области генома (1-228 п. н.) принадлежала подтипу G, при этом начиная с позиции 229 последовательность соответствовала 79 90 99 58 70 74 80 100 100 58 93 97 Г 51 - AY500393(A Russia) Д - KYR18 - EF589039(A Kazahstan) - DQ207944(A Georgia) - AF413987(A Ukraine) KYR13 KYR6 KYR9 KYR10 KYR5 - AY829212(A Uzbekistan) KYR21 KYR22 KYR25 KYR16 KYR14 KYR24 EF545108(A Russia) - AY253305(A Tanzania) EU882776(A Belgium) DQ083238(A India) FJ465118(G Russia) FJ465120(G Russia) - AB287003(G Ghanan) - AY612637(G Portugal) DQ445118(AG Italy) Д FJ670515(AG Spain) GQ372986(AG Spain) - AF377954(AG Cameroon) - AY151002(AG Ecuador) KYR4 KYR19 KYR17 - AY829204(AG Uzbekistan) ^KYRI^) - AY829214(AG Uzbekistan) - AY829207(AG Uzbekistan) J > G Рис.2. Результаты филогенетического анализа области гена pol ВИЧ-1, кодирующего IN. Здесь и на рис. 3 образцы из Киргизии обозначены аббревиатурой KYR, обозначение остальных образцов соответствует коду GeneBank, в скобках указаны подтип ВИЧ-1 и страна получения образца. подтипу А, в частности обнаруживалась мутация V77I, характерная для варианта IDU-A, в составе которого она встречается с частотой 70% (для сравнения: у рекомбинантов AG - 2,1%). Это позволяло заподозрить в образце KYR17 новый рекомбинант, сформированный вариантом IDU-A и рекомбинантной формой AG. Что касается остальных 5 рекомбинантов из Киргизии, они по результатам побуквенного сравнения той же области полностью совпадали с последовательностями из Узбекистана (рис. 4, б). Для области env также было построено филогенетическое дерево (данные не приводятся). Как выяснилось, анализированный участок области гена env у всех форм AG-рекомбинанта принадлежит к подтипу A, что и подтвердилось на филограмме. Выделяется субкластер, образованный образцами KYR1, KYR7, KYR17, KYR19 и образцами из Узбекистана. Для дальнейшего анализа использовали программу анализа рекомбинантных форм ВИЧ-1 RIP. Проверенные с ее помощью анализированные последовательности области гена gag не содержали точек рекомбинации. Исследованные в данной работе последовательности IN не включали области рекомбинации, описанные в литературе, поэтому пока не представляется возможным подтвердить ее принадлежность к одной из рекомбинантных форм. Область PR данная программа проанализировать не смогла. По полученным результатам можно предположить, что на территории Киргизии встречается не -KYR6 - AF193275(A Belarus) 0<YR17 -KYR25 -KYR22 -KYR24 -KYR18 - EF589039(A Kazahstan) -KYR5 - KYR12 - AF413987(A Ukraine) -KYR9 -KYR13 -KYR10 -KYR14 - GQ372986(AG Spain) -KYR8 - EU884501(AG Spain) 58 83 J Л 60 AG 82 92 65 75 55 73 61 J 100 - GU201514(AG Cameroon) - DQ445118(AG Italy) - FJ670515(AG Spain) - AY151002(AG Ecuador) - AF377954(AG Cameroon) ^KYR4 -KYR7 -KYR19 -KYR23 - AY829214(AG Uzbekistan) - AY829207(AG Uzbekistan) - AY829204(AG Uzbekistan) - AY586547(G Cuba) - FJ465127(G Russia) - FJ465126(G Russia) Рис.3. Результаты филогенетического анализа области гена gag ВИЧ-1. меньше 2 вариантов CRF02_AG ВИЧ-1, различающихся по гену gag и по области протеазы гена pol. Один из них полностью идентичен узбекскому варианту, что подтверждается филогенетическим анализом (KYR1, KYR4, KYR7, KYR19, KYR23). Второй вариант, представителем которого является KYR17, возможно, появился в процессе рекомбинации между узбекским вариантом и вариантом IDU-A. Дальнейшая работа будет направлена на точное выяснение структуры и происхождения данного варианта. Анализ мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ-1 проводили c использованием Интернет-ресурса. Первичные мутации к антиретровирусным препаратам не выявлены, однако в некоторых образцах обнаружены вторичные мутации, ассоциированные с лекарственной устойчивостью. так, в области протеазы была найдена одна мутация - L10I - в одном образце KYR19. Для области RT список составил 6 мутаций: A62V в образцах KYR5, KYR9, KYR10; V108G-в KYR5; E138A-в KYR21; Y181F - в KYR10; M184I - в KYR17; L210M - в KYR9. В области IN также была обнаружена одна вторичная мутация в одном образце - L74M в KYR18. таким образом, частота встречаемости вторичных мутаций в исследованных образцах невысока. Стоит упомянуть о мутации в INL74I. Она присутствует у всех исследованных образцов, относящихся к подтипу A (варианту IDU-A). Очевидно, для данного подтипа мутация L74I является естественным полиморфизмом. Заключение Проведен молекулярно-генетический анализ образцов ВИЧ-1, полученных из Киргизии. В результате анализа было установлено наличие на территории Киргизии различных генетических вариантов I ----|----| . 110 120 ТА AAAAAC T GGA ТА AAAAAC T GGA . . . I----I • 130 TGACAGAAAC TGACAGAAAC I----I • 140 CTTGCTGGTC CTTGCTGGTC . . . I----I 150 CAAAATGCGA CAAAATGCGA KYR4 AG KYR7 AG KYR17 AG - KYR19 AG KYR23 AG AY829207 AG AY829214 AG KYR5 Al KYR10 Al KYR18 Al KYR25 Al EF589039 Al AF193275 Al GCAGG GCAGG ЛСЛСС AGG AGG AGG ТА ЛЛСЛЛСТССЛ ТСACACАЛЛС CCTCCTCCTC СЛЛЛЛТССЛЛ GCAGGAgGTA AAAAACTGGA gCagGAAGTA AAAAACTGGA GCAGGAGGTA AAAAACTGGA GCAGGAGGTA AAAAACTGGA ACAGGATGTA AAGAACTGGA ACAGGATGTA AAGAACTGGA ACAGGATGTA AAGAACTGGA ACAGGATGTA AAGAACTGGA ACAGGATGTA AAGAACTGGA ACAGGATGTA AAGAACTGGA TGACAGAAAC TGACAGAAAC TGACAGAAAC TGACAGAAAC TGACAGAAAC TGACAGAAAC TGACAGAAAC TGACAGACAC TGACAGAAAC TGACAGAAAC 6 CTTGCTGGTC CTTGCTGGTC CTTGCTGGTC CTTGCTGGTC CCTGCTGATC CCTGCTGGTC CCTGCTGGTC CCTGCTGGTC CCTGCTGGTC CCTGCTGGTC CAAAATGCGA CAAAATGCGA CAAAATGCGA CAAAATGCGA CAAAATGCAA CAAAAT GCAA CAAAATGCAA CAAAATGCAA CAAAATGCAA CAAAATGCAA 200 TCTG TCTG TCTG 210 T G GAAAAAAG TGGAAAAAGG TGGAAAAAGG 220 GCCATAGGTA GCCATAGGTA GCCATAGGTA 230 AGT 'AGT 'AGT 'ЛШ- 240 AGGACCTACA AGGACCTACA AGGACCTACA 250 CCTGTCAACA CCTGTTAACA CCTGTTAACA KYR1 AG KYR4 AG KYR7 AG KYR17 AG - KYR19 AG KYR23 AG AY829214 AG AY829207 AG KYR9 Al KYR13 Al KYR18 Al KYR24 Al AF193275 Al AF413987 Al CAGTAT CAGTAC CAGTAT TCTG GGGAAAAAGG GCCATAGGTA CAGTAT AGGGCCTACC CCYGTCAACA TCTG TcTG TCTG TCTG TTTG TTTG TTTG TTTG TTTG TTTG TGGAAAAAGG T G GAAAAAAG T G GAAAAAAG T G GAAAAAAG T G GAAAAAAG TGGAAAGAAG T G GAAAAAAG T G GAAAAAAG T GRAAAAAAG T G GAAAAAAG GCCATAGGTA GCCATAGGTA GCCATAGGTA GCCATAGGTA GCTATAGGTA GCTATAGGTA GCTATAGGAA GCTATAGGTA GCTATARGTA GCTATAGGTA CAGTAT CAGTAT CAGTAT CAGTAT CGGTAT CAGTGT CGGTAT CGGTAT CGGTAT CGGTAT 'AGT 'AGT 'AGT 'AGT 'AAT 'AAT 'AGT 'AAT 'AGT 'AGT AGGACCTACA AGGACCTACA AGGACCTACA AGGACCTACA AGGGCCTACC AGGGCCTACC AGGACCTACC AGGGCCTACC AGGACCTACC AGGACCTACC CCTGTTAACA CCTGTCAACA CCTGTCAACA CCTGTCAACA CCTGTCAACA CCTGTCAACA CCTGTCAACA CCTGTCAACA CCTGYCAACA CCTGTCAACA KYR1 AG KYR4 AG KYR7 AG KYR17 AG _ KYR19 AG KYR23 AG AY829214 AG AY829207 AG KYR9 Al KYR13 Al KYR18 Al KYR24 Al AF193275 Al AF413987 Al TAATTGGGCG TAATTGGgCG TAATTGGGCG TAATTGGGCG TAATTGGAAG TAATTGGAAG TAATTGGAAG TAATTGGAAG TAATTRGAAG TAATTGGAAG AAATATGTTA AAATATGTTA AAATATGTTA AAATATGTTA AAATATGTTG AAATATGTTG AAATATGTTG AAATATGTTG AAATATGTTG AAATATATTG ACTCAGATTG ACTCAGATTG ACTCAGATTG ACTCAGATTG ACTCAGCTTG ACTCAGCTTG ACTCAGCTTG ACTCASCTTG ACTCAGCTTG ACTCAGCTTG ----I----| ----I----| ----|----| ----|----| 260 270 28 TAATTGGGCG AAATATGTTA ACTCAAATCG TAATTGGGCG AAATaTGTTA ACTCAGATTG TAATTGGGCG AAATATGTTA ACTCAGATTG TAATTGGAAG AAATATGTTG ACTCAGCTTG I AAATTTT AAATTTT AAATTtT AAATTTT AAATtTT AAATTTT AAATTTT AAATTTT AAATTTT AAATTTT AAATTTT AAATTTT AAATTTT AAATTTT 0 290 GTTGTACTTT GTTGTACTTT GTTGTACTTT qTtGCACTTT GTTGTACTTT GTTGTACTTT GTTGTACTTT GTTGTACTTT GTTGTACTTT GTTGTACTTT GTTGTACTTT GTTGTACCTT GTTGTACTTT GTTGTACTTT Рис. 4. Результаты побуквенного сравнения последовательностей. координаты точки полиморфизма в составе гена gag образца ВИЧ-1 KYR17, соответствующей AG-рекомбинанту; б - возможный участок генома ВИЧ-1, в котором произошла рекомбинация, в последовательности, кодирующей PR образца KYR17. а ВИЧ-1 - подтипа A1, а также по меньшей мере 2 вариантов рекомбинантной формы CRF02_AG. Первичные мутации лекарственной устойчивости выявлены не были. Дальнейшие исследования на большом количестве образцов будут посвящены детальному изучению рекомбинантных форм и направлены на определение точной локализации точек рекомбинации.