Peculiarity of the Laboratory Diagnostic of the Measles Virus Infection in Previously Vaccinated and Unvaccinated Patients

Full Text

Складывающуюся в последнее время в мире эпидемическую ситуацию по кори однозначно оценить нельзя. С одной стороны, благодаря широкому применению коревых вакцин наблюдается снижение заболеваемости корью, с другой - продолжающиеся вспышки являются одной из актуальных проблем борьбы с коревой инфекцией в рамках программы ВОЗ по элиминации кори к 2015 г. В эпидемический процесс вовлечены не только непривитые лица и пациенты, не имеющие сведений о прививках, но и взрослые, ранее получившие 1 или 2 дозы коревой вакцины [6, 14, 19, 20]. За первое полугодие 2011 г. Европейское региональное бюро (ЕРБ) ВОЗ сообщило о регистрации 26 025 случаев кори в европейском регионе, что в 3 раза превышает число случаев кори в 2007 г. за тот же период. Результаты эпидемиологических расследований и генотипирования штаммов вируса подтверждают факты передачи вируса кори в пределах нескольких стран региона и его распространение в страны Северной и Южной Америки. Наиболее пострадавшей группой (около 30%) оказались лица в возрасте 20 лет и старше [21]. Широкое проведение лабораторных исследований (серологических, молекулярно-генетических) в рамках реализации национальной программы ликвидации эндемической кори позволило получить данные о возможности элиминации кори в России [11, 15, 18]. Однако с постепенным увеличением частоты случаев кори среди взрослых, не болевших, не привитых и не имеющих достоверных сведений о прививках, в 2004-2006 гг. выполнялась дополнительная вакцинация лиц от 18 до 35 лет. С 2007 г. прививки этой возрастной категории включены в Национальный календарь прививок. Неспецифическая природа продромальных симптомов, существование легких случаев инфекции, клиническое сходство с другими экзантемными заболеваниями осложняют диагностику кори на основании только клинических критериев. В связи с этим возрастает необходимость лабораторного обследования больных не только для дифференциации кори от других клинически сходных заболеваний, но и для подтверждения диагноза при атипичных формах коревой инфекции. Несмотря на широкий спектр методов диагностики кори, основным в рутинной работе является иммуноферментный анализ (ИФА), который отвечает всем требованиям диагностики, улавливает весь спектр антител к различным антигензначимым белкам вируса, обладает высокой специфичностью, дает возможность получать объективные данные, что позволяет использовать его для проведения широкомасштабных серологических исследований [2, 4, 7, 12]. Для выявления антител М-класса имеются различные по модификации (формату) коммерческие тест-системы (тесты) с разной чувствительностью и специфичностью. Целью данного исследования явилось выявление особенностей IgM-тестов разного формата при диагностике кори у больных с разным исходным прививочным анамнезом. Материалы и методы В качестве материала для исследования были использованы 119 сывороток больных корью из 4 очагов инфекции (Благовещенск, 2010 г.; Республика Бурятия, 2010 г.; Красноярск, 2011 г.; Томск, 2011 г.), которые были зарегистрированы в период с марта 2010 г. по март 2011 г. Забор крови у больных осуществляли в острый период заболевания на 5-6-й день после появления сыпи. Больные корью были разного возраста: от 4 мес до 48 лет. Сведения о вакцинации и клинической симптоматике получены из карт эпидемиологического расследования случаев заболевания корью. Оценку клинических симптомов осуществляли в соответствии с международным стандартным определением случая кори [5]. Для определения IgM, IgG и степени авидности IgG к вирусу кори методом ИФА были использованы коммерческие тесты разного формата: непрямой (indirect) и метод двойного сандвича (capture). Enzygnost® Anti-Measles Virus/IgM, «Siemens» (Германия) - тест indirect-формата, на твердой фазе которого сорбирован инактивированный антиген вируса кори. VectoMeasles IgM, «Vector Best» (Россия) - тест capture-формата с иммобилизованными моноклональными антителами к IgM человека. Enzygnost® Anti-Measles Virus/IgG, «Siemens» (Германия) - тест indirect-формата. Количественное значение противокоревых IgG рассчитывали по формуле: log^lU/ш^а х ДАв и выражали в МЕ/ мл. Avidity : Anti-Measles Viruses ELISA (IgG), «Eu-roimmun» (Германия) - тест indirect-формата. В качестве антигена использован инактивированный лизат клеток BSC-1, инфицированный штаммом Edmon-ston вируса кори. Граница для низкоавидных антител составляет 40%. Индекс авидности, превышающий 60%, указывает на присутствие высокоавидных антител. В каждом исследовании использовали отдельные аликвоты сывороток. Анализ результатов проводили согласно инструкциям. Статистические методы. Достоверность различий между показателями определяли методом Стью-дента и Фишера [1]. Результаты и обсуждение Анамнестические данные больных корью (119 человек) из очагов инфекции показали, что наибольшее число случаев заболевания зарегистрировано среди лиц 17 лет и старше - 76 (63,9%). При этом процент больных старшего возраста колебался от 45,8 (Благовещенск) до 100 (Томск). Среди детей до 7 лет болели преимущественно не достигшие 1 года (86,49%) (табл. 1). Данные прививочного анамнеза заболевших корью показали, что среди детей до 7 лет (37) не привиты по возрасту - 32 и 5 пациентов не привиты по медицинским показаниям; у 42 больных документально подтверждено введение 1 или 2 доз вакцины; вакцинальный статус 40 (33,6%) больных не известен (табл. 2). По предварительным результатам исследования сывороток больных в группах не привитых разного возраста существенные различия не выявлены, в связи с чем они были условно объединены в группу непривитых, а лица, получившие 1 или 2 дозы вакцины, - в группу привитых. Таким образом, непривитые составили 31,1%, а заболевших привитых против кори было 42 (35,3%) пациента. При исследовании 119 сывороток больных корью маркеры острой инфекции (IgM) были выявлены с помощью теста capture-формата в 100% случаев независимо от возраста больного и его прививочного анамнеза, тогда как положительный результат в тесте indirect-формата был ниже - 61,3% (Р < 0,0001). Для 46 (38,7%) сывороток были получены отрицательные и сомнительные результаты (табл. 3). Столь высокий процент отрицательных и сомнительных результатов у больных из очагов инфекции может свидетельствовать о низкой чувствительности теста indirect-формата. Таблица 1 Возрастная структура больных корью Возраст, годы Благовещенск, 2010 г. Бурятия, 2010 г. Томск, 2011 г. Красноярск, 2011 г. Итого абс. % абс. % абс. % абс. % абс. % До 1 года 29 40,3 2 13,3 - - 1 5,0 32 26,9 1,5-7 4 5,6 - - - - 1 5,0 5 4,2 11-14 6 8,3 - - - - - - 6 5,0 17-48 33 45,8 13 86,7 12 100 18 90,0 76 63,9 Все го... 72 15 12 20 119 100,0 Вместе с тем сравнение результатов исследования сывороток в тесте indirect-формата с данными прививочного анамнеза показало, что в сыворотках непривитых больных IgM выявлены в 100% случаев (табл. 4). В сыворотках 29 (69%) из 42 больных с документально подтвержденными данными о прививках маркеры острой инфекции (IgM) определены не были или результат был сомнительным. В группе лиц с неизвестным анамнезом таких больных было 42,5%. Таблица 2 Прививочный анамнез больных корью Прививочный анамнез Всего больных В том числе Благовещенск, 2010 г Бурятия, 2010 г Томск, 2011 г Красноярск, 2011 г Непривитые до 1 года 32 (26,9) 29 2 - 1 Непривитые 1,5 года -7лет 5 (4,2) 4 - - 1 Вакцинация 11 (9,2) 11 - - - Вакцинация + ревакцинация 31 (26,1) 10 11 2 8 Не известен 40 (33,6) 18 2 10 10 В с е г о... 119(100) 72( 60,5) 15 (12,6) 12 (10,1) 20 (16,8) Примечание. Здесь и в табл. 3, 4 в скобках процент. Поскольку возраст больных с отрицательным или сомнительным результатом исследования сывороток составлял 17 лет и более, а большинство из них имели подтвержденные данные о прививках, нельзя исключить вероятность развития вторичного типа иммунного ответа, что в свою очередь может оказывать влияние на результаты лабораторной диагностики инфекции. Подтверждением данного предположения явились результаты исследования 119 сывороток больных, в которых были определены содержание и степень авид-ности антител G-класса. Полученные данные показали, что концентрация IgG была различной и находилась в пределах от 0,24 до 53 МЕ/мл; в сыворотках 20 больных антитела выявлены не были (см. рисунок). Индивидуальные различия в показателях специфических IgG в активной фазе заболевания свидетельствуют о разном анти-тельном ответе на инфекцию, причиной которого может быть исходный коревой статус больного. Результаты определения степени авидности IgG свидетельствовали о том, что антитела, концентрация которых в сыворотках составляла 0,24-7,9 МЕ/мл (2,19 ± 0,7), имели низкую степень авид-ности (1-я группа), тогда как IgG в сыворотках с показателями 10,0-53,0 МЕ/мл (22,34 ± 3,2) были высокоавидными (2-я группа). Полученные данные указывают на бустер-эффект специфических IgG (2-я группа) в активной фазе заболевания (5-6-й день после появления сыпи), выявляемый при вторичном иммунном ответе у лиц, имеющих в анамнезе вакцинацию, тогда как низкая авидность антител G класса или их отсутствие свидетельствуют о первичном иммунном ответе при встрече с диким вирусом. Таблица 3 Результаты исследования сывороток 119 больных корью на содержание IgM с помощью тестов разного формата Тест-система, Результат исследования на IgM формат положительный сомнительный отрицательный VectoMeasles IgM, capture 119(100) - - Enzygnost® 73 (61,3) 20 (16,8) 26 (21,9) Virus/IgM, indirect Таблица 4 Результаты исследования сывороток больных корью в тесте indirect-формата с учетом прививочного анамнеза Прививочный анамнез Всего больных Результат исследования на IgM положительный сомнительный отрицательный Непривитые 37 37 (100,0) - - Привитые 42 13 (31,0) 14 (33,3) 15 (35,7) Не известен 40 23 (57,5) 6 (15,0) 11 (27,5) Всего... 119 73 (61,3) 20 (16,8) 26 (21,9) М-класса были выявлены у всех 59 пациентов (табл. 5). Причем только в этой группе антитела G-класса были низкоавидными (20,6 ± 6,32%). В сыворотках 18 непривитых IgG определены не были, что, по-видимому, связано с замедленным синтезом антител у детей в возрасте до 1 года. Из 42 больных с достоверными сведениями о вакцинации у 4 (9,5%) отмечен первичный тип иммунного ответа. Низкоавидные антитела G-класса были выявлены в сыворотках 18 (45%) из 40 больных, прививочный анамнез которых был неизвестен. Группу лиц с вторичным иммунным ответом составили 38 больных, которые, по документально подтверж- Дальнейший анализ результатов лабораторного обследования больных двух групп с учетом прививочного анамнеза показал, что независимо от формата IgM-теста (indirect или capture) в сыворотках больных с первичным иммунным ответом (1-я группа) антитела денным данным, прошли вакцинацию, и 22 пациента с неизвестным прививочным анамнезом. При использовании теста capture-формата антитела М-класса были выявлены у 100% больных этой группы независимо от прививочного анамнеза, тогда как положительный результат при использовании теста indirect-формата был получен только у 14 (23,3%) пациентов, из которых 9 имели достоверные сведения о вакцинации и у 5 больных прививочный анамнез был неизвестен. Следует также отметить, что в сыворотках всех больных этой группы были обнаружены высокоавидные (97,3 ± 2,9%) G-антитела в высокой концентрации (22,34 ± 3,2 МЕ/мл), что в 10,2 раза превышает подобный показатель в 1-й группе (2,19 ± 0,7 МЕ/мл). Выявленные лабораторные различия позволили провести сравнительный анализ клинических симптомов у детей и взрослых, для которых встреча с вирусом была первичной, а также у лиц 17 лет и старше с первичным и вторичным иммунным ответом (табл. 6). Полученные данные показали, что в группе как с первичным, так и с вторичным иммунным ответом все больные имели пятнисто-папулезную сыпь независимо от возраста. Этапность высыпания была сохранена в 100% случаев у детей и взрослых только в 1-й группе, тогда как во 2-й группе этот показатель составил 80%. Таблица 5 Результаты исследования сывороток больных корью с первичным и вторичным иммунным ответом Прививочный анамнез (всего больных) Первичный иммунный ответ, 1-я группа (59 человек) Вторичный иммунный ответ, 2-я группа (60 человек) indirect capture indirect capture ^М+; авидность IgG < 40% ^М+; IgG- ^М+; авидность IgG > 60% ^М- или с; авидность IgG > 60% ^М+; авидность IgG > 60% ^М- или с; авидность IgG > 60% Непривитые (37) 19 18 - - - - Привитые (42) 2 2 9 29 38 - Неизвестен (40) Примечание 24 18 - 5 . с - сомнительный результат. 17 22 При сравнении клинических показателей у 37 детей и 22 взрослых (1-я группа) установлено, что больных с пятнами Филатова-Коплика было больше среди лиц в возрасте 17 лет и старше (72,7%), тогда как среди детей этот процент составил 24,3 (р < 0,001). Различия в показателях по продолжительности сыпи, температуре и наличию катаральных симптомов были статистически незначимы. Анализ клинических данных у 22 взрослых с первичным и 60 взрослых с вторичным иммунным ответом показал, что у 20% больных 2-й группы нарушена этапность высыпания. Во 2-й группе было статистически значимо меньше лиц с тремя катаральными симптомами (р < 0,0001) и с пятнами Филатова-Коплика (р < 0,001). № сывороток 1-я группа ■ 2-я группа Содержание IgG в сыворотках больных. 1-я группа - 59 больных, в сыворотках которых выявлены низкоавидные IgG (20,6 ± 6,32%); 2-я группа - 60 больных, в сыворотках которых выявлены высокоа-видные IgG (97,3 ± 2,91%). В результате анализа клинических данных у детей и взрослых (1-я группа) установлено, что корь у непривитых взрослых протекает тяжелее. Именно среди них были зарегистрированы 4 тяжелых случая кори; легкие и атипичные формы заболевания выявлены не были. Повторная встреча с вирусом кори 60 лиц в возрасте 17 лет и старше на фоне вторичного иммунного ответа привела к развитию типичной (среднетяжелой у 70%, легкой у 18,3%) и атипичной (у 11,7%) формы заболевания. Несмотря на то что корь является одним из высококонтагиозных заболеваний, по мнению ведущих специалистов, элиминация коревой инфекции возможна, так как корь протекает в основном манифестно, вирус имеет единственный серотип, единственного хозяина - человека. Кроме того, живая коревая вакцина является наиболее оптимальным и эффективным средством борьбы с корью [2, 3, 9, 10, 17]. Однако первичные и вторичные неудачи вакцинации, миграционные процессы, вовлечение в эпидпроцесс ранее привитых и лиц с неизвестным анамнезом осложняют эпидситуацию, порождают ряд проблем, связанных с лабораторной диагностикой коревой инфекции, которые могут с годами увеличиваться не только в развивающихся странах [8, 13, 16]. Результаты исследования сывороток 119 больных корью показали, что тесты capture-формата выявляют маркеры острой инфекции (IgM) в 100% случаев, независимо от возраста и прививочного анамнеза больного. Положительный (100%) результат в тесте indirect-формата был получен при исследовании сывороток непривитых больных, тогда как в группе больных с вторичным иммунным ответом этот показатель составил 23,3 ± 5,5%. Вторичный иммунный ответ развивается быстрее, и интенсивность его гуморальных и клеточных факторов во много раз выше, чем первичного. Высокая концентрация (22,34 ± 3,2 МЕ/мл) высокоавидных (97,3 ± 2,91%) антител G-класса в сыворотках больных с вторичным иммунным ответом может быть одной из причин не выявления IgM с помощью тестов indirect-формата у большинства больных (76,7%). Вместе с тем чувствительность теста capture-варианта позволяет выявлять антитела М-класса, что, вероятно, связано с его модификацией, предусматривающей удаление IgG в первой стадии постановки ИФА. В результате сравнительного анализа клинических симптомов, результатов лабораторного обследования лиц с первичным и вторичным иммунным ответом установлено, что дикий вирус может вызывать у больных, получивших ранее 1-2 дозы вакцины, развитие различных форм заболевания, что подтверждают данные литературы [6-8, 13]. Результаты наших исследований показали, что у непривитых корь протекала типично: в среднетяжелой (93,2%) и тяжелой (6,8%) форме. В группе лиц с вторичным иммунным ответом заболевание было типичным у 53 (88,3%) больных и у 7 (11,7%) - атипичным. Значимость лабораторных исследований у таких больных велика не только с точки зрения подтверждения диагноза кори, но и для оценки степени вовлеченности таких пациентов в распространение вируса в условиях высокоиммунизированной популяции. так, по данным зарубежных авторов, среди лиц, имевших контакт с больным корью (атипичная форма), случаи распространения инфекции зарегистрированы не были [13]. В то же время при обследовании одного из очагов инфекции было установлено, что у заболевшей женщины сыпь появилась 23.05.2011, а через 12 дней (03.06.2011) при тесном контакте в семье сыпь была зарегистрирована у мужа. Оба пациента в прошлом получили 2 дозы коревой вакцины, корь протекала типично, в легкой форме на фоне вторичного иммунного ответа. Однако в связи с малочисленностью подобных наблюдений в стране и за рубежом полноценно оценить роль больных с вторичным типом иммунного ответа в распространении вируса не представляется возможным. Велика вероятность того, что его распространение зависит от формы заболевания источника инфекции, продолжительности контакта и наличия восприимчивого контингента в популяции. таким образом, необходимость лабораторного подтверждения случаев кори, выявленные особенности тестов на ^М разного формата, высокая концентрация антител G-класса в активной фазе заболевания у больных с вторичным иммунным ответом свидетельствуют о целесообразности отбора диагностических тестов с учетом их модификации, чувствительности и специфичности. При этом нельзя забывать о появлении не только ложноотрицательных ^М, как было показано в нашей работе при использовании тестов таблица 6 Клинические показатели у больных корью с первичным и вторичным иммунным ответом Клинический по Больные с первичным иммунным ответом (1-я группа) Больные с вторичным иммунным ответом (2-я группа) казатель дети (37) взрослые (22) взрослые (60) Пятнистопапулезная сыпь, % 100 100 100 Этапность высыпания, % 100 100 80,0±5,2 Продолжительность сыпи, дни (среднее) 4,6±0,15 5,3±0,23 3,8±0,08 температура, C° (среднее) 38,8±0,10 39,2±0,11 38,5±0,05 Продолжительность температуры, дни, (среднее) 3,9±0,23 5,3±0,29 3,2±0,11 Кашель, % 94,59±3,7 100 56,67±6,4 Насморк, % 86,49±5,6 86,36±7,3 48,33±6,5 Конъюнктивит, % 78,38±6,8 86,36±7,3 35,0±6,2 Лица с кашлем, насморком, конъюнктивитом, % 67,57±7,7 86,36±7,3 46,67±6,4 Пятна Филатова-Коплика, % 24,3±7,05 72,7±9,5 15,0±4,6 Энантема, % 64,86±7,8 68,18±9,9 51,67±6,5 indirect-формата, но и ложноположительных ^М, причиной которого, помимо присутствующего в сыворотке крови ревматоидного фактора, могут быть IgM к разным инфекционным и неинфекционным агентам [20]. Выводы 1. Установлено, что при лабораторной диагностике кори (выявление IgM) у больных, не привитых против этой инфекции, могут быть использованы тесты как capture, так и indirect-формата. 2. Для лабораторной диагностики кори у лиц, получивших в прошлом 1-2 прививки, а также у пациентов с неизвестным анамнезом целесообразно использовать IgM-тесты capture-формата. 3. Для ответа на вопрос о роли атипичных, манифестных случаев кори с вторичным иммунным ответом в распространении вируса в популяции необходимо получение большего объема достоверной информации.

References

Supplementary files