Molecular genetic analysis of Tahyna virus strains

Abstract

The partial nucleotide sequence of S and M genome segments was identified in 13 little studied Tahyna virus (Bunyaviriridae, Bunyavirus, California encephalitis serogroup) strains isolated in Czechoslovakia, Finland, Armenia, Azerbaijan, Kazakhstan, and Tajikistan. A phylogenetic analysis indicated that the examined strains form two groups with a geographical connection: European and Asian genetic groups

Full Text

Вирус Тягиня, относящийся к роду Bunyavirus семейства Bunyaviridae, был впервые выделен в Чехословакии в 1958 г. [5]. Он входит в состав серокомплек-са вируса калифорнийского энцефалита, к которому относятся также вирусы Инко, зайца-беляка и др. [9]. Переносчиками вируса Тягиня являются комары. Вирус распространен в Восточной и Западной Европе, Закавказье, странах Средней Азии, Китае и Африке [4, 9]. Установлена его активная циркуляция в южных регионах России. Наиболее напряженные очаги лихорадки Тягиня находятся в Астраханской области в дельте Волги [2]. Доказана циркуляция вируса в Волгоградской, Саратовской, Ростовской, Московской, Рязанской областях, Калмыкии и других регионах [7, 8]. Вирус Тягиня вызывает заболевание, протекающее как без поражения ЦНС (92,5%), так и с синдромом острой нейроинфекции (редко). Инкубационный период составляет 3-7 дней. Полиорганность поражения в результате вовлечения в патологический процесс бронхолегочной системы, почек, печени, ЦНС свидетельствует о возможности генерализации инфекции [1, 2]. Вирус Тягиня является оболочечным со спиральным строением нуклеокапсида, имеет сферическую форму. На поверхности в равных количествах присутствуют два структурных гликопротеина - Gn и Gc. Геном вируса состоит из 3 сегментов однонитчатой РНК негативной полярности - S, M и L - и имеет организацию, характерную для всех буньявирусов. L-сегмент кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу. М-сегмент кодирует полипротеин, включающий в себя гликопротеины Gn и Gc и неструктурный белок NSm. S-сегмент - нуклеокапсидный N-белок и неструктурный белок NSs в перекрывающихся рамках считывания [6, 11, 12]. Наличие сегментированного генома, одновременная активность в эндемичном районе двух или нескольких Контактная информация: Кузьмина Ксения Евгеньевна, науч. сотр.; e-mail: arboelisa@mail.ru Таблица 1 Использованные в работе штаммы вируса Тягиня Штамм Место выделения Источник выделения Год выделения Az-F Азербайджан Aedes vexans 1978 Yerevan Армения Anopheles maculipennis Culex pipiens 1990 P6b Чехословакия Кровь больного 1975 T-16 II " " 1974 CT-39 II Culicoides sp. 1986 La 65 II Culiseta annulata LL 1974 129 M3 II * * 251 H2 II * * 2014 M3 II * * 7643 M3 II Aedes sticticus 1975 2008 Финляндия * * 525 Таджикистан Aedes caspius 1986 Kaz-5957 Казахстан Anopheles maculipennis 1987 Примечание. * - сведения о выделении отсутствуют. близких буньявирусов, общность видового состава их естественных переносчиков и резервуаров создают реальные предпосылки для появления генетически измененных вариантов штаммов вируса Тягиня [10]. Ранее филогенетический анализ штаммов вируса Тягиня был выполнен в основном для штаммов, циркулирующих в Чехословакии и Китае. Нуклеотидные последовательности штаммов из других регионов в базе данных GenBank отсутствуют. Цель настоящего исследования заключалась в молекулярно-генетической характеристике малоизученных штаммов вируса Тягиня, изолированных из комаров и крови больных на территориях европейских и азиатских стран, и выяснении их таксономического положения. На основании филогенети- Таблица 2 Первичная структура олигонуклеотидов, использованных в работе Сегмент вирусного № Нуклеотидная последовательность 5' ^ 3' Назначение генома 1 TGG CTA GAT GGG TGC TAG AGC 2 TTG TGG GCT CTT GGG GAA C 3 TTT GTC ATT ACT TGA GAT ACC GA 4 AAA CAT TTC TGT GCC (T/C)GG GA 5 AAA GTC AAT TCA CAA GTT CCA 6 TAT AGA TTT AGG CCC ACA AGA 7 GCA CAA CTT ATA TCA CCC TTG 8 TAG ATA AAA TAG AAG CTG GCC 9 GGG AGT GAC AAA AGT AAG GAT 10 TAA TGG AGA CTT CAC AAA CAA 11 TGT TTA AGT TGG GTG TAC TCA 12 CCT TAC ACC ACG CAT TTA GAG 13 CGT GGG ATC TCA AGT AAA CC 14 TCC AAA GGG CCA GCT T 15 TAT ATC CGC CTC ACC ACT Секвенирование Секвенирование, ПЦР S Секвенирование Секвенирование, ПЦР Секвенирование M Секвенирование, ПЦР Секвенирование Секвенирование, ПЦР ческого анализа последовательностей сегментов S и M нами построены дендрограммы, которые демонстрируют разделение исследуемых штаммов по географическому признаку. Материалы и методы В работе использовали 13 штаммов вируса Тяги-ня из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского (табл. 1), ранее идентифицированных как штаммы вируса Тягиня с помощью серологических методов (реакции связывания комплемента, метода флюоресцирующих антител, реакции нейтрализации, иммуноферментного анализа и лантаноидного имму-ноферментного анализа) [3]. Все штаммы прошли серию пассажей на 2-дневных мышах-сосунках при внутримозговом заражении. Вирусную РНК выделяли из мозговой ткани мышей-сосунков с применением Trizol Reagent (“Life Technology”, США) по методике производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием праймеров Random6 (“Синтол”, Россия) и обратной транскриптазы (M-MLV, “Sigma”, США) по методике производителя. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) выполняли на амплификаторе Терцик (“ДНК-технология”, Россия) в одностадийном варианте. В работе использовали синтетические олигонуклеотиды (“Син-тол”, Россия). Праймеры подбирали с помощью программы PriemerPremier5 (“Priemer Biosoft International”, США) с использованием нуклеотидных последовательностей из базы данных GenBank. Последовательность праймеров и их назначение приведены в табл. 2. Амплификацию фрагментов генома исследуемых штаммов вируса Тягиня выполняли в следующем режиме: 94°C, 5 мин - 1 цикл; (94°C - 15 с, 57°C - 15 с, 72°C - 20 с) - 30 циклов; 72°C, 7 мин - 1 цикл. Секвенирование нуклеотидных последовательностей проводили по методу Сэнгера с использованием BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v.3.1 (“Applied Biosystems”, США) согласно инструкции производителя. Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секвенаторе ABi PRISM 3130 (“Applied Biosystems”, США). При выравнивании нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей использовали пакет программ Lasergene (“DNASTAR”, США). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили на основе алгоритма “ближайшего соседа” в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры в программе MegAlign (“DNAS-TAR”, США). Результаты и обсуждение Для амплификации фрагментов геномов исследованных штаммов были использованы олигонуклеотидные праймеры, подобранные по представленным в базе данных GenBank нуклеотидным последовательностям вируса Тягиня. Методом ПЦР были получены нуклеотидные последовательности S-сегмента, соответствующие открытой рамке считывания (708 п. н.), и фрагменты M-сегмента (2550 п. н., начиная с ATG-кодона), кодирующие белки Gn, NSm и Gc (частично). Нуклеотидные последовательности сегментов S и M исследуемых штаммов были выровнены с соответствующими нуклеотидными последовательностями вирусов Тягиня и Лумбо из базы данных GenBank. Нуклеотидные замены (хЮО) Рис. 1. Дендрограмма, показывающая степень филогенетического родства исследованных штаммов, основанная на анализе нуклеотидной последовательности участка гена, кодирующего полипротеин (2550 п. н., М-сегмент). Филогенетический анализ по нуклеотидным последовательностям участка М-сегмента показал высокую степень филогенетического родства исследованных штаммов с прототипным штаммом Bardos вируса Тягиня (НМ036209). При этом оказалось возможным выделить две группы штаммов: штаммы из Азии (Казахстан, Таджикистан и Азербайджан) со степенью филогенетического родства со штаммом Bardos, в среднем соответствующей 95% гомологии, и группу европейских штаммов со степенью филогенетического родства со штаммом Bardos, соответствующей 98,4-99,9% гомологии (рис. 1). В качестве дополнительного критерия была использована степень филогенетического родства между исследуемыми штаммами вируса Тягиня и вирусом Лумбо, которая соответствовала 79,180,1% гомологии; исследуемыми штаммами и штаммом XJ0708 вируса Тягиня, выделенным в Китае (представлен в базе данных GenBank), которая соответствовала 79,4-80,1% гомологии (при этом степень филогенетического родства вируса Лумбо и штамма XJ0708 вируса Тягиня соответствовала 79,1% гомологии). 5,5 Анализ последовательностей по участкам S-сегмента, соответствующих нуклеокапсидному N-белку (от ATG до стоп-кодона), также показал высокую степень филогенетического родства исследованных штаммов с прототипным штаммом Bardos (HM036208) и разделение их на две группы - европейскую и азиатскую (рис. 2). 2,3_ Филогенетический анализ по нуклеотидным последовательностям участка S-сегмента, соответствующего неструктурному белку NSs (сдвиг рамки считывания, от ATG до стоп-кодона, 294 п. н.), дал не- 2008 Yerevan Bardos Ь 251 -Т16 - 2014 La65 P6b ST39 — 129 — 7643 Kaz-5957 525 Az-F XJ0708 Lumbo virus —I-1- 4 2 Нуклеотидные замены (хЮО) Рис. 2. Дендрограмма, показывающая степень филогенетического родства исследованных штаммов, основанная на анализе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего нуклеокапсидный белок N (708 п. н., S-сегмент). Т16 Yerevan ST39 Р6Ь La65 Bardos 7643 2014 129 251 2008 525 Az-F Kaz-5957 XJ0708 Lumbo virus Нуклеотидные замены (х100) Рис. 3. Дендрограмма, показывающая степень филогенетического родства исследованных штаммов, основанная на анализе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего неструктуренный белок NSs (294 п. н., S-сегмент). сколько иную картину. Исследуемые штаммы также формируют две группы (рис. 3), как и в случае анализа последовательностей, соответствующих структурному N-белку S-сегмента. Одна группа представлена европейскими штаммами со 100% идентичностью про-тотипному штамму Bardos. К другой группе, помимо штаммов из Казахстана, Таджикистана и Азербайджана, относится также китайский штамм XJ0708 со степенью филогенетического родства с прототипным штаммом Bardos, соответствующей около 98,5% гомологии. При этом каждый из исследованных азиатских штаммов оказался уникальным как по нуклеотидной, так и по аминокислотной последовательности. Из результатов филогенетического анализа, проведенного по кодирующим нуклеотидным последовательностям S-сегмента, а также по участкам М-сегмента, видно, что все исследуемые штаммы достаточно близки прототипному штамму Bardos и являются штаммами вируса Тягиня. В данной работе мы сравнили также нуклеотидные последовательности исследуемых штаммов между собой по сегментам генома S и M. Результаты анализа по нуклеотидным последовательностям S-сегмента (без 3'- и 5'-нетранслируемых областей), а также по участкам М-сегмента показали, что штаммы разделились на две группы (см. рис. 1-3). В первую группу вошли штаммы, выделенные в Чехословакии, Финляндии и Армении, - P6b, T-16, CT-39, La 65, 129 M3, 251 H2, 2014 M3, 7643 M3, 2008, Yerevan. Вторая группа представлена штаммами, выделенными в Азии, - Az-F, Kaz-5957, 525. Таким образом, проведенные исследования показали, что географические изоляты следует рассматривать как варианты вируса Тягиня. Исследуемые штаммы разделились по географическому признаку; штаммы, формирующие отдельную азиатскую генетическую группу, существенно отличаются от штаммов, циркулирующих в Европе. Авторы выражают глубокую благодарность В. Л. Громашевскому, З. Губалеку, В. А. Казаряну, Я. Капецки, С. К. Каримову и Отделу вирусологии Хельсинкского университета за предоставление использованных в данной работе штаммов вируса Тягиня.