Analysis of the Polymorphism of the Genome region of HIV-1 encoding the Fusion Protein

Full Text

Жизненный цикл ВИЧ-1 является сложным многостадийным процессом, и первая из важнейших его стадий - проникновение вируса в клетку хозяина. Основными участниками процесса проникновения вируса в клетку являются поверхностные гликопротеины (env) ВИЧ-1 gp120 и gp41, а также молекулы хозяйской клетки, расположенные на поверхности клеточной мембраны, - рецептор CD4 и корецепторы CCR5 или CXCR4. Эти рецепторы имеют определенное сродство к разным клеткам: CCR5 чаще обнаруживаются на поверхности макрофагов, а CXCR4 - на мембране T-хелперов, хотя иногда можно встретить T-клетки, имеющие оба рецептора. Гликопротеины имеют вид “гвоздика”, где “ножка” представляет собой gp41, а “шляпка” - gp120. Молекула gp41 “заякорена” в мембране вирусной частицы с помощью трансмембранного домена. Поверхностные гликопротеины собраны в тримеры, включающие 3 молекулы gp41 и 3 молекулы gp120. Процесс проникновения состоит из трех основных этапов (рис. 1). На первом этапе происходит взаимодействие гликопротеина gp120 ВИЧ-1 с рецептором CD4 (потенци альная мишень ингибиторов присоединения). На втором этапе происходит связывание gp120 с корецептором CCR5 или CXCR4 (мишени блокато-ров корецепторов), после чего конформационные изменения приводят к отделению (диссоциации) gp120 от gp41, и фузионный пептид проникает в мембрану CD4-клетки. В третьей, финальной стадии происходят конфор-мационные изменения в структуре молекулы гликопротеина gp41 (мишень ингибиторов слияния), в результате которых он сокращается, вирусная и клеточная мембраны сливаются, а содержимое вирусной частицы попадает в клетку [9]. Очевидно, каждый из описанных этапов может служить мишенью ингибирующего воздействия. В соответствии с этими этапами существующие на сегодняшний день 3 группы антиретровирусных препаратов, объединяемых в группу ингибиторов проникновения, подразделяются на ингибиторы присоединения (пока находящиеся в стадии разработки), блокаторы корецепторов и ингибиторы слияния. В данной статье будет рассмотрен представитель по Контактная информация: Васильев Александр Вячеславович, науч. сотр.; e-mail: vasilye@yandex.ru 9 Рис. 1. Механизм взаимодействия поверхностных гликопротеинов env ВИЧ-1 с рецепторами клеточной мембраны. Рис. 2. Строение гликопротеина gp41 ВИЧ-1. а - схема строения гликопротеина gp41 ВИЧ-1; б - скручивание областей N36 и C34 в спираль и образование трехмерной структуры в виде "вязанки дров". следней группы лекарственных препаратов - Фузе-он, объектом воздействия которого является процесс слияния, базирующийся на функции белка gp41. Трансмембранный белок gp41 (рис. 2) включает гидрофобный фузионный пептид (FP, от английского fusion - слияние) на N-конце, “заякоривающий” gp41 в липидном бислое клетки хозяина, 2 гидрофобные а-спирали - HR1 и HR2 (hapted region 1 и 2) и гидрофобный трансмембранный домен (ТМ), который удерживает всю конструкцию env в липидном бислое вирусной мембраны [10]. Вначале спирализованные области HR1 и HR2 “закручиваются” в спирали (сверхскручивание); образовавшиеся 6 “суперспиралей” (3 пары областей HR1 и HR2) образуют структуру, напоминающую “вязанку дров” (см. рис. 2). Образование такой структуры приводит к сильному укорочению молекулы белка gp41, что в свою очередь ведет к сближению и завершаю щему слиянию вирусной и клеточной мембран [9]. Ингибитор слияния энфувиртид (Фузеон) - синтетический пептид, имеющий массу 4492 и состоящий из 36 аминокислот, имитирует C-концевой участок HR2 гликопротеина gp41 и конкурентно связывается с HR1, при этом блокируется взаимодействие между HR1 и HR2, в результате чего конформационные изменения gp41, необходимые для слияния мембран вируса и клеток, не происходят. Препарат хорошо зарекомендовал себя в качестве средства для лечения пациентов в поздних стадиях ВИЧ-инфекции, когда другие возможности в основном исчерпаны. Тем не менее феномен резистентности не обошел и эн-фувиртид: показано, что эффективность лечения Фузеоном может снизить точечная мутация генома ВИЧ-1 с заменой всего одной аминокислоты в участке HR1 [2]. Мутации резистентности к эн-фувиртиду появляются относительно быстро, но, как это характерно для мутаций лекарственной устойчивости, оказывают и обратное действие, снижая фитнес ВИЧ [3]. Утрата эффективности препарата в основном связана с появлением мутаций в участке гена, кодирующем участок связывания энфувиртида (участок гептадных повторов 1 (HR1) гена, кодирующего gp41). Мутации, ассоциированные с устойчивостью, возникают в кодонах 36-45 участка гена, кодирующего HR1, в том числе: G36D/E/S/V, 137V, V38A/M/E/G, Q39R/H, Q40H/K/P/R/T, N42T/ D/S/H/Q, N43D/K/S/Q, L44M и L45M/L [1-4, 6-10]. Часть этих данных была получена на культурах клеток, другие были выявлены в ходе клинических исследований. Эти мутации уменьшают эффективность процесса слияния, тем самым снижая жизнеспособность вируса. Наиболее важную роль в развитии устойчивости ВИЧ-1 к энфувиртиду относят на счет мутаций в положении 36-38, т. е. в составе мотива из трех аминокислот (GIV). Аминокислотные замены Q39H и N42S, представляющие собой проявление природного полиморфизма генома ВИЧ-1, не оказывают существенное влияние на резистентность ВИЧ-1 к энфувиртиду. Мутации в данных позициях, напротив, связаны с природной гиперчувствительностью вируса к энфувиртиду, проявляющейся снижением эффективной дозы препарата и коэффициента резистентности [4, 7, 8]. Коэффициент резистентности (так называют отношение IC50 (концентрации препарата, которая по 10 давляет репликацию вируса на 50%) исследуемого штамма к IC50 контрольного штамма (вируса дикого типа)), который может составлять от < 10 до нескольких сотен, зависит от положения заменяемой аминокислоты (точнее, от номера кодона в участке гептад-ных повторов 1) и от того, какая аминокислота заменила «дикую» в указанном положении. Снижение чувствительности больше при сочетанных двойных мутациях, чем при одиночных. При наличии двойных мутаций G36S+L44M, N42T+N43K, N42T+N43S или Q40H+L45M в участке HR1 IC50 превышает 250. Данные по изменению IC50 при различных аминокислотных заменах на участке HR1 gp41 представлены в табл. 1 [7]. В нескольких исследованиях были также выявлены вспомогательные мутации в участке гена, кодирующего HR2 (а именно N126K, E137K и S138A), способные повышать фитнес вируса, имеющего мутации устойчивости на участке HR1 [8]. Так, у изолятов вируса с единичной мутацией G36D на участке HR1 IC50 составлял от 4 до 450, при этом у изолятов с IC50 450 выявлялась также гетерозиготная замена в кодоне 126 участка гена, кодирующего HR2 (N/K) [3]. В ограниченном исследовании [11] у 6 из 17 пациентов с вирусологической неэффективностью лечения энфувиртидом дополнительно появлялась мутация S138A в участке гена, кодирующем участок HR2 гликопротеина gp41, которая в большинстве случаев сочеталась с мутацией в кодоне 43 участка гена, кодирующего участок HR1 гликопротеина gp41, а также с различными полиморфизмами участка гена, кодирующего участок HR2. Репликативная способность вируса при наличии мутаций в участке гена, кодирующего HR1, как правило, существенно снижается по сравнению с вирусом дикого типа. По убыванию репликативной способности вирус дикого типа и мутантные штаммы можно расположить в следующем порядке: вирус дикого типа > N42T > V38A > N42T, N43K « N42T, N43S > V38A, N42D « V38A, N42T. Как правило, наблюдается обратная корреляция между репликативной способностью вируса и его резистентностью к энфувиртиду [3, 8]. Следует отметить, что подавляющее большинство (более 90%) зарегистрированных к настоящему моменту случаев ВИЧ-инфекции на территории СНГ вызвано одним и тем же вариантом подтипа А вируса (IDU-A). Этот вариант, получивший широкое распространение среди наркоманов России и их гетеросексуальных партнеров, доминирует в нашей стране и заметно отличается от всех остальных распространенных в мире вариантов ВИЧ-1. В связи с уникальностью данного варианта действие и эффективность антиретровирусных препаратов в отношении него могут иметь особенности. Сведения о мутациях резистентности к энфувиртиду у российского варианта IDU-A в литературе полностью отсутствуют. Цель настоящей работы заключалась в исследовании распространенности первичных мутаций резистентности к энфувиртиду (на участке HR1 белка gp41) и вспомогательных мутаций на участке HR2 среди вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России и на территории стран СНГ. Было также проведено сравнение полученных данных с результатами аналогичных исследований, выполненных в странах дальнего зарубежья. Таблица 1 Изменение коэффициента резистентности ВИЧ-1 к энфувиртиду при различных аминокислотных заменах на участке HR1 gp41 (по данным литературы) Аминокислотные замены Коэффициент резистентности G36D/N42T > 1000 G36V/N42D > 1000 V38E > 1000 V38E/N42S 513 V38A/L44M 283 V38A/N42D 140 G36D/137V 82 G36E 39,3 V38M 26 Q40H 10-28,4 137V/N43S 11 N43S 5,6-6 N42T 3,8-4 137V 3,2 L44M 1,8-2 N42S 0,5-1 Q39R 0,4 Q39H 0,13-0,2 Материалы и методы В работе были проанализированы 40 последовательностей генома ВИЧ-1, полученные в России (29). Казахстане (7) и Киргизии (4), независимо от стадии инфекции. Хромосомная ДНК, включающая провирус ВИЧ-1, была взята из коллекции лаборатории вирусов лейкозов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского. Образцы хранили при -20°C. Среди пациентов были как получавшие специфическую антиретровирусную терапию, так и «наивные». В работе использовали следующие праймеры для постановки двух раундов ПЦР (по данным литературы) [9]. Для первого раунда: L3’env: GGTGGTAGCTGAAGAGGCACAGG; L5’gp41: TTCAGACCTGGAGGAGGAGATA. Для второго раунда: L3’HR2: GGTGAGTATCCCTGCCTAACTCT; L5’HR1: AGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAA. Кроме того, были подобраны праймеры, адаптированные к варианту ВИЧ-1 IDU-A подтипа А, распространенного на территории России и стран СНГ. Для первого раунда: L3’env(A): GGTGGTAGCTGAAGAGACACAGG; L5’gp41(A): TTCAGACCTATAGGAGGAAATA. Для второго раунда: L3’HR2(A): GGTGAGTATCCCTGCCTGGCTCT; L5’HR1(A): AGAAGAGTGGTGGAGAGAGAAAA. В результате ПЦР получали фрагменты генома ВИЧ-1 с координатами 7754-8342 (относительно штамма HXB2, регистрационный номер в GenBank K03455). Полученные фрагменты подвергали секве-нированию, анализ проводили, как описано в работе [5]. Филогенетический анализ последовательностей и генотипирование ВИЧ-1 осуществляли с помощью компьютерной программы MEGA 4. 11 Результаты и обсуждение В работе были получены 40 последовательностей участка HR1 гена gp41 вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории России и стран СНГ. Среди исследуемых образцов 12 относились к подтипу A1, 8 - к подтипу B, 6 - к подтипу G, 8 - к рекомбинанту A/B (ген env - от подтипа B) и 6 образцов - к рекомбинанту A/G (ген env - от подтипа A). Подтип в каждом из образцов определяли по генам env, gag и pol в ранее проведенных исследованиях. Анализ первичной структуры данной области генома показал наличие следующих мутаций в позициях, потенциально ассоциированных с устойчивостью вируса к энфувиртиду на участке HR1 gp41: Q39H (в 2 образцах из 40, 5%), N42s (в 12 образцах из 40, 30%), N42G (в 1 образце из 40, 2,5%) (табл. 2). Были также выявлены вспомогательные мутации на участке HR2, в частности мутация N126K в 1 образце (частота встречаемости 2,5%), мутация E137K в 10 образцах (частота встречаемости 25%). Из литературы известно, что мутации Q39H и N42S не являются мутациями лекарственной устойчивости к энфувир-тиду, а представляют собой проявление природного полиморфизма вируса, ассоциированного с повышенной чувствительностью вируса к энфувиртиду [4, 8]. Замена N42S присутствовала во всех образцах из России, отнесенных по результатам генотипирования различных областей генома к подтипу A1. Кроме того, на исследованном участке генома обнаружена замена, не описанная в литературе как мутация устойчивости, - N42G. Поскольку эта замена локализована в той же позиции, которая в случае мутаций N42T/D/H/Q ассоциирована с резистентностью, она заслуживает внимания как потенциально способная влиять на устойчивость вируса. Выявленные вспомогательные мутации N126K и E137K на участке HR2 могут способствовать развитию резистентности ВИЧ-1 к энфувиртиду и повышению фитнеса в случае появления мутаций резистентности на участке HR1. Особенно высока частота встречаемости мутации E137K (25%), которая, по всей вероятности, является характерным природным полиморфизмом данных вариантов вируса. Частота встречаемости мутации N126K составляет 2,5% среди всех образцов и 8,3% среди образцов подтипа A1. Интерес представляло сравнение полученных нами результатов по распространенности мутаций, ассоциированных с устойчивостью к энфувиртиду, среди «наивных» пациентов с аналогичными данными, по- Таблица 2 Результаты анализа наличия мутаций резистентности к энфувиртиду в образцах, исследованных в данной работе Область gp41 Выявленная мутация Частота встречаемости среди всех образцов Частота встречаемости среди образцов, принадлежащих к варианту IDU-A абс. % абс. % HR1 Q39H 2 5 0 0 N42S 12 30 12 100 N42G 1 2,5 0 0 HR2 N126K 1 2,5 1 8,3 E137K 10 25 3 25 лученными зарубежными исследователями. Так, в исследовании, проведенном в США [8], были изучены 175 образцов от «наивных» пациентов. Все образцы принадлежали подтипу B. Как и в нашем исследовании, мажорные мутации (с более чем 10-кратным уменьшением чувствительности к энфувиртиду) выявлены не были. Были обнаружены 6 (3,4%) образцов с минорными мутациями устойчивости к энфувир-тиду на участке HR1 (V38G, N43K, L44M, L45M). Мутация V38G была найдена в 2 образцах (частота встречаемости 1,1%), мутация L44M - в 3 образцах (частота встречаемости 1,7%), и еще в 1 образце были обнаружены 2 мутации одновременно - N43K и L45M. Как и в настоящем исследовании, указанными авторами была выявлена высокая частота встречаемости мутации N42S (16%, наблюдалась у 28 пациентов), ассоциированной с повышенной чувствительностью вируса к энфувиртиду, при этом у 2 пациентов данная мутация сочеталась с мутацией устойчивости L44M, а один из них имел также вспомогательную мутацию E137K на участке HR2. Вспомогательная мутация E137K была выявлена в 27 (15,4%) образцах, мутация S138A - в 15 (8,6%), и мутация N126K не была выявлена. Как можно видеть, по набору вспомогательных мутаций образцы из США отличаются от образцов из СНГ. В отличие от образцов из США среди образцов из СНГ мутация S138A выявлена не была, зато была обнаружена мутация N126K (с частотой 2,5%), не выявленная среди образцов из США. Частота встречаемости мутации E137K среди образцов из США примерно в 1,5 раза выше, чем среди наших образцов. В рамках той же работы [8] 5 из 6 образцов, имеющих мутации устойчивости на участке HR1, были исследованы на чувствительность к энфувиртиду фенотипическим методом. Из проанализированных образцов только один имел сниженную чувствительность к этому препарату (образец с набором мутаций N42S + L44M + E137K), для него увеличение IC50 составило 24. Остальные образцы оказались вполне чувствительными к энфувиртиду. Таким образом, можно сделать вывод, что среди «наивных» к энфувиртиду пациентов с подтипом B ВИЧ-1 на территории США мутации устойчивости встречаются чаще, чем среди исследованных нами пациентов на территории СНГ, хотя частота встречаемости данных мутаций низка. В Италии проводилось исследование мутаций, ассоциированных с успешностью лечения ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих энфу-виртид [4]. В рамках данной работы была изучена распространенность мутаций, ассоциированных с устойчивостью к энфувиртиду, среди 55 “наивных” пациентов. Все образцы принадлежали к подтипу B. Как и в нашем случае, исследователями были выявлены мутации на участке HR1, связанные с гиперчувствительностью к энфувиртиду [4, 7]: Q39H (в 2 образцах, 3,6%) и N42S (в 9 образцах, 16,4%). Помимо данных мутаций полиморфизма, в этом исследовании в 1 (1,8%) образце была обнаружена мутация устойчивости N42D. Данных об изменении IC50 для одиночной мутации N42D нет, однако известно, что сочетание мутаций G36V + N42D повышает IC50 до более 1000, а сочетание мутаций V38A + N42D -до 140 [7]. 12 В итальянском исследовании, как и в нашем, была выявлена высокая частота встречаемости вспомогательной мутации E137K на участке HR2 (30 образцов, 54,5%), однако вспомогательная мутация N126K не была выявлена. Как видно из представленных данных, распространение мутаций, ассоциированных с устойчивостью ВИЧ-1 к энфувиртиду, в Италии имеет сходство с данными на территории СНГ, но имеются и отличия (присутствие мутации N42D и отсутствие мутации N126K). Исследование распространенности мутаций устойчивости к энфувиртиду среди «наивных» пациентов проводилось также в Пакистане [9] на примере 100 образцов. Мутации, ассоциированные с устойчивостью к энфувиртиду в кодонах 36-45 участка HR1, в данном исследовании выявлены не были, однако отмечена очень высокая частота встречаемости вспомогательной мутации S138A на участке HR2 (88 образцов, 88%), что, очевидно, является характерным полиморфизмом вируса из данного региона. В то же время в отличие от вариантов вируса из СНГ мутации E137K и N126K на участке HR2 отсутствуют, так же как и мутации полиморфизма Q39H и N42S. Выводы. 1. Собственно мутации лекарственной устойчивости к энфувиртиду в проведенном нами исследовании среди образцов из России и стран СНГ выявлены не были. 2. В позициях, ассоциированных с мутациями устойчивости, с высокой частотой (35%) были обнаружены мутации природного полиморфизма, ассоциированные с повышенной чувствительностью к энфу-виртиду и не являющиеся мутациями лекарственной устойчивости. 3. С высокой частотой (27,5%) выявлены вспомогательные мутации N126K и E137K на участке HR2, также являющиеся природным полиморфизмом вируса. Данные мутации могут способствовать развитию резистентности ВИЧ-1 к энфувиртиду и повышению фитнеса в случае появления мутаций резистентности на участке HR1. Данная работа выполнена при финансовой поддержке Седьмой рамочной программы Европейского Союза по проекту «Collaborative HIV and Anti-HIV Drug Res

References

Supplementary files