Effect of Ingavirin® on the ultrastructure of the morphogenesis of adenovirus infection in vivo

Full Text

Проблема поиска химиопрепаратов, способных эффективно подавлять репродукцию аденовирусов и перспективных для практической медицины, весьма важна. Это обусловлено тем, что аденовирусы широко распространены, вызывают разнообразные по клиническим проявлениям и часто тяжело протекающие заболевания и, кроме того, устойчивы к большинству уже известных препаратов, эффективных в отношении других ДНК-геномных вирусов. У иммунокомпетент-ных пациентов аденовирусная инфекция протекает относительно легко, однако представляет серьезную угрозу для людей с иммунодефицитом, приводя к тяжелым последствиям вплоть до летального исхода [17]. Официально рекомендованные препараты для лечения аденовирусной инфекции в настоящее время отсутствуют [5]. Ряд аналогов нуклеотидов проявлял активность in vitro в отношении аденовируса [12, 13]. Данные о противовирусной активности широко распространенного препарата Рибавирина противоречивы и свидетельствуют о его активности [7, 29], слабой активности [14] или отсутствии антиадено-вирусной активности [8, 22]. Ганцикловир проявлял эффективность как in vitro, так и in vivo [9, 30]. Цидо-фовир, разработанный на основе ^)-1-(3-гидрокси-2-фосфонилметоксипропил) цитозина, характеризовался высоким уровнем противовирусной активности [16, 18-20, 26-28]. Все три нуклеотидных аналога были использованы для терапии аденовирусных патологий человека, включая гепатиты, циститы и пневмонии при иммунодефицитных состояниях у реципиентов органов [7-9, 29]. Серьезные побочные эффекты и появление устойчивых штаммов аденовируса ограничивают их использование [10, 16, 26]. Контактная информация: Зарубаев Владимир Викторович, канд. биол. наук, зав. лаб.; e-mail:zarubaev@influenza.spb.ru Рост вируса в клеточной культуре может быть ингибирован катехинами зеленого чая [31], хотя и в высоких концентрациях. Другие классы соединений -имидазохинолинамины [25], липиды [21], акридоны [32], другие аналоги нуклеозидов [6, 12, 13, 23, 24, 33] - также обладают антиаденовирусной активностью. В отношении препаратов интерферона следует сказать, что аденовирусы обладают эффективными механизмами подавления интерферониндуцированного ответа [34], поэтому устойчивы к действию интерферона и его индукторов и не могут считаться основным средством терапии при тяжелых случаях инфекции. Ранее нами была продемонстрирована ингибирующая активность имидазолилэтанамида пентандиовой кислоты (препарат Ингавирин®) против аденовируса человека в опытах на культуре клеток [2] и модели генерализованной аденовирусной инфекции у сирийских хомяков [4]. Целью настоящего исследования было изучение влияния Ингавирина® на ультраструк-турные особенности морфогенеза аденовирусной инфекции в печени лабораторных животных при помощи электронной микроскопии для более детальной характеристики его протекторной активности. Материалы и методы Препараты. В работе применяли препарат Ингавирин® производства ОАО «Валента Фарм», Россия. Аликвоты препарата разводили в среде Игла МЕМ для клеточных культур («БиолоТ», Санкт-Петербург, кат. # 1.3.3). Из полученного раствора были приготовлены необходимые разведения на среде МЕМ для экспериментов на животных. Вирусы. Был использован аденовирус человека типа 5. Вирус пассировали в клетках Hep-2 при 36°С в атмосфере 5% CO2. Животные. С целью воспроизведения аденовирусной инфекции у лабораторных животных использовали новорожденных сирийских хомяков, у которых этот вирус, по ранее полученным нами данным [33], вызывал диссеминированную вирусную инфекцию, протекающую с поражением печени, легких и сердца. Новорожденных хомяков получали от половозрелых родителей и использовали в опытах через 12-24 ч после рождения. Подбор животных в группы опыта проводили методом случайной выборки. Экспериментальная аденовирусная инфекция. Вирус вводили животным подкожно в объеме 0,1 мл и дозе 105 ТЦИД50. В каждую группу наблюдения брали по 4-6 хомяков. Препарат вводили подкожно в объеме 0,1 мл через 12, 36 и 60 ч после инфицирования. Суточная доза Ингавирина® составила 30 мг на 1 кг массы животного. В качестве плацебо животным контрольной группы вводили физиологический фосфатный буфер. В качестве отрицательного контроля использовали интактных животных, которые содержались в тех же условиях, что и опытные группы. Через 72 ч после заражения животных из каждой группы умерщвляли, вскрывали и изолировали печень. Участки поражения печени размером 1 х 1 мм вырезали, измельчали лезвием в капле холодного 2,5% глутарового альдегида на какодилатном буфере и хранили при 4°С. Рис. 1. Гепатоциты и купферовская клетка печени интактного животного. Органеллы выражены четко, вакуолизация клеток отсутствует. Ув. 5000. Электронно-микроскопические исследования. Ку-сочки ткани фиксировали 2,5% раствором OsO4, обезвоживали ацетоном в возрастающей концентрации и заливали в смесь эпон/аралдит. Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме Ultracut (“Reichert”, Австрия), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали на электронном микроскопе JEM-100S (“JEOL”, Япония) при инструментальном увеличении 2000-20 000. Фотосъемку производили на пленку ФТ-41МД. На полученных фотографиях проводили подсчет вирионов, имеющих электронно-плотную сердцевину, не имеющих ее или имеющих не полностью. Подсчитывали количество внутриклеточных вирионов в поле зрения, а также процентное содержание полноценных и неполноценных вирионов в каждом случае. В каждой группе опыта подсчитывали 15-20 полей зрения, охватывающих 6-8 инфицированных клеток. Статистическая обработка данных. Статистическую обработку результатов (расчет средних значений и ошибок среднего, а также 50% эффективных доз при помощи линейной регрессии) проводили при помощи программы Microsoft Excel. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента. Достоверными считали различия между группами, если параметр p не превышал 0,05. Результаты При электронно-микроскопическом исследовании печени контрольных и инфицированных животных было установлено, что у интактных животных гепатоциты имели неправильно-гексагональную форму. В составе гепатоцитов идентифицировали синусоидальный и билиарный полюса, обращенные к кровеносному синусоиду и желчному канальцу соответственно. Цитоплазматическая мембрана имела многочисленные выросты мембраны - микроворсинки, особенно отчетливо выраженные на синусоидальном полюсе ге-патоцита. Гиалоплазма гепато-цитов имела низкую электронную плотность, в ее составе различались гранулы, фибриллы и пузырьки. Цитоплазматические органеллы - митохондрии, комплекс Гольджи, гладкий и шероховатый эндоплазматиче-ский ретикулум (ЭПР) - идентифицировались четко и имели интактную структуру. Ядро располагалось в центральной части гепатоцита, было округлым и имело хорошо заметную ядерную оболочку, немногочисленные мелкие глыбки хроматина содержали от 1 до 4 округлых ядрышек (рис. 1). При инфицировании животных аденовирусом морфология печени существенно изменялась. В первую очередь это касалось появления обширных участков вакуолизации гепатоцитов, обусловленного расширением и очаговым лизисом ЭПР (рис. 2, а). В цитоплазме отдельных гепатоцитов наблюдались мегааутофагосомы. Рис. 2. Неспецифическая деструкция печени новорожденных сирийских хомяков на 3-и сутки после инфицирования аденовирусом человека типа 5. Вакуолизация цитоплазмы гепатоцита и деструкция органелл (а); разрушающийся гепатоцит в окружении морфологически интактных клеток (б); расширение синусоидного капилляра и многочисленные клетки воспалительного инфильтрата в пространстве Диссе (в). Ув. 4000 (а), 2000 (б, в). На определенных стадиях деградации гепатоцитов выявлялись изолированные ядра, когда цитоплазма клеток разрушалась и ее остатки обнаруживались в просветах синусоидов. В некоторых ядрах отмечены признаки апоптоза в виде пикноза и конденсации хроматина. Митохондрии часто были вакуолизированы или фрагментированы, кристы - разрушены. Контакты между гепатоцитами были представлены расширенными щелями, просвет которых был заполнен детритом, лизосомами и остатками клеточных органелл (рис. 2, б). Синусоидные капилляры были сильно расширены и часто заполнены остатками разрушающихся гепатоцитов. Вследствие нарушения барьерной функции эндотелиальных клеток в пространстве Диссе выявлялись многочисленные клетки лимфоидно-моноцитарного ряда (рис. 2, в). Об активации лимфоцитов и макрофагов можно было судить по наличию у них значительного числа микроворсинок. По-видимому, дилатация синусоидных капилляров, происходящая при вирусной инфекции, играет компенсаторную роль, улучшая кровоснабжение ткани печени и обеспечивая приток иммунокомпетент-ных клеток в очаг вирусного поражения. Помимо неспецифических признаков деструкции печеночной паренхимы обнаруживали также гепато-циты, содержащие в ядре типичные структурированные вирусные включения в поздних стадиях развития, белковые паракристаллы и многочисленные вирионы аденовируса в ядре и цитоплазме (рис. 3). Рис. 3. Репликация аденовируса в гепатоцитах новорожденных сирийских хомяков на 3-и сутки после инфицирования. Вакуолизация цитоплазмы гепатоцита и ядро с типичными вирусными включениями (а); многочисленные вирионы аденовируса в составе включений (б); паракристаллическое белковое включение в ядре гепатоцита (в). Ув. 3000 (а), 10000 (б), 15000 (в). Применение Ингавирина® при экспериментальной аденовирусной инфекции приводило к выраженной нормализации структуры печени. Так, гепатоциты инфицированных животных, получавших Ингавирин®, не проявляли признаки распада, вакуолизации цитоплазмы, деструкции органелл или перераспределения хроматина в ядре (рис. 4, а). Апоптотические клетки практически отсутствовали. Просветы капиллярных синусов и пространства Диссе были сходны по размерам с таковыми у интактных животных, при этом в составе клеток крови, заполняющих синусы, практически отсутствовали лимфоциты и другие клетки, характерные для очагов воспаления (рис. 4, б). Клеточные органеллы выглядели интактными, признаки вакуолизации митохондрий, деструкции или дезорганизации крист, расширения цистерн аппарата Голь-джи или ЭПР не обнаружены. Клетки, имеющие специфические признаки вирусной репликации - включения в ядре или вирионы и белковые паракристаллы в ядре и цитоплазме, отмечались гораздо реже, чем в печени контрольных животных. В то же время различия в ультраструктурных особенностях морфогенеза аденовирусной инфекции между животными, получавшими Ингавирин®, и контрольными животными, отсутствовали. Структура включений, локализация и количество вирионов в пересчете на инфицированную клетку в этих группах животных были сходными (рис. 5). Основным различием была большая доля пустых капсидов в гепатоцитах животных, прошедших лечение Ингавирином®, по сравнению с животными контрольной группы (см. таблицу). В отношении этой тенденции полученные результаты согласуются с ранее полученными данными о способности Ингавирина® нарушать процессы упаковки вирусного генома и сборки вирионов аденовируса. Рис. 4. Структура печени новорожденных сирийских хомяков, инфицированных аденовирусом человека типа 5, в условиях применения Ингавирина®. Интактные гепатоциты, умеренное количество детрита в просвете синусного капилляра (а); просвет синусоидного капилляра с эритроцитами при отсутствии клеток иммунной системы (б). Ув. 3000. Для количественной оценки действия Ингавирина® на морфогенез аденовирусной инфекции в гепатоцитах был проведен подсчет морфологически полноценных и неполноценных вирусных частиц (см. таблицу). Как видно из представленных результатов, через 3 сут после инфицирования животных среди вирусного потомства присутствовали как морфологически полноценные вирионы, так и вирионы, не содержащие сердцевину. Использование Ингавирина® приводило к повышению количества морфологически неполноценных вирионов с 18 до 33 в поле зрения, что отражалось в снижении доли морфологически полноценных частиц с 65 до 52%. Аденовирусная инфекция человека может быть смоделирована на животных в виде респираторной патологии только в форме пневмонии у хлопковых крыс [15]. Однако такая модель не получила широкого распространения из-за трудностей обращения с этими животными. В связи с этим исследования, посвященные поиску и разработке противовирусных соединений, ведутся на моделях, затрагивающих не органы дыхания, а печень [33] или органы зрения [11, 15]. В своем исследовании мы использовали ранее разработанную модель аденовирусной генерализованной инфекции новорожденных сирийских хомяков, наиболее наглядно проявляющейся в форме вирусного гепатита. На этой модели было показано, что использование препарата приводит к существенному снижению интенсивности деструктивных процессов и воспалительных реакций в печени, нормализуя ее структуру на уровне организации как ткани в целом, так и отдельных гепатоцитов. Показано также, что применение Ингавирина® вызывает некоторое повышение доли незрелых вирусных частиц среди вирионов потомства. В ранее проведенных исследованиях [4] была продемонстрирована способность Ингавирина® ограничивать размеры очагов аденовирусного гепатита у хомяков и приблизительно Получавшие Инга-вирин® Контроль без препаратов Морфологический состав популяции аденовируса человека типа 5, сформировавшейся в условиях применения Ингавирина® в гепатоцитах новорожденных сирийских хомяков Количество вирусных частиц в поле зрения Группа опыта с сердцевиной без сердцевины абс. % абс. % 37,5 ± 4,8 (р = 0,542) 51,8 ± 3,6 (р = 0,001) 32,7 ± 3,6 (р = 0,001) 45,5 ± 3,1 (р = 0,012) 32,8 ± 3,2 64,8 ± 1,2 17,8 ± 1,6 35,2 ± 1,2 трехкратно уменьшать число клеток с признаками вирусной репликации в пределах таких очагов. Таким образом, полученные в настоящем исследовании данные согласуются с ранее полученными. Несмотря на различия гистологической организации тканей печени и легких и патологических процессов, происходящих при пневмонии и аденовирусном гепатите, представленные данные в целом согласуются с результатами изучения активности Ингавирина® на моделях у животных с вирусной респираторной патологией -гриппозной, РС-вирусной и парагриппозной пневмонией у мышей и хомяков [1, 3]. Рис. 5. Репликация аденовируса в гепатоцитах новорожденных сирийских хомяков на 3-и сутки после инфицирования в условиях применения Ингавирина®. Во всех случаях действие Ингавирина® заключалось в значительном угнетении цитопатических, в том числе цитодеструктивных, процессов, а также в снижении уровня воспалительной реакции, включая клеточную инфильтрацию ткани, что в результате приводило к нормализации структуры пораженного органа. В печени животных, получавших Ингавирин®, клетки с признаками репликации аденовируса встречались реже, чем в контрольных группах, однако структура самих вирусных включений практически не отличалась. Можно предполагать, что, помимо нарушения процесса упаковки вирусного генома в капсиды, Ингавирин® в значительной степени препятствует инфицированию гепатоцитов аденовирусом. Слабовыраженная вакуолизация цитоплазмы, развитые ядерные включения и вирионы в ядре клетки. Ув. 8000. Полученные результаты позволяют рассматривать Ингавирин® как эффективный препарат, оказывающий противовирусное, противовоспалительное и ци-топротекторное действие в очаге аденовирусного поражения ткани.

References

Supplementary files