The blocking effects of small interfering RNAs on RS-1 gene functions of herpes simplex virus type 2: new perspectives for targeted antiviral exposure

Full Text

Вирусы простого герпеса человека ВПГ-1 и ВПГ-2 убиквитарны с преобладанием бессимптомных форм носительства. Будучи иммунодефицитными патогенами вирусы герпеса обусловливают прогрессирующее снижение иммунного тонуса организма, что предрасполагает к системной диссеминации и поражению тканей и органов макроорганизма. Пан-тропные возможности герпесвирусов, их способность легко преодолевать гематоэнцефалический барьер предопределяют развитие системных заболеваний ЦНС, суставов, системы кровообращения, респираторного тракта, желудочно-кишечной и мочеполовой систем. Поражаются зрительный, слуховоспринимающий аппарат, нейрогуморальная, гормональная и цитокиновая сферы организма [1, 2]. В России обязательная регистрация герпеса половых органов (ГПО) введена лишь в 1993 г. Заболеваемость в стране превышает 16,3, а в Москве - 74,8 на 100 тыс. населения; количество больных с клиническими проявлениями ГПО составляет приблизительно 0,5-1%, а в США и Европе - до 6-10% взрослого населения, причем в США ежегодно регистрируют до 6-10 млн случаев генитального герпеса. Вышесказанное определяет как острую социальную значимость проблемы, так и необходимость продолжения поиска средств для более эффективного блокирования герпетической инфекции (ГИ) человека. При блистательных возможностях современной противовирусной химиотерапии (системное воздействие, селективное блокирование вирусспецифических процессов, способность преодолевать гематоэнцефали-ческий барьер, относительно слабый токсический эффект) есть и серьезные минусы: постепенное и неуклонное формирование лекарственной устойчивости, подчас носящее перекрестный характер, некоторые побочные эффекты при долговременной терапии вносят ряд ограничений в прогнозирование результата. Настоящее исследование посвящено изучению блокирующих герпесвирусную репродукцию возможностей малых интерферирующих РНК (миРНК/small interfering RNA) в качестве основы для нового тар-гетного противовирусного соединения. Уникальность данного метода - возможность подбора и синтеза миРНК, способных на основе достаточно высокой гомологии [7] геномов ВПГ-1 и ВПГ-2 комплементарно взаимодействовать с мРНК обоих вирусов. Целью работы было исследование эффективности использования РНК-интерференции для подавления ГИ на модели ВПГ-2 in vitro. В плане перспективности применения миРНК в качестве нового противовирусного средства решались такие задачи, как подавление вирусной репликации в ранних стадиях инфекции и защита клеток от цитопатического действия (ЦПД) вируса. Проводилась также оценка цитотоксичности вновь синтезированных миРНК на культуре клеток. Материалы и методы Клетки. В работе использовали перевиваемую клеточную линию почек зеленой мартышки Vero, любезно предоставленную лабораторией культур тканей ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского. Клетки культивировали в концентрации 250-500 тыс/ мл в среде Игла-DMEM (производство ФГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10% ЭТС (НПО «ПанЭко», Москва) в атмосфере, содержащей 5% CO2 и 98% влажности при 37°C. Вирус. Использовали вирус простого герпеса человека 2-го типа (ВПГ-2) штамм «ВН», инфекционный титр которого составил 5 lg ТЦД/мл. Малые интерферирующие РНК (миРНК). Поскольку в клинике и патогенезе вирусы герпеса 1-го и 2-го типа тесно связаны друг с другом, мы впервые подобрали такие миРНК, которые могли быть использованы сразу для обоих вирусов. В ходе сравнительного анализа консервативных участков всех генов ВПГ-1 и ВПГ-2 были выявлены 2 гена, которые содержали идентичные (100%) участки, удобные для взаимодействия с миРНК. Таким образом, были отобраны следующие гены: UL32 (соответствует гену UL30 ДНК-полимеразы ВПГ-1) и RS1 (ген, отвечающий за активацию транскрипции ДНК ВПГ-2, является аналогом функции гена ICP4 ВПГ-1). Синтезированные миРНК для каждой мишени представляют собой 2 нити длиной в 21 пару оснований в виде смысловой и анти-смысловой нитей. Перед проведением трансфекции из нитей получали дуплексы, которые обеспечивают устойчивость миРНК для внутриклеточных нуклеаз. Трансфекция. Трансфекцию миРНК проводили с помощью липофектамина с использованием набора для трансфекции (RNAiMAX, “Invitrogen”) интерферирующих РНК, предназначенного для клеточных линий, живущих в монослое. Клетки Vero были рассеяны на 48-луночные плато в количестве 1,2 • 105 за сутки до трансфекции таким образом, чтобы на следующий день после трансфекции достигнуть 50% монослоя. За сутки перед трансфекцией клетки перевели на среду ИГЛА (НПО «ПанЭко», Москва) с пониженным содержанием сыворотки (1%), без антибиотиков. Лунки с клетками были разделены на контрольные, без миРНК, без вируса (контроль клеток); контрольные, с вирусом, без миРНК (контроль вируса); контрольные с миРНК, без вируса и клетки с миРНК (контроль препарата), предварительно инфицированные вирусом. В работе использовали серийные 10-кратные разведения вируса (10-1, 100-2 и т. д.). Множественность инфицирования составила 10 и 100 ТЦД50/лунка. За 1 ч до трансфекции миРНК клетки были инфицированы ВПГ-2. После адсорбции вируса на клетках (через 1 т ч инкубации) из лунок удаляли супернатант, вносили смеси миРНК с липофектамином в режиме прямой трансфекции согласно протоколу набора (RNAiMAX, “Invitrogen”) и помещали в термостат при 5% CO2 и 37°C. Смеси миРНК с липофектамином готовили в соответствии с инструкцией набора. Конечная концентрация миРНК в лунках составляла от 8 до 50 нМ. Инкубацию клеток с миРНК проводили в течение 5 сут до полного лизиса клеток. Результаты и обсуждение Использование миРНК в современной медицине приобретает значительные масштабы благодаря простоте их синтеза и производства. Эти соединения удобны для химических модификаций и могут быть адаптированы к различным видам носителей (белковых, полиэтиленгликоля, липосом и др.) для терапевтической доставки в клетки [3, 4]. Кроме того, последовательности миРНК могут быть внедрены в состав экспрессирующих векторов с целью длительного поддержания их концентрации в клетках [5]. Основной особенностью и преимуществом интерферирующих РНК с точки зрения таргетной противовирусной терапии является целенаправленное использование миРНК для подавления экспрессии нужных вирусных белков. Сходство вирусных геномов ВПГ-1 и ВПГ-2 [7] позволило подобрать миРНК для наиболее консервативных участков в области двух генов. В результате сравнительного анализа последовательностей геномов ВПГ-1/2 были выбраны гены RS1 и UL32. 1 сут 2 сут 5 сут RS1, КК, КП UL32 —я— КВ 100 * 90 I 80 ш 5 70 60 50 40 30 20 10 5 i KB UL32 RS1 Щ 24 ч 48 ч Рис. 2. Снижение инфекционности ВПГ-2 при воздействии миРНК к генам RS1 и UL32. Анализ ЦПД интактных клеток Vero, обработанных дозами вируса 10 ТЦД50/лунка с последующим добавлением миРНК, проводили в течение 48 ч. КВ - контроль вируса, клетки, обработанные суспензией из КВ (10 ТЦД50/лунка) - лунок первого этапа. Объяснение в тексте. Основой выбора также послужило принятие в расчет значимости функций данных генов в репликации вирусов. Особенностью экспрессии генов ВПГ является очередность активации ранних и поздних генов. Ген RS1 обладает регуляторными функциями в отношении экспрессии ранних генов ВПГ-2 и служит ключевым фактором транскрипции. Ген UL32 соответствует по положению гену UL30 ВПГ-1, который кодирует большую субъединицу вирусной ДНК-полимеразы. На первом этапе исследования оценивали цитотоксичность миРНК на клетках Vero, при этом токсичность для клеток при использовании различных концентраций (4-50 нМ) миРНК не обнаружена. Далее проводили исследования для оценки защитных свойств миРНК на жизнеспособность клеток Vero после инфицирования их ВПГ-2. Для этого предварительно инфицированные клетки (10 и 100 ТЦД50/лун-ка) были обработаны суспензией, содержащей 8 нМ миРНК-дуплексов (см. в разделе «Материалы и методы» киРНК) к генам RS1 и UL32 в составе липосом-ных частиц, липофектамина RNAiMAX (“Invitrogen”). Для достижения воспроизводимости результатов каждая экспериментальная лунка имела троекратный повтор. Инкубацию клеток осуществляли в течение 5 сут до достижения полного лизиса клеток вирусом в контрольных лунках. В результате эксперимента выявлена 100% защита от цитопатического действия вируса клеток Vero, которые трансфицировали миРНК к гену RS1. Защита клеток при использовании миРНК-UL32 в среде с дозой вируса 10 ТЦД50/лунка (рис. 1, а) оказалась менее выраженной. В случае использования дозировки ВПГ-2 100 ТЦД50/лунка защитные свойства миРНК RS1 и UL32 практически совпадают (см. рис. 1, б). Эти результаты свидетельствуют о более значимой роли гена RS1 для репликации ВПГ-2. На следующем этапе оценивали инфекционность вируса после воздействия миРНК (определение инфекционного титра вируса). С этой целью отбирали вируссодержащую суспензию из всех лунок первого этапа с дозой 10 ТЦД50/лунка и инфицировали монослой клеток в 48-луночных плато для титрования вируса по классической методике. Титр ВПГ-2 определяли по ЦПД на клетках в логарифмических значениях тканевой цитопатической дозы (ТЦД50/мл) на каждые сутки (рис. 2). Было обнаружено, что нокдаун экспрессии RS1 по сравнению с UL32 оказывает выраженное ингибирующее действие на титр ВПГ-2. Так, в первые 24 ч при действии миРНК-UL32 наблюдается снижение инфекционного титра вируса в 10 раз (титр составил 1 lg ТЦД50/мл) и полное ингибирование вирусной активности при использовании миРНК-RS!, в то время как в контроле титр вируса составил 2 lg ТЦД/мл. Через 48 ч титр вируса в присутствии миРНК-RS1 оставался на прежнем уровне (0 lg ТЦД50/мл) по сравнению с увеличенным до 2 lg ТЦД50/мл титром при миРНК-UL32. Титр ВПГ-2 в контроле вируса составил 5 lg ТЦД50/мл. Таким образом, показано, что выбранная последовательность гена RS1 является наиболее оптимальной мишенью для РНК-интерференции при любых использованных дозировках. Полученные нами результаты в определенной степени согласуются с опубликованными данными китайских ученых [6], которые свидетельствуют об успешном использовании миРНК, гомологичных гену ICP4, при работе с ВПГ-1. Однако миРНК к генам RS1 и UL32 на модели ВПГ-2 ранее не использовали. Кроме самостоятельного использования, миРНК может быть внедрена в терапию ВПГ-2 в комбинации с уже существующими препаратами химиотерапии. Так, при работе с раковыми клетками в результате ранее проведенных исследований у нас [8], а также за рубежом [9] было показано, что использование миРНК увеличивает чувствительность раковых клеток к гораздо меньшим концентрациям химиопрепарата. При этом наблюдается усиление терапевтического эффекта и может на порядок снижаться токсичность препарата. Таким образом, наши результаты свидетельствуют о перспективной возможности применения миРНК для подавления инфекции ВПГ-1/2. Дальнейшие исследования будут направлены на индивидуальное применение миРНК, а также на совместное использование ее с известными противовирусными средствами.

References

Supplementary files