Генетическое разнообразие белка Vif у вариантов вируса иммунодефицита человека 1-го типа (Retroviridae: Orthoretrovirinae: Lentivirus: Human immunodeficiency virus-1), циркулировавших в Московской области в 2019‒2020 гг.

Полный текст

Введение

Белок Vif вируса иммунодефицита человека 1-го типа (Retroviridae: Orthoretrovirinae: Lentivirus: Human immunodeficiency virus-1, HIV-1, ВИЧ-1) является фактором вирусной инфекционности, который специфически противодействует клеточным дезаминазам семейства APOBEC3, или A3 [1, 2]. Члены семейства APOBEC3 являются эффекторами врожденного иммунитета, противодействующими многим экзогенным вирусам, включая ВИЧ-1. При этом геном человека кодирует 7 генов A3 (A3A, B, C, D, F, G и H) [2]. A3G (APOBEC3G) является наиболее сильным ингибитором репликации ВИЧ-1 в отсутствие белка Vif [2, 3]. Благодаря своей цитидиндезаминазной активности, A3G преобразует цитидин (C) в уридин (U) в одноцепочечной некодирующей вирусной ДНК, образующейся в процессе обратной транскрипции вирусной РНК. На этапе синтеза второй, кодирующей, цепи провирусной ДНК происходит замена гуанина (G) на аденин (A), что в конечном итоге приводит к нарушению синтеза белка и прерыванию репликации ВИЧ-1 [2, 4]. Другие белки семейства APOBEC3: A3D, A3F и A3H, проявляют разную степень противовирусной активности [5, 6]. При этом белки семейства А3 могут проявлять противовирусную активность также дезаминазно-независимым способом на разных стадиях цикла репликации вируса (обратная транскрипция, интеграция, созревание) [2, 7, 8]. Vif нейтрализует белки семейства A3 через присоединение этих белков к E3-убиквитин-лигазному комплексу, включающему белки Cullin 5, Elongin C, Elongin B и CBF-β, для поли-убиквитинилирования с последующей протеасомной деградацией. Кроме того, Vif способен ингибировать транскрипцию A3G через захват транскрипционного кофактора (CBF-β), блокировать трансляцию A3G, ингибировать включение A3G во вновь образованные вирусные частицы [2].

Белок Vif является высоко основным полипептидом, состоящим из 192 аминокислот, массой около 23 кДа, синтезирующимся на поздней стадии репликации вируса [9, 10]. На протяжении многих лет с момента открытия белка Vif (1986 г.) изучаются его свойства и особенности взаимодействия с белками клетки-хозяина, однако полностью его роль так и не определена [2, 9–11]. На рис. 1 обозначены описанные функциональные мотивы белка Vif.

 

Рис. 1. Схематическое изображение функциональных мотивов в белке Vif.

¹¹WQVDRMR¹⁷, ⁷⁴TGERxWH⁸⁰ и ¹⁷¹EDRW¹⁷⁴ – сайты, картирующиеся с A3F; K²², K²⁶, Y³⁰, ⁴⁰YRHHYE⁴⁵, S⁵², W⁷⁰ и ¹⁶¹PPLP¹⁶⁴ – с A3G; F³⁹, H⁴⁸ и ⁶⁰GDAK⁶³ – с A3H; ⁶⁹YxxL⁷² – с A3G и A3F; ⁹⁰RKKR⁹³ – сигнал, ингибирующий ядерную локализацию; 108Hx5Cx17−18Cx3−5H139(HCCH мотив) – с Cullin 5, входит в состав E3-убиквитин-лигазного комплекса; ¹⁴⁴SLQYLA¹⁴⁹ – с Elongin C, входит в состав E3-убиквитин-лигазного комплекса; ⁵WQVMIVW¹¹, W⁸⁹, T⁹⁶, L¹⁰⁶ – с CBF-β [2, 9–11].

Fig. 1. Schematic representation of functional motifs in the Vif protein.

¹¹WQVDRMR¹⁷, ⁷⁴TGERxWH⁸⁰ and ¹⁷¹EDRW¹⁷⁴ – sites mapping to A3F; K²², K²⁶, Y³⁰, ⁴⁰YRHHYE⁴⁵, S⁵², W⁷⁰ and ¹⁶¹PPLP¹⁶⁴ – to A3G; F³⁹, H⁴⁸ and ⁶⁰GDAK⁶³ – to A3H; ⁶⁹YxxL⁷² – to A3G и A3F; ⁹⁰RKKR⁹³ – a signal inhibiting nuclear localisation; ¹⁰⁸Hx5Cx17−18Cx3−5H¹³⁹ (HCCH motif) – to Cullin 5, is part of the E3 ubiquitin ligase complex; ¹⁴⁴SLQYLA¹⁴⁹ – to Elongin C, is a member of the E3-ubiquitin ligase complex; ⁵WQVMIVW¹¹, W⁸⁹, T⁹⁶, L¹⁰⁶ – to CBF-β [2, 9–11].

 

В более ранних исследованиях показано, что натуральные вариации в белке Vif могут вызывать дефекты A3G- и A3F-нейтрализующей активности [12]. Последующие работы продемонстрировали, что между разными вариантами ВИЧ-1 присутствуют различия в функциональной активности белка Vif [13, 14]. Например, в области генома ВИЧ-1, кодирующего ген vif, суб-субтипа A6, широко распространенного на территории Российской Федерации, были обнаружены 12 нуклеотидных замен, 4 из которых являлись несинонимичными и приводили к заменам аминокислот K91Q, E134N, Q136P и I159E, по сравнению с ВИЧ-1 HXB2 [15]. При этом в другом исследовании была обнаружена ассоциация изменений Vif с ускоренным переходом заболевания в стадию СПИДа, мутация Q136P являлась одним из таких изменений наряду со вставкой одной аминокислоты в 61-м положении и заменами A62D/N/S [16].

В процессе исследований генетического разнообразия белка Vif были определены пары аминокислот и единичные замены, которые могут быть ассоциированы как со сниженным уровнем CD4-клеток, так и с высокой вирусной нагрузкой (ВН) [17, 18]. Таким образом, естественные вариации в белке Vif могут влиять на функциональность белка и течение заболевания.

Более того, в настоящее время разрабатываются молекулы, являющиеся антагонистами белка Vif, которые в дальнейшем могут стать основой для создания антиретровирусных препаратов нового класса [19–21]. В дизайн многих разрабатываемых мультиэпитопных вакцинных конструкций входят антигены, содержащиеся в белке Vif [22]. Таким образом, белок Vif является привлекательной мишенью для разработки терапевтических препаратов и вакцин, что делает исследование его генетического разнообразия еще более актуальным. Высокое генетическое разнообразие ВИЧ-1 и неравномерное распределение существующих вариантов вируса в мире определяют актуальность изучения особенностей белка Vif у локально циркулирующих вариантов вируса [14, 18, 23–25].

В России состав циркулирующих генетических вариантов ВИЧ-1 уникален: доминирующим вариантом является суб-субтип А6 (82,9%), на втором месте – субтип В (7,14%), затем быстро распространяющаяся рекомбинантная форма CRF63_02A6 (3,59%), и около 1% приходится на каждую из рекомбинантных форм CRF02_AG и CRF03_AB [26]. В ранее проведенных нами исследованиях были изучены особенности регуляторных белков Tat, Rev и вспомогательного белка Vpu ВИЧ-1 среди вирусов, принадлежащих суб-субтипу A6, который является наиболее широко распространенным генетическим вариантом на территории Российской Федерации; в процессе исследований проводили сравнение генетической вариабельности данных белков среди пациентов с разными стадиями заболевания [27–30]. При сравнении консенсусных последовательностей белка Vif у вариантов вируса суб-субтипа А6, циркулирующих в разных регионах России, были отмечены характерные особенности, которые могут быть связаны с так называемым «эффектом основателя» [31].

Цель исследования – изучение генетического разнообразия белка Vif вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Московской области: определение генетических вариантов, сравнение консенсусных последовательностей наиболее распространенных из них; анализ консервативности и генетического разнообразия белка Vif-А6 (белок Vif вариантов ВИЧ-1 суб-субтипа А6) у пациентов с разными стадиями заболевания, оценка генетического разнобразия белка Vif-А6 в Московской области.

Материалы и методы

В работе были использованы клинические образцы цельной крови, полученные от 234 наивных (без опыта приема антиретровирусной терапии (АРТ) в анамнезе) ВИЧ-инфицированных пациентов, проходивших лечение в ГКУЗ МО «Центр профилактики и борьбы со СПИД» (далее – Центр СПИД). Процедуру забора крови осуществляли сотрудники Центра СПИД. Забор крови производили единоразово в период с августа 2019 г. по июль 2020 г. в рамках реализации проекта CARE (https://www.careresearch.eu/, доступ на 29 июня 2024 г.). Весь полученный клинический материал использовали с информированного согласия пациентов на основании одобрения Комитета по биомедицинской этике ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (протокол № 16 от 08.02.2019). Выявление факторов риска инфицирования проводили путем опроса пациентов при сборе эпидемиологического анамнеза. Также регистрировали следующую дополнительную информацию: пол и возраст пациента, дату забора клинического образца, стадию заболевания, показатели ВН и иммунный статус пациента (количество CD4⁺-клеток).

Пациенты, включенные в исследование, находились на 2, 3 и 4-й стадиях заболевания (табл. 1). Таким образом, для дальнейшего анализа были сформированы 3 группы пациентов в зависимости от их стадии заболевания.

 

Таблица 1. Характеристика включенных в исследование ВИЧ-инфицированных пациентов, классифицированных по стадии ВИЧ-инфекции*

Table 1. Characteristics of HIV-infected patients included in the study, classified by stage of HIV infection*

Характеристики Characteristics	2-я стадия/стадия начальных проявлений Stage 2/stage of initial manifestations	3-я стадия/субклиническая стадия Stage 3/subclinical stage	4-я стадия/стадия вторичных проявлений Stage 4/stage of secondary manifestations
Всего пациентов, абс. Total patients, abs.	47	82	105
Пол, абс. | Gender, abs.
мужской | male	29	46	75
женский | female	18	36	30
Возраст, медиана лет (диапазон) Age, median years (range)	38 (19–62)	38 (21–70)	39 (24–64)
Путь инфицирования, абс. | infection route, abs.
гетеро | hetero	25	58	64
ПИН | IDU	5	11	36
МСМ | MSM	16	10	4
нозокомиальный nosocomial	0	0	1
неизвестно unknown	1	3	0
CD4, кл/мкл (диапазон) CD4, cells/μL (range)	642,96 (290–2022)	474,10 (110–1658)	236,78 (8–1062)
Вирусная нагрузка, lg РНК, копий/мл (диапазон) Viral load, log10 RNA, copies/mL (range)	4,9 (3,4–7,0)	4,6 (3,3–6,2)	5,1 (3,1–6,4)

Примечание. В скобках представлены диапазоны абсолютных значений. ПИН – потребители инъекционных наркотиков; МСМ – мужчины, имеющие секс с мужчинами.

Note. Ranges of absolute values are presented in brackets. IDU – injecting drug users; MSM – men having sex with other men

 

В табл. 1 показаны основные демографические и клинико-эпидемиологические характеристики пациентов, включенных в исследование, в зависимости от стадии ВИЧ-инфекции, согласно клиническим рекомендациям Минздрава России.

Экстракцию провирусной ДНК в составе геномной ДНК из клеток крови (лимфоцитов) осуществляли методом высаливания [32]. На следующем этапе проводили амплификацию гена vif с помощью «гнездовой (Nested)» двухраундовой полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием продуктов амплификации. Последовательности использованных в работе праймеров и условия амплификации:

• 1-й раунд: праймеры: Vif1р (GCAGGTAAGAGAGCAAGCTGAACA) и Vif1о (GTCTCCGCTTCTTCCTGCCATAGGA), программа: 1) 95 °C – 5 мин; 2) 35 циклов: 95 °C – 30 с, 57 °C – 1 мин, 72 °C – 1 мин 20 с; 3) 72 °C – 7 мин; 4) 4 °C – ∞ (хранение);
• 2-й раунд: праймеры; Vif2р (GCTaCTCTGGAAAGGTGAAGG) и Vif2о (TACAAGGAGTCTTGGGCTGAC), программа: 1) 95 °C – 5 мин; 2) 35 циклов: 95 °C – 30 с, 53 °C – 1 мин, 72 °C – 1 мин 20 с; 3) 72 °C – 7 мин; 4) 4 °C – ∞ (хранение).

Амплифицированный фрагмент содержал 948 нуклеотидных оснований и включал ген vif. Очистку продуктов амплификации проводили с использованием коммерческого набора для очистки ПЦР-фрагментов – Clean S-Cap («Евроген», Россия) в соответствии с протоколом фирмы-производителя.

Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли дидезокси-методом по Сэнгеру с использованием набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) и праймеров Vif2р и Vif2о согласно протоколу фирмы-производителя. Проведение оценки реакции секвенирования выполнялось автоматически в генетическом анализаторе ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

Сборку и редактирование полученных нуклеотидных последовательностей проводили с использованием приложения SeqMan II 6.1. (DNASTAR Inc., США). Попарное и множественное выравнивание было выполнено с помощью модуля ClustalW, интегрированного в программный пакет AliView [33]. В случае, если в полученных алайментах были выявлены проблемные участки, проводили их дополнительное выравнивание «вручную».

Предварительное определение генетических вариантов ВИЧ-1 осуществляли с применением специализированных программ: COMET HIV-1 (https://comet.lih.lu/) – использует контекстноориентированное моделирование для быстрого типирования вирусов ВИЧ-1 [34]; jpHMM – определяет рекомбинантные формы вируса, используя скрытую марковскую модель [35]; RIP 3.0 (https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/RIP/RIP) – служит для идентификации рекомбинантных форм вируса; размер окна при анализе составил 50 н.о., что позволило детектировать рекомбинацию в последовательностях короткой длины. Для уточнения полученных результатов был проведен филогенетический анализ. Его осуществляли методом максимального правдоподобия (Maximum Likelihood, ML) с использованием программы IQ-TREE [36]. Источником эталонных последовательностей служила база данных Лос-Аламосской лаборатории США (https://www.hiv.lanl). Модель замещения нуклеотидов определяли при помощи программы jModelTest v. 2.1.7 на основании информационного критерия Акаике (Akaike information criterion, AIC) [37]. Достоверность выведенных филогений оценивали с помощью бутстрэп-теста (bootstrap) и критерия приблизительного отношения правдоподобия Шимодайры–Хасегавы (SH-aLRT) с 1000 послестартовых итераций. Кластеры с поддержкой SH-aLRT > 0,9 считали достоверно установленными. Визуализацию и графическую обработку результатов филогенетического анализа осуществляли в программе iTOL [38].

Затем были отобраны наиболее распространенные генетические варианты ВИЧ-1, для каждого из них были сформированы консенсусные аминокислотные последовательности для их дальнейшего сравнения. Для этого первоначально полученные нуклеотидные последовательности ВИЧ-1 наиболее распространенных генетических вариантов были переведены в аминокислотные последовательности с помощью онлайн-инструмента для трансляции, представленного на сайте: https://www.bioinformatics.org/sms2/translate.html. После этого с помощью инструмента Simple Consensus Maker (https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/SimpCon.html) на основе полученных аминокислотных последовательностей для каждого анализируемого генетического варианта ВИЧ-1 была сформирована общая консенсусная аминокислотная последовательность. Далее полученные консенсусные последовательности сравнивали между собой и относительно референсного штамма HXB2 ВИЧ-1 (GenBank Accession No: K03455) с применением программы MEGA v. 10.2.2.

На следующем этапе исследования оценивали консервативность и генетическую вариабельность белка Vif ВИЧ-1 суб-субтипа А6 у пациентов с разными стадиями заболевания. Для этого полученные аминокислотные последовательности Vif-А6 были сгруппированы в соответствии со стадией ВИЧ-инфекции пациента (3 группы), от которого они были получены. Затем для каждой группы дополнительно формировали консенсусные последовательности, как описано ранее. Таким образом, с помощью инструмента Simple Consensus Maker (https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/SimpCon.html) на основе полученных аминокислотных последовательностей для каждой стадии заболевания (2, 3 и 4-я) была сформирована общая консенсусная аминокислотная последовательность, характерная для каждой стадии. Затем оценивали уровень консервативности аминокислот в каждой позиции в каждой группе, между группами и по отношению к общему консенсусу для вариантов суб-субтипа А6, полученных ранее для всей группы исследуемых последовательностей (см. абзац выше). Для каждой позиции аминокислоты проводилась оценка консервативности по следующей шкале: 100, 90–99, 76–89, 51–75, ≤ 50%. Далее с применением программного модуля Nonparametric Statistics из пакета Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США) оценивали статистически значимые различия в консервативности последовательностей белка Vif у пациентов с разными стадиями заболевания (точный двусторонний тест Фишера с коррекцией множественного теста Бонферрони, p < 0,0033).

Для оценки генетической вариабельности белка Vif ВИЧ-1 суб-субтипа А6 аминокислотные последовательности Vif-А6 также были поделены на группы в зависимости от стадии заболевания пациента (3 группы). Затем определяли аминокислотные замены (с применением программы MEGA v. 10.2.2) в каждой группе пациентов, используя в качестве референсной последовательности общую консенсусную аминокислотную последовательность, полученную для Vif ВИЧ-1 суб-субтипа A6. Сайты со статистически достоверными различиями в частоте встречаемости у пациентов с разными стадиями заболевания выявляли с с применением программного модуля Nonparametric Statistics из пакета Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США), допустимым считали уровень значимости при использовании критерия χ² с поправкой Бонферрони (p < 0,0005).

На завершающем этапе исследования в рамках изучения генетического разнообразия белка Vif суб-субтипа А6 в группе вариантов вируса, циркулирующих в Московской области, проводили их сравнение с референс-группой. Для формирования референсной группы из международной базы данных Лос-Аламос (www.hiv.lanl.gov, дата обращения 17 октября 2024 г.) были выгружены полногеномные нуклеотидные последовательности ВИЧ-1 суб-субтипа А6. Последовательности, полученные от одного и того же пациента, были исключены из анализа. Общее число последовательностей для дальнейшего анализа составило 166. Затем из загруженных полногеномных нуклеотидных последовательностей в программе MEGA v. 10.2.2 были вырезаны последовательности гена vif; полученные нуклеотидные последовательности гена vif переведены в аминокислотные, как описано ранее. Также на основе полученных аминокислотных последовательностей (исследуемых и загруженных) была сформирована общая консенсусная последовательность, которая использовалась в качестве референсной последовательности. Под генетическим разнообразием понимали частоту встречаемости аминокислоты, отличной от представленной в референсной последовательности, в каждой группе (последовательностей Vif-A6 из Московской области и последовательностей Vif-A6 из не Московской области). С помощью программного модуля Nonparametric Statistics из пакета Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США) были выявлены участки со статистически значимыми различиями (p < 0,0013 при использовании критерия χ² с поправкой Бонферрони).

Результаты

По результатам первичного анализа нуклеотидных последовательностей было установлено, что два образца (0,86%, 2/234), полученные от пациентов с 3-й стадией заболевания, 1311000563 и 1311001125, относились к уникальным рекомбинантам (URFs) ВИЧ-1 и были образованы фрагментами ВИЧ-1 генетических вариантов A6 и B. Данные последовательности были исключены из дальнейшего филогенетического анализа.

По результатам филогенетического анализа 6 (2,56%) нуклеотидных последовательностей (н.п.) были включены в кластер, образованный нуклеотидными последовательностями ВИЧ-1 субтипа G, 8 (3,42%) н.п. – циркулирующей рекомбинантной формы CRF63_02A6, 19 (8,12%) н.п. – субтипа B. Остальные 199 (85,04%) последовательностей образовали достоверный кластер с нуклеотидными последовательностями ВИЧ-1 суб-субтипа A6 (рис. 2).

 

Рис. 2. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена vif ВИЧ-1 (n = 257, модель замещения нуклеотидов – GTR + I + G4). Референсные последовательности выделены красным цветом, исследуемые – черным.

Fig. 2. Phylogenetic analysis of nucleotide sequences of the HIV-1 vif gene (n = 257, nucleotide substitution model – GTR + I + G4). Reference sequences are highlighted in red, study sequences are highlighted in black.

 

При этом нуклеотидные последовательности, относящиеся к генетическим вариантам B и G, были получены от пациентов со всеми стадиями заболевания, тогда как последовательности, определенные как CRF63_02A6, – для пациентов с 3-й и 4-й стадиями заболевания. Также было выявлено, что две (1311001061 и 1311001117) из 234 исследуемых аминокислотных последовательностей, полученных от пациентов со 2-й стадией заболевания, имели делецию в 131-м положении аминокислотной последовательности. При этом обе последовательности относились к ВИЧ-1 субтипа B. Одна последовательность (1311001065), также B-субтипа, полученная от пациента с 3-й стадией ВИЧ-инфекции, содержала инсерцию 62insG.

Все полученные в ходе настоящего исследовании нуклеотидные последовательности гена vif ВИЧ-1 (234) были депонированы в международную базу данных генотипов GenBank со следующими номерами: PQ572780–PQ573013.

Консенсусные последовательности белка Vif были сформированы для вариантов ВИЧ-1 суб-субтипа А6, субтипа В и рекомбинантной формы CRF63_02A6 как наиболее часто встречающихся на территории Российской Федерации [26]. Общая консенсусная аминокислотная последовательность Vif суб-субтипа А6 была сформирована на основе 199 исследуемых последовательностей: субтипа В – 19, а CRF63_02A6 – 8 соответственно. Все сформированные консенсусные последовательности состояли из 192 аминокислотных остатков и не содержали ни инсерций, ни делеций. При этом в 8 аминокислотных последовательностях суб-субтипа А6, полученных от пациентов с 3-й и 4-й стадией заболевания, были обнаружены стоп-кодоны в различных позициях: наиболее часто (37,5%) – в 70-й позиции и в 25% в каждой из позиций: 21, 38 и 192.

Дополнительно проведенная оценка силы связи между исследуемыми признаками (наличие стоп-кодонов и стадия ВИЧ-инфекции) с применением критерия ϕ и V Крамера показала несущественную силу взаимосвязи.

Затем было проведено сравнение полученных консенсусных последовательностей. Результаты сравнения консенсусных последовательностей Vif ВИЧ-1 разных генетических вариантов представлены на рис. 3.

 

Рис. 3. Консенсусные последовательности Vif ВИЧ-1 генетических вариантов, наиболее часто встречающихся на территории России (суб-субтипа А6, субтипа В и рекомбинантной формы CRF63) выравненные относительно референс-штамма HXB2.

Точками обозначены позиции аминокислотных остатков (АК), в которых АК в консенсусах соответствовали референсу. Аминокислоты классифицированы на основе полярности радикалов. Неполярные аминокислоты: G (глицин), A (аланин), V (валин), L (лейцин), I (изолейцин), P (пролин), отмечены синим цветом; полярные незаряженные аминокислоты: S (серин), T (треонин), C (цистеин), M (метионин), N (аспарагин), Q (глутамин) – зеленым; ароматические аминокислоты: F (фенилаланин), Y (тирозин), W (триптофан), H (гистидин) – желтым; отрицательно заряженные аминокислоты: D (аспарагиновая кислота) и E (глутаминовая кислота) – оранжевым; положительно заряженные аминокислоты: K (лизин), R (аргинин) – красным [39, 40].

Fig. 3. Consensus sequences of Vif HIV-1 genetic variants most frequently encountered in Russia. The dots indicate amino acid residues (a.a.r.) positions in which the a.a.r. in the consensus corresponded to the reference.

Non-polar amino acids: G (glycine), A (alanine), V (valine), L (leucine), I (isoleucine), P (proline) – are marked in blue; polar uncharged amino acids: S (serine), T (threonine), C (cysteine), M (methionine), N (asparagine), Q (glutamine) – green; aromatic amino acids: F (phenylalanine), Y (tyrosine), W (tryptophan), H (histidine) – yellow; polar acidic, negatively charged, amino acids: D (aspartic acid) and E (glutamic acid) – orange; polar basic, positively charged amino acids: K (lysine), R (arginine) – in red [39, 40].

 

При сравнении консенсусных последовательностей вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории Российской Федерации, были обнаружены различия у Vif ВИЧ-1 разных генетических вариантов, а также относительно референсной последовательности HXB2.

Принимая во внимание абсолютное доминирование ВИЧ-1 суб-субтипа А6 на территории России и в связи с тем, что репрезентативная выборка нуклеотидных последовательностей была получена только для суб-субтипа А6, в дальнейший анализ вошли только последовательности гена vif суб-субтипа А6 (всего 199 н.п., полученных от 199 пациентов с разной стадией заболевания): 35 н.п. – от пациентов со 2-й стадией (стадией начальных проявлений), 68 н.п. – с 3-й (субклинической стадией) и 96 – с 4-й (стадией вторичных проявлений) ВИЧ-инфекции.

При анализе консервативности белка Vif у пациентов с разными стадиями заболевания было выявлено, что консенсусные последовательности в каждой группе содержали преимущественно аминокислоты, аналогичные аминокислотам в общей консенсусной последовательности, однако с разной частотой выявления (рис. 4).

 

Рис. 4. Консервативность аминокислотных последовательностей белка Vif суб-субтипа А6 в группах пациентов с разными стадиями заболевания.

Аминокислоты в общем консенсусе обозначены однобуквенным кодом: А – аланин; С – цистеин; D – аспарагиновая кислота; Е – глутаминовая кислота; F – фенилаланин; G – глицин; H – гистидин; I – изолейцин; К – лизин; L – лейцин; М – метионин; Н – аспарагин; P – пролин; Q – глутамин; R – аргинин; S – серин; Т – треонин; V – валин; W – триптофан; Y – тирозин.

Fig. 4. Conservation of amino acid sequences of the Vif sub-subtype A6 protein in groups of patients with different stages of the disease.

Amino acids are designated by a general consensus with a one-letter code: A, alanine; C, cysteine; D, aspartic acid; E, glutamic acid; F, phenylalanine; G, glycine; H, histidine; I, isoleucine; K, lysine; L, leucine; M, methionine; N, asparagine; P, proline; Q, glutamine; R, arginine; S, serine; T, threonine; V, valine; W, tryptophan; Y, tyrosine.

 

Оценка распределения позиций с различной степенью консервативности в белке Vif в разных группах (по стадиям заболевания) пациентов не выявила статистически значимых различий (табл. 2).

 

Таблица 2. Распределение консервативности позиций в белке Vif в группах пациентов с разными стадиями ВИЧ-инфекции

Table 2. Distribution of conserved positions in the Vif protein in groups of patients with different stages of HIV infection

Консервативность (%) Conserved positions (%)	Число сайтов (n) | Number of sites (n)			p*
	1-я стадия stage 1	2-я стадия stage 2	3-я стадия stage 2	p2‒3	p3‒4	p2‒4
100	92	70	88	0,0299	0,0778	0,7591
90–99	49	75	60	0,0062	0,1344	0,2576
76–89	34	28	28	0,4883	1,0000	0,4883
51–75	15	5	12	0,0363	0,1345	0,6905
≤ 50	2	14	4	0,0036	0,0271	0,6850

Примечание. * – указано значение p для разницы в показателе между группами (точный двусторонний тест Фишера с коррекцией множественного теста Бонферрони, p = 0,0033).

Note. * – indicates p-value for difference between groups is indicated (Fisher’s exact two-tailed test with Bonferroni multiple test correction, p = 0,0033).

 

При оценке вариабельности Vif у пациентов с разными стадиями ВИЧ-инфекции выявлено 35 замен со статистически значимыми различиями (табл. 3). Однако с учетом множественного сравнения, реально статистически значимыми в данном случае различия становятся с учетом поправки Бонферрони, т.е. при уровне значимости p < 0,0005.

 

Таблица 3. Аминокислотные замены Vif-A6 со статистически значимыми различиями по частоте встречаемости в группах ВИЧ-инфицированных пациентов с разными стадиями заболевания

Table 3. Vif-A6 amino acid substitutions with statistically significant differences in frequency of occurrence in groups of HIV-infected patients with different stages of the disease

Позиция Position	Мутация Mutation	2-я стадия stage 2 n = 35	3-я стадия stage 3 n = 68	4-я стадия stage 4 n = 96	p*
					p2–3	p2–4	p3–4
24	L24I	2	0	3	0,047	–	–
29	M29I	8	10	9	–	0,042	–
31	V31I	7	28	21	0,032	–	0,008
31	V31H	2	0	0	0,047	0,018	–
33	K33G	2	0	1	0,047	–	–
35	A35V	2	0	0	0,047	0,018	–
41	R41I	2	1	0	–	0,018	–
48	H48E	0	8	4	0,035	–	–
50	K50R	23	31	43	–	0,034	–
51	V51I	4	2	11	–	–	0,047
60	G60R	3	0	3	0,014	–	–
60	G60E	2	0	4	0,047	–	–
61	D61E	3	18	12	0,033	–	0,023
61	D61G	2	0	0	0,047	0,018	–
63	R63M	2	0	2	0,047	–	–
65	V65I	6	14	5	–	0,029	0,002
77	K77R	2	16	10	0,024	–	0,024
122	K122Q	2	0	1	0,047	–	–
122	K122R	0	5	1	–	–	0,034
127	H127Q	17	20	22	–	0,004	–
130	S130R	2	11	3	–	–	0,003
131	P131H	1	3	0	–	–	0,038
132	R132S	1	11	7	0,046	–	–
136	P136S	6	18	13	–	–	0,037
137	A137E	2	7	1	–	–	0,007
141	K141Q	4	3	15	–	–	0,024
156	P156L	2	1	0	–	0,018	–
157	T157A	3	1	1	–	0,027	–
158	R158K	8	5	10	0,025	–	–
159	E159A	2	0	0	0,047	0,018	–
173	R173K	2	1	0	–	0,018	–
181	R181K	1	9	15	–	0,048	–
182	G182D	0	7	7	0,049	–	–
184	R184K	4	1	4	0,026	–	–
186	N186H	2	0	0	0,047	0,018	–

Примечание. Значения p-value представлены для всех позиций с p < 0,05; позиции с p ≥ 0,05 отмечены знаком «–». Достоверно значимыми считали различия с p с поправкой Бонферрони (p < 0,0005). * – указано значение p для разницы в показателе между группами. Жирным шрифтом отмечены замены в функционально значимых областях (рис. 1).

Note. The p-values are presented for items with p < 0.05; items with p ≥ 0.05 are marked with ‘–’. Differences with p-value with Bonferroni correction (p < 0.0005) were considered significantly significant. * – indicates p-value for difference between groups is indicated Substitutions in functionally significant areas are marked in bold (Figure 1).

 

Таким образом, с учетом поправки по Бонферрони, не было выявлено ни одного сайта со статистически значимыми различиями в частоте встречаемости у пациентов с разными стадиями заболевания.

Сравнение генетического разнообразия белка Vif ВИЧ-1 суб-субтипа А6 в группе вариантов вирусов, циркулирующих в Московской области, и в референсной группе выявило 39 аминокислотных замен, имеющих разницу в частоте встречаемости (p < 0,05) (табл. 4).

 

Таблица 4. Сравнение генетического разнообразия Vif-A6 ВИЧ-1 в группе вариантов вируса, циркулирующих в Московской области, и референсной группе

Table 4. Comparing genetic diversity of Vif-A6 HIV-1 between the group of virus variants circulating in the Moscow region and the reference group

Позиция Position	Мутация Mutation	Московская область Moscow region (n = 199)	Референсная группа Reference group (n = 166)	p
9	I9V	10	2	0,042
17	R17X	1	9	0,004
19	R19K	21	6	0,012
20	T20X	1	18	0,000009
27	H27Y	19	6	0,023
31	V31N	5	0	0,04
31	V31X	7	16	0,017
33	K33R	17	5	0,027
41	R41X	2	10	0,007
45	E45D	13	3	0,028
51	V51G	0	4	0,028
56	H56X	0	4	0,028
61	D61X	2	7	0,049
65	V65X	2	11	0,004
67	K67I	9	1	0,022
73	H73Q	17	36	0,0004
74	T74X	1	13	0,0003
77	K77R	28	12	0,037
78	D78A	8	1	0,036
93	R93K	21	5	0,005
93	R93M	0	5	0,014
93	R93X	0	11	0,0002
98	I98X	5	12	0,033
113	D113N	5	0	0,04
128	I128X	0	5	0,014
140	N140X	2	11	0,004
141	K141X	0	5	0,014
153	L153I	1	14	0,0001
155	T155X	2	9	0,014
157	T157A	5	0	0,04
158	R158K	23	8	0,021
158	R158X	1	7	0,016
160	R160X	0	5	0,014
167	R167X	2	10	0,007
176	K176X	0	4	0,028
181	R181X	2	9	0,014
185	G185X	0	6	0,007
188	T188S	6	0	0,024
192	C192R	8	1	0,036

Примечание. X – аминокислота не определена. Значения p представлены для позиций с p < 0,05. Достоверно значимыми считали различия p с поправкой Бонферрони (p < 0,0013) – выделены жирным шрифтом.

Note. X – amino acid is not defined. p-values are given for the positions with p < 0.05. In bold: significant in the χ² test with Bonferroni correction p < 0.0013.

 

С учетом поправки Бонферрони (p < 0,0013) частота встречаемости замен в 5 сайтах достоверно значимо различалась между группами.

Обсуждение

Применение современной антиретровирусной терапии для лечения ВИЧ-инфекции предотвращает клиническое прогрессирование заболевания, однако не приводит к устранению вирусных резервуаров, т.е. не позволяет элиминировать вирус, что определяет необходимость пожизненного приема антиретровирусных препаратов. Постоянный прием антиретровирусных препаратов, в свою очередь, со временем может приводить к появлению побочных эффектов лечения, формированию лекарственной устойчивости вируса и возникновению проблемы межлекарственных взаимодействий. В связи с этим в мире на постоянной основе ведется работа по созданию новых антиретровирусных препаратов, а также немалые усилия прикладывают к созданию средств полного излечения от ВИЧ-инфекции. В рамках этой работы конструируются также антогонисты белка Vif разного принципа действия: ингибиторы мультимеризации белка Vif, ингибиторы прямого связывания Vif с A3G, ингибиторы связывания Vif с Elongin C и ингибиторы связывания Vif с CBF-β [19, 41]. Кроме того, на основе белка Vif разрабатываются основы для создания терапевтических вакцин и генной терапии ВИЧ-инфекции. Так, эксперименты, проведенные in vitro, продемонстрировали, что мультиэпитопная конструкция, содержащая неструктурный белок Vif, имела высокую эффективность проникновения в клетки [42]. Разрабатываются лентивирусные векторы для генной терапии ВИЧ-инфекции, кодирующие A3G, устойчивые к действию белка Vif [43]. В настоящем исследовании впервые изучались особенности белка Vif у вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России.

Результаты распределения генетических вариантов ВИЧ-1 в настоящем исследовании и в ранее проведенном масштабном исследовании генетического разнообразия ВИЧ-1 на территории Российской Федерации хорошо коррелируют между собой: суб-субтип А6 – 85,04%, субтип В – 8,12%, CRF63_02A6 – 3,42% и суб-субтип А6 – 82.9%, субтип В – 7,14%, CRF63_02A6 – 3,59% соответственно. Однако в настоящем исследовании 2,56% последовательностей были генотипированы как субтип G, тогда как, по результатам более масштабного исследования, на долю субтипа G приходилось менее 1% от проанализированных образцов [26]. Такое несовпадение может быть объяснено тем, что часть последовательностей, которые в настоящем исследовании по гену vif были определены как субтип G, на самом деле могут являться циркулирующими рекомбинантными формами или уникальными рекомбинантами. Например, некоторые варианты ВИЧ-1, первоначально генотипированные по гену pol как субтип G, затем методом полногеномного секвенирования были определены как рекомбинантная форма BG [44].

По результатам проведенного исследования было установлено, что две последовательности, полученные от пациентов со 2-й стадией ВИЧ-инфекции, содержали делеции; одна последовательность, полученная от пациента с 3-й стадией ВИЧ-инфекции, содержала инсерцию (62insG). В 8 последовательностях, полученных от пациентов с 3-й (3 последовательности) и 4-й стадией (5 последовательностей) заболевания, были обнаружены стоп-кодоны в разных позициях. Чаще всего (в 37,5% аминокислотных последовательностей, содержащих стоп-кодоны) стоп-кодоны находились в 70-й позиции. В 25% последовательностей встречались стоп-кодоны в каждой из следующих позиций: 21, 38 и 192. Учитывая высокую частоту встречаемости стоп-кодонов в определенных позициях, можно сделать предположение о неслучайном механизме данного явления, которое связано с действием клеточного белка A3G [2, 4].

Сила связи наличия стоп-кодонов и стадии заболевания была несущественной. При этом в ряде исследований отмечается, что на фоне течения ВИЧ-инфекции количество дефектного провируса увеличивается, а его доля может составлять порядка 90% всего резурвуара ВИЧ [45, 46].

Однако существующие ограничения исследования, такие как относительно небольшой объем выборки и отсутствие наличия сиквенсов от одного и того же пациента в динамике, а также индивидуальные особенности течения болезни у каждого конкретного человека не дают нам возможности говорить о каких-либо тенденциях относительно стоп-кодонов в последовательностях Vif. Для белков Rev и Tat неоднократно отмечалась возможность наличия преждевременных стоп-кодонов с сохранением функциональной активности белков, тогда как для белка Vif к настоящему моменту таких данных нет, поэтому оценить функциональную значимость каждой позиции стоп-кодона так же пока не представляется возможным [47, 48].

При сравнении консенсусов циркулирующих в России вариантов ВИЧ-1 было обнаружено, что консенсусная последовательность белка Vif суб-субтипа А6 отличалась от референсной последовательности HXB2 в 30 позициях, субтипа B – в 16 позициях, рекомбинантной формы CRF63_02A6 – в 32 позициях. Наибольшее количество замен, 2 и более, консенсусы белка Vif циркулирующих в России вариантов ВИЧ-1 относительно HXB2 содержали в позициях: 47, 128, 134, 151, 159 и 167. При этом между собой консенсусы белка Vif циркулирующих в России вариантов ВИЧ-1 также отличались: от консенсуса суб-субтипа А6 консенсус субтипа В отличался в 28 из 192 позиций (на 14,6%), а консенсус рекомбинантной формы CRF63_02A6 – в 25 из 192 позиций (на 13%). Кроме того, следует отметить, что циркулирующая рекомбинантная форма CRF63_02A6 представляет собой вторичный рекомбинант, образованный ВИЧ-1 суб-субтипа А6 и CRF02_A6G, а ген vif является областью рекомбинации с включением фрагментов обоих вариантов вируса (https://www.hiv.lanl.gov/components/sequence/HIV/crfdb/crfs.comp).

Важно отметить, что консенсусы вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России, в 7 функционально значимых позициях отличались от референс-штамма HXB2 и содержали следующие замены: K22N, F39V, R63K, T74K, R77K, K91Q, K92E (рис. 1). Замены аргинина (R) на лизин (K) в 63-й и 77-й позиции не приводят к изменению типа аминокислоты в анализируемой позиции, т.е. аминокислота остается положительно заряженной, тогда как замены K22N, F39V, T74K, K91Q, K92E приводят к изменению типа аминокислоты (рис. 1), что может повлиять на изменение функциональных свойства белка. Так, ранее было показано, что наличие положительного заряда в функционально значимом мотиве, в который входит K22, важен для связывания и инактивации A3G [49]. Таким образом, замена лизина (K) ‒ положительно заряженной аминокислоты в 22-м положении, на аспарагин (N) ‒ полярную незаряженную аминокислоту, может привести к снижению положительного заряда, что, в свою очередь, может повлиять на связывание и инактивацию A3G.

Оценка распределения консервативности позиций в белке Vif не выявила достоверной разницы между группами пациентов с разными стадиями заболевания (табл. 3), что согласуется с результатами аналогичных исследований для белка Vpu [29].

По результатам исследования вариабельности Vif у пациентов с разными стадиями ВИЧ-инфекции не было выявлено замен со статистически значимыми различиями в частоте встречаемости (табл. 3), что отличает результаты этого исследования от результатов изучения других неструктурных белков – Tat и Vpu [28, 29]. Анализ замен в области функционально значимых областей белка Vif (табл. 3) у пациентов с разными стадиями заболевания не позволяет также выявить какую-либо тенденцию в частоте их встречаемости. В ранее проведенном исследовании генетического разнообразия белка Vif ВИЧ-1 субтипа В было показано, что у пациентов, инфицированных вариантами вируса, содержащими замену K22H, отмечалась тенденция к более низкому уровню CD4-клеток и более высокой ВН [18]. В настоящем исследовании разницы в частоте встречаемости (p < 0,05) замены K22H у пациентов с разными стадиями заболевания обнаружено не было.

Характерных замен, достоверно чаще встречающихся у вариантов ВИЧ-1 суб-субтипа А6, циркулирующих в Московской области, обнаружено не было, при этом частота встречаемости замен в 5 сайтах (T20X, H73Q, T74X, R93X, L153I) в референсной группе была достоверно выше (табл. 4). Аналогичное исследование генетического разнообразия белка Vif субтипа С в Уганде, Южной Африке и Индии позволило выявить специфичные аминокислотные замены, характерные для исследуемых географических регионов [50]. Полученные нами результаты могут быть связаны с особенностью исследуемого региона. Так, Московский столичный регион (включающий в себя Москву и Московскую область) представляет собой крупнейший транспортный узел в России, что обуславливает пересечение крупных миграционных потоков, в свою очередь приводящих к постоянной циркуляции и смене вариантов ВИЧ-1 суб-субтипа А6 из различных регионов нашей страны, а также стран бывшего Советского Союза. Все это может препятствовать формированию каких-либо выраженных особенностей циркулирующих вариантов ВИЧ-1 суб-субтипа А6 на территории Московской области [51].

Заключение

В проведенном исследовании был впервые проведен комплексный анализ особенностей белка Vif вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России, в Московской области. Состав генетических вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Московской области, определенный по гену vif, преимущественно коррелировал с составом генетических вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории Российской Федерации в целом. При проведении исследования впервые получены и представлены консенсусные последовательности белка Vif ВИЧ-1 генетических вариантов B и CRF63_02A6, циркулирующих в России. Определены аминокислотные замены в функционально значимых позициях белка Vif, характерные для вариантов ВИЧ-1, наиболее распространенных в России; данные замены потенциально могут оказать влияние на изменение свойств белка и в будущем могут быть учтены при разработке терапевтических препаратов на основе белка Vif. Сравнение консервативности и генетической вариабельности белка Vif-А6 у пациентов с разными стадиями ВИЧ-инфекции не выявило достоверно значимых различий. При этом были определены позиции, содержащие делеции, инсерции и стоп-кодоны в области генома ВИЧ-1, кодирующей белок Vif. В целом генетическое разнообразие белка Vif-A6 ВИЧ-1 вариантов вируса, циркулирующих в Московской области, было меньше, чем в общей популяции вариантов ВИЧ-1 суб-субтипа А6. Проведенное исследование имеет ограничение, связанное с небольшой выборкой последовательностей Vif ВИЧ-1 генетических варинтов – В и CRF63_02A6.

Об авторах

Анастасия Александровна Антонова

Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: anastaseika95@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9180-9846

канд. биол. наук, научный сотрудник лаборатории вирусов лейкозов

Россия, 123098, г. Москва

Лариса Анатольевна Протасова

Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: larisa.protasova.03@mail.ru
ORCID iD: 0009-0001-0430-1578

лаборант-исследователь лаборатории вирусов лейкозов

Россия, 123098, г. Москва

Кристина Вячеславовна Ким

Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: kimsya99@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4150-2280

младший научных сотрудник лаборатории вирусов лейкозов

Россия, 123098, г. Москва

Яна Михайловна Мунчак

Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: yana_munchak@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4792-8928

младший научный сотрудник лаборатории вирусов лейкозов

Россия, 123098, г. Москва

Екатерина Никитична Меженская

Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: belokopytova.01@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3110-0843

канд. биол. наук, научный сотрудник лаборатории вирусов лейкозов 

Россия, 123098, г. Москва

Елена Александровна Орлова-Морозова

ГБУЗ Московской области «Центр профилактики и борьбы со СПИД»

Email: orlovamorozova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2495-6501

канд. мед. наук, заведующая амбулаторно-поликлиническим отделением

Россия, 140053, Московская область, г. Котельники

Александр Юрьевич Пронин

ГБУЗ Московской области «Центр профилактики и борьбы со СПИД»

Email: alexanderp909@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9268-4929

канд. мед. наук, главный врач

Россия, 140053, Московская область, г. Котельники

Алексей Геннадьевич Прилипов

Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: a_prilipov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8755-1419

д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник, заведующий лабораторией молекулярной генетики 

Россия, 123098, г. Москва

Анна Игоревна Кузнецова

Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: a-myznikova@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-5299-3081

заведующая лаборатории вирусов лейкозов, канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник

Россия, 123098, г. Москва

Список литературы

Дополнительные файлы