Необычные ВА222-подобные штаммы Rotavirus A (Sedoreoviridae: Rotavirus: Rotavirus A): молекулярно-генетический анализ на основе всех сегментов генома

Полный текст

Введение

В настоящее время большинство кишечных инфекций установленной этиологии вызывают вирусные патогены. Спектр кишечных вирусов весьма разнообразен, но ведущее место по заболеваемости среди детей занимает ротавирус А (РВА, Rotavirus А, род Rotavirus, семейство Sedoreoviridae, порядок Reovirales, класс Resentoviricetes, тип Duplornaviricota). Ежегодно на долю ротавирусной инфекции (РВИ) во всем мире приходится около 228 000 смертельных случаев, в том числе примерно 128 500 среди детей в возрасте до 5 лет [1, 2]. Наибольшее бремя РВИ приходится на детей, живущих в странах с низким и средним уровнем дохода, особенно из-за неблагоприятных условий жизни, ограниченного снабжения чистой питьевой водой и плохих санитарных условий [3]. В России, несмотря на ежегодно увеличивающееся число вакцинированных против РВИ детей, охват вакцинацией целевой когорты остается крайне низким, для того чтобы оказать влияние на эпидемический процесс (2020 г. – 3,68%; 2021 г. – 6,23%; 2022 г. – 7,15%; 2023 г. – 12,7%) [4, 5].

Отличительной чертой ротавирусов (РВ) является сегментированный геном, состоящий из 11 сегментов двухнитевой РНК в сумме длиной около 18 555 нуклеотидов, кодирующих 6 структурных (VP1‒VP4, VP6‒VP7) и 6 неструктурных (NSP1‒NSP6) белков [6‒8]. РВ характеризуются широким антигенным и генетическим разнообразием. Наиболее полно охарактеризованы гены VP4 и VP7, на основе которых с использованием бинарной классификации определяют G- и P-генотипы [9]. На сегодняшний день для РВА известно 42 G-генотипа и 58 P-генотипов [10]. Наиболее распространенными в мире, в том числе в России, считаются 6 комбинаций G[P]-типов РВА: G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8], G9P[8] и G12P[8], на долю которых приходится примерно 90% случаев заражения РВИ [11, 12]. Число менее распространенных G[P]-вариантов значительно больше, но они составляют всего 4,9% случаев инфекции. Например, к ним относятся такие генотипы, как G9P[4], G9P[9], G8P[8], G2P[8], G4P[4], G3P[9] и др. [13‒16].

Бинарная система классификации фокусируется только на сегментах генов VP4 и VP7 и не дает информации о разнообразии других генов. Поэтому для более глубокого изучения эпидемиологии и эволюции РВ была предложена система полногеномной классификация, позволяющая отнести каждый сегмент генома вируса к определенному генотипу. Для описания полного генотипа используют обозначение Gx-P[x]-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx для генов, кодирующих белки VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5/NSP6 соответственно [17]. Определение полного генотипа облегчает выявление редких и необычных РВА и обеспечивает более глубокое понимание происхождения и разнообразия штаммов, что, в свою очередь, важно для успешного прогнозирования эпидемической ситуации и оценки влияния вакцинопрофилактики на популяцию возбудителя.

Основываясь на полногеномном типировании, среди РВА выделяют 3 геногруппы. Во всем мире часто встречающиеся комбинации G1, G3, G4, G9, G12 и P[8] обычно ассоциируются с Wa-подобной (1-й) геногруппой (G1/G3/G4/G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1), имеющей отдаленное родство с РВ свиней [18, 19]. Такие РВ характеризуются «длинным» профилем миграции сегментов генома в полиакриламидном геле (ПААГ). Штаммы генотипа G2P[4], в свою очередь, относятся к DS-1-подобной (2-й) геногруппе (G2-P[4]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2), эволюционно связанной с РВ крупного рогатого скота [17, 19]. Они имеют «короткий» профиль миграции геномных сегментов. Существует 3-я, минорная, AU-1-подобная геногруппа (G3P[9]-I3-R3-C3-M3-A3-N3-T3-E3-H3), которая включает штаммы, подобные РВ кошек и собак, характеризующиеся «широким» профилем миграции сегментов [20, 21]. Штаммы с чистым AU-1-подобным сочетанием редко встречаются у людей, в то время как более распространены варианты со смешанным набором AU-1-подобных и DS-1-подобных генов. Их принято объединять в отдельную группу, прототипным для которой является штамм РВА ВА222 (G3-P[9]-I2-R2-C2-M2-A3-N1-T3-E2-H3), выделенный от домашнего кота в Италии в 2005 г. [22, 23].

Наличие сегментированного генома обусловливает способность РВ к обмену сегментами (реассортации) при одновременном инфицировании клетки двумя или более штаммами, что позволяет генам с разной специфичностью группироваться независимо друг от друга, тем самым поддерживая разнообразие в популяции. В мире все чаще отмечают распространение эпидемически значимых реассортантных штаммов РВА, которые несут генетический материал нескольких геногрупп [9, 24, 25].

В связи с этим, целью настоящей работы явились поиск необычных РВ на территории Нижнего Новгорода и их молекулярно-генетическая характеристика на основе всех сегментов генома.

Материалы и методы

В работе использовали образцы стула детей, госпитализированных в детский инфекционный стационар Нижнего Новгорода с симптомами острой кишечной инфекции (ОКИ) в период 2021‒2023 гг.

Экстракцию нуклеиновых кислот и постановку полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) выполняли с помощью наборов реагентов РИБО-преп и РЕВЕРТА-L (Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора (ЦНИИЭ), Россия). Обнаружение ротавирусной РНК проводили с помощью ПЦР-тест-систем с детекцией результата в реальном времени «АмплиСенс Rotavirus/Norovirus/Astrovirus FL» и «АмплиСенс ОКИ виро-скрин-FL» (ЦНИИЭ). Дополнительно РНК вирусов исследовали методом электрофореза в полиакриламидном геле (РНК-ПААГ) [26].

G[Р]-генотип РВ определяли методом мультиплексной ПЦР на основе праймеров, специфичных в отношении генотипов G1‒G4, G6, G8, G9, G12, P[4], P[6], P[8], P[9] [26‒32]. Детекцию результатов осуществляли с помощью электрофореза в агарозном геле, содержащем бромид этидия.

Для каждого гена был получен один фрагмент комплементарной ДНК (кДНК) длиной от 570 до 850 пар нуклеотидов с помощью праймеров, опубликованных ранее [32]. Фрагменты кДНК секвенировали по двум цепям с помощью прямого и обратного праймеров на приборе «Нанофор 05» (Институт аналитического приборостроения (ИАП) РАН, Россия) с применением набора для секвенирования BigDye Terminator v3.1 (Thermo Fisher Scientific, США). Нуклеотидные последовательности доступны в базе данных GenBank под номерами PP475712‒PP475777.

Поиск родственных последовательностей выполняли с использованием онлайн-сервиса BLAST. Для проведения филогенетического анализа из GenBank были взяты нуклеотидные последовательности 11 генов РВ, циркулировавших в разных странах, в том числе в России (Новосибирск, Омск, Москва), а также последовательности РВ из Нижнего Новгорода, полученные ранее. Регистрационные номера GenBank этих штаммов приведены в названиях изолятов на филогенетических деревьях. Выравнивание и анализ нуклеотидных последовательностей проводили в программе MEGA X версия 10.0.5. Филогенетические деревья строили методом максимального правдоподобия (Maximum Likelihood) [33, 34]. Bootstrap-анализ осуществляли на основе 1000 случайных выборок. Проценты сходства нуклеотидных последовательностей были рассчитаны методом попарных дистанций (Pairwise Distances). Принадлежность изучаемых штаммов к филогенетическим линиям и сублиниям определяли на основе кластеризации изолятов на филогенетических деревьях с индексом поддержки узлов более 75 и высокого уровня сходства нуклеотидных последовательностей (98,5‒100,0% для разных генов). Филогенетические линии и сублинии обозначали согласно принятой в литературе классификации [32, 35‒40].

Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов.

Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом ФБУН «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор) (Протокол № 6 от 24.03.2021).

Результаты

Характеристика спектра G[P]-генотипов РВА в Нижнем Новгороде

На наличие ротавирусной РНК было исследовано 3715 образцов стула детей, госпитализированных в инфекционный стационар с симптомами острого гастроэнтерита в период 2021‒2023 гг. В 1085 случаях (29,2%) была обнаружена РНК РВ, которую в дальнейшем использовали для G/[P]-генотипирования методом ОТ-ПЦР и/или секвенирования. В 792 образцах (72,9%) был определен G[P]-генотип РВ. В 192 образцах (17,7%) был частично установлен G- либо P-генотип. Результаты генотипирования, проведенного по двум генам (VP4 и VP7), показали, что РВА, циркулирующие на территории Нижнего Новгорода, характеризовались высоким разнообразием. Спектр идентифицированных методом ПЦР G-генотипов РВ включал 4 широко распространенных в мире (G1, G2, G3 и G9), и 2 редких для России (G6 и G8). Набор Р-генотипов включал 4 типа, среди которых были часто встречающиеся P[4], P[8] и редкие P[6] и P[9]. Всего было обнаружено 11 G/P-комбинаций: широко распространенные G3P[8], G9P[8], G2P[4], G1P[8], а также редкие G8P[8], G3P[9], G9P[4], G3P[6], G2P[8], G6P[9] и G3P[4] (рис. 1).

 

Рис. 1. Распределение штаммов РВА основных G[P]-генотипов в Нижнем Новгороде в сезон 2021‒2023 гг. (в %).

Fig. 1. Distribution of RVA strains of the main G[P]-genotypes in Nizhny Novgorod in the season 2021‒2023 (in %).

 

Доминирующую позицию в изучаемый период занимали штаммы генотипа G3P[8] (59,5%), за ним следовали штаммы генотипа G9P[8] (10,8%). Для остальных генотипов был показан низкий долевой вклад: G9P[4] – 2,1%, G1P[8] – 1,3%, G2P[4] – 1,6%, G3P[4] – 1,3%, G8P[8] – 1,1%, G3P[6] – 0,8%, G3P[9] – 1,0%, G2P[8] – 0,8%, G6P[9] – 0,1%.

Выявление реассортантных ротавирусов и установление их полных генотипов

В ходе изучения РВА-содержащих образцов методом РНК-ПААГ были выявлены 6 штаммов (2 штамма генотипа G2P[4] и 4 – G3P[9]), которые имели так называемые «широкие» (AU-1-подобные) профили миграции геномных сегментов в ПААГ (медленно мигрирующий 5-й сегмент, быстро мигрирующие 6-й и 11-й сегменты) (рис. 2).

 

Рис. 2. Профили миграции сегментов днРНК типичных представителей DS-1-/Wa-подобных ротавирусов и исследуемых штаммов генотипов G2P[4] и G3P[9] в ПААГ. * − необычное положение сегмента относительно типичных представителей DS- и Wa-подобных геногрупп.

Fig. 2. Migration profiles of dsRNA segments of typical representatives of DS-1-/Wa-like rotaviruses and studied strains of genotypes G2P[4] and G3P[9] in PAGE. * − an unusual position of the segment relative to typical representatives of DS- and Wa-like gene groups.

 

Штаммы были секвенированы по 11 генам (VP1‒VP4, VP6, VP7, NSP1‒NSP5/6), что позволило определить их полные генотипы: G2-P[4]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T3-E2-H3, G2-P[4]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T3-E3-H2 и G3-P[9]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T3-E3-H3. Исследуемые штаммы имели смешанный набор генов двух разных геногрупп – DS-1-подобной (генотипы под номером 2) и AU-1-подобной (генотипы под номером 3), что свидетельствует об их реассортантном происхождении.

Филогенетический анализ ротавирусов на основе всех сегментов генома

Для изучения филогенетических взаимоотношений 6 выявленных РВ генотипов G2P[4] и G3P[9] были использованы нуклеотидные последовательности 11 генов. Филогенетический анализ позволил изучить внутригенотиповое разнообразие исследуемых штаммов на уровне линий и сублиний. Адаптированные деревья показаны на рис. 3, 4.

 

Рис. 3. Филогенетические деревья, построенные на основе нуклеотидных последовательностей структурных генов (VP1–VP4, VP6, VP7) штаммов ротавируса А. ■ − штаммы, полученные в данной работе; □ − нижегородские штаммы, взятые из GenBank.

Fig. 3. Phylogenetic trees based on nucleotide sequences structural genes (VP1–VP4, VP6, VP7) of rotavirus strains A. ■ − strains obtained in this work; □ − Nizhny Novgorod strains retrieved from GenBank.

 

Рис. 4. Филогенетические деревья, построенные на основе нуклеотидных последовательностей неструктурных генов (NSP1–NSP5/6) штаммов ротавируса А. ■ − штаммы, полученные в данной работе; □ − нижегородские штаммы, взятые из GenBank.

Fig. 4. Phylogenetic trees based on nucleotide sequences: nonstructural genes (NSP1–NSP5/6) of rotavirus strains A. ■ − strains obtained in this work; □ − Nizhny Novgorod strains retrieved from GenBank.

 

По каждому гену исследуемые штаммы входили в состав 1 или 2 кластеров. Наибольшее разнообразие показали гены VP4, VP7, NSP4 и NSP5/6 (таблица).

 

Таблица. Геномные констелляции ротавирусов Нижнего Новгорода на уровне субгенотипов

Table. Subgenotype-level genomic constellations of rotaviruses from Nizhny Novgorod

№

Штаммы/ Strains

Сегменты генома / Genome segments

VP7

VP4

VP6

VP1

VP2

VP3

NSP1

NSP2

NSP3

NSP4

NSP5/6

Штаммы, подобные РВ кошек / Feline-like strains

1

ВА222

G3-3-e

P[9]

I2-XIV

R2-XIII

C2-IX

M2-XI

A3

N1

T3

E2-XVII

H3

2

NN1061/16

G6-I

P[9]

I2-XIV

R2-XIII

C2-IX

M2-XI

A3

N2-XVI

T3

E2-XVII

H3

3

NN148/17

G3-3-e

P[9]

I2-XIV

R2-XIII

C2-IX

M2-XI

A3

N2-XVI

T3

E3

H3

4

NN2748/18

G3-3-e

P[9]

I2-XIV

R2-XIII

C2-IX

M2-XI

A3

N2-XVI

T3

E3

H3

Типичные Ds-1-подобные штаммы / Typical DS-1-like strains

5

NN96/18

G2-IVa-3

P[4]-IV-b

I2-V-1

R2-V-1

C2-IVa-1

M2-VII

A2-IVa-1

N2-V-1

T2-V-1

E2-VI

H2-IVa-1

6

NN425/18

G2-IVa-3

P[4]-IV-b

I2-V-1

R2-V-1

C2-IVa-1

M2-VII

A2-IVa-1

N2-V-1

T2-V-1

E2-VI

H2-IVa-1

7

NN437/18

G2-IVa-1

P[4]-IV-b

I2-V-1

R2-V-1

C2-IVa-1

M2-VII

A2-IVa-1

N2-V-1

T2-V-1

E2-VI

H2-IVa-1

8

NN560/18

G2-IVa-2

P[4]-IV-a

I2-V-2

R2-V-2

C2-IVa-2

M2-V

A2-IVa-2

N2-V-2

T2-V-2

E2-VII

H2-IVa-2

Штаммы, полученные в данной работе / Strains obtained in this work

9

2853/21

G3-3-e

P[9]

I2-XIV

R2-XIII

C2-IX

M2-XI

A3

N2-XVI

T3

E3

H3

10

2885/21

G3-3-e

P[9]

I2-XIV

R2-XIII

C2-IX

M2-XI

A3

N2-XVI

T3

E3

H3

11

347/22

G3-3-e

P[9]

I2-XIV

R2-XIII

C2-IX

M2-XI

A3

N2-XVI

T3

E3

H3

12

2619/22

G3-3-e

P[9]

I2-XIV

R2-XIII

C2-IX

M2-XI

A3

N2-XVI

T3

E3

H3

13

1473/21

G2-IVa-3

P[4]-IV

I2-XIV

R2-XIII

C2-IX

M2-XI

A3

N2-XVI

T3

E2-XVII

H3

14

2924/21

G2-IVa-3

P[4]-IV

I2-XIV

R2-XIII

C2-IX

M2-XI

A3

N2-XVI

T3

E3

H2-IVa

Примечание. Исследуемые штаммы выделены жирным шрифтом. Красным цветом отмечены DS-1-подобные аллели, голубым – аллели РВ кошек, зеленым – Wa-подобные аллели.

Note. The studied strains are highlighted in bold. DS-1-like alleles are marked in red, alleles of RV cats are blue, and Wa-like alleles are green.

 

Штаммы, подобные кошачьему ротавирусу ВА222

Выявленные в данной работе 4 штамма генотипа G3P[9] относились к группе РВ, подобных штамму ВА222, выделенному от кошки. Эти штаммы (2853/21, 2885/21, 347/22 и 2619/21) были сходны по 9 генам (VP1‒VP4,VP6, VP7, NSP1, NSP3, NSP5/6) с прототипным штаммом РВА ВА222, но отличались от него генами NSP2 и NSP4, которые обладали другими генотипами. Наибольший уровень сходства нуклеотидных последовательностей был установлен для генов VP2, VP3, VP7, NSP1, NSP3, NSP5/6 и составил 98,7‒100,0%. Для генов VP1, VP4 и VP6 показан более низкий уровень гомологии ‒ 96,3‒98,1%.

Также исследуемые штаммы были родственны нижегородским ВА222-подобным РВ генотипов G3P[9] (NN148/17, NN2748/18) и G6P[9] (NN1061-16), выявленным ранее, в 2016‒2018 гг. С изолятами генотипа G3P[9] (NN148/17 и NN2748/18) исследуемые штаммы имели высокий уровень гомологии нуклеотидных последовательностей по всем 11 генам (99,1‒100,0%). Со штаммом генотипа G6P[9] (NN1061/16) было показано наиболее близкое родство по 8 генам (VP1‒VP4, NSP1‒NSP3, NSP5/6) с уровнем идентичности нуклеотидных последовательностей 98,7‒100,0%. Для гена VP6 установлен более низкий уровень сходства (96,0%). Гены VP7 и NSP4 имели другой генотип.

Нетипичные штаммы генотипа G2P[4]

Выявленные в настоящей работе два штамма РВА генотипа G2P[4] (1473/21 и 2924/21) имели смешанный набор генов. Они несли ВА222-подобную основу, в то время как гены VP4, VP7 и в одном случае ген NSP5/6 были получены в результате реассортации от типичных представителей DS-1-подобной геногруппы.

Наиболее близкородственными по дивергентным генам (VP4, VP7 и в одном случае NSP5/6) явились штаммы генотипа G2P[4] из Нижнего Новгорода, выявленные ранее в 2018 г. (NN560/18, NN96/18 и NN425/18). Уровень сходства нуклеотидных последовательностей при этом был довольно высок и составил 98,7‒99,9%.

По остальным генам (VP1‒VP3, VP6, NSP1‒NSP5/6) исследуемые штаммы имели близкое родство с ВА222-подобной группой РВ. Непосредственно с прототипным ВА222 образцы 1473/21 и 2924/21 были наиболее родственны по 3 генам: VP2, NSP3, NSP4 и VP2, VP3, NSP3 соответственно. Сходство нуклеотидных последовательностей в случае этих генов достигало 98,6‒99,8%, в то время как для остальных генов было ниже ‒ 95,2‒97,6%.

Также была установлена родственная связь исследуемых штаммов генотипа G2P[4] с нижегородскими РВ генотипов G3P[9] и G6P[9] (NN1061/16, NN148/17, NN2748/18), выявленными ранее, по всем ВА222-подобным генам. Так, исследуемый штамм 1473/21 разделял наибольшее количество генов (8 из 11) со штаммом NN148/17 (G3P[9]) (VP1‒VP3, VP6, NSP1‒NSP3, NSP5/6), демонстрируя при этом высокую идентичность нуклеотидных последовательностей ‒ 99,1‒99,9%. Со штаммом NN1061/16 (G6P[9]) он разделял 7 генов (VP1‒VP3, NSP2‒NSP5/6) с уровнем сходства нуклеотидных последовательностей 98,6‒99,8%. Пять генов были родственны таковым у штамма NN2748/18 (G3P[9]) (VP1, VP2, VP6, NSP2, NSP3). Гомология их нуклеотидных последовательностей составила 98,7‒99,7%.

Аналогично, штамм 2924/21 имел тесное филогенетическое родство со штаммом NN148/17 (G3P[9]) по 8 генам (VP1‒VP3, VP6, NSP1‒NSP4), демонстрируя высокую идентичность нуклеотидных последовательностей ‒ 98,8‒99,8%. Со штаммом NN2748/18 (G3P[9]) он разделял 6 генов (VP1‒VP3, VP6, NSP2, NSP3) с уровнем гомологии 98,5‒99,5%. В случае штамма NN1061/16 (G6P[9]) показано близкое родство по 5 генам (VP1‒VP3, NSP2, NSP3) с высоким уровнем сходства нуклеотидных последовательностей ‒ 99,1‒99,8%.

Обсуждение

В настоящей работе дана характеристика разнообразия генотипов РВА, циркулировавших в Нижнем Новгороде в 2021‒2023 гг. Спектр представлен 11 типами с доминированием G3P[8] (59,5%), за которым следовал G9P[8] (10,8%). К июню 2021 г. отмечалось снижение доли генотипов G9P[8] в нижегородской популяции РВ, с последующей сменой доминирующего генотипа на G3P[8] в июле 2021 г. [41]. Полученные сведения служат дополнением к информации о генетических перестройках в популяции РВ в процессе их многолетней циркуляции в Нижнем Новгороде, наблюдения за которыми ведутся с 1984 г. [13, 26, 32, 40‒44].

Представленные результаты также дополняют имеющиеся данные о генотиповой структуре популяций РВ на территории России. По данным референс-центра по мониторингу ОКИ, в зимне-весенний период 2021 г. на территории Российской Федерации (Московская, Томская, Иркутская, Свердловская, Новосибирская области, Республика Дагестан, Хабаровский край, Камчатский край) сохранялось доминирование генотипа G9P[8], но уже отмечалось постепенное возрастание доли генотипа G3P[8]. В 2022 г. произошло значительное уменьшение частоты встречаемости генотипа G9P[8] и показано превалирование в циркуляции на территории Российской Федерации РВ генотипа G3P[8], которое сохранилось и в 2023 г. [4, 5]. Представленная информация согласуется с данными, полученными в настоящей работе.

РВ генотипа G3 гена VP7 обладают широким спектром хозяев и встречаются у большинства восприимчивых видов животных (включая человека, кроликов, обезьян, свиней, птиц, кошек, собак, лошадей, мышей, коров и ягнят) [7, 45, 46]. У РВ человека он в большинстве случаев ассоциирован с генотипом P[8] гена VP4, но реже встречается в сочетании с генотипом P[9] [47‒49]. Комбинация G3P[9] распространена в основном у РВ кошек и собак [50], но благодаря реассортации, штаммы, подобные РВ животных, могут встречаться у человека [51]. Впервые РВА генотипа G3P[9] были обнаружены у человека в 1982 г. в Японии и Израиле [17, 22, 52]. Позднее их появление было зарегистрировано в Таиланде и Испании [53‒59]. На территории Нижнего Новгорода штаммы G3P[9] эпизодически наблюдались в популяции с 1984 г. В ранних исследованиях они изучались на основе отдельно взятых генов (VP4, VP6, VP7, NSP4) [60, 61], первое изучение данных штаммов на основе всех сегментов генома было проведено в 2023 г. [40].

РВ G3P[9] спорадически обнаруживаются у людей, образуя отдельную геногруппу, генетически обособленную от Wa-подобных и DS-1-подобных вирусов [49, 59, 62‒64]. Для человеческого G3P[9] показана возможность существования как минимум 8 разных комбинаций полных генотипов: G3-P[9]-I3-R3-C3-M3-A3-N3-T3-E3-H3 [9, 17], G3-P[9]-I3-R3-C3-M3-A3-N3-Т3-E3-H6 [16, 22, 51], G3-P[9]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T1-E2-H3 [46, 52], G3-P[9]-I2-R2-C2-M2-A3-N1-T6-E2-H3, G3-P[9]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T6-E2-H3 [65], G3-P[9]-I2-R2-C2-M2-A3-N1-T3-E2-H3 [66, 67], G3-P[9]-I3-R3-C2-M3-A3-N1-T6-E3-H3 [68, 69] и G3-P[9]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T3-E3-H3 [68, 70]. Интересно, что ген NSP1 всех штаммов G3P[9] животного и человеческого происхождения неизменно обладает генотипом A3, то время как генотип остальных генов может варьировать (VP6 – I2/I3; VP1 – R2/R3; VP2 – C2/C3; VP3 – M2/M3; NSP2 – N1/N2/N3; NSP3 – T1/T3/T6; NSP4 – E2/E3; NSP5/6 – H3/H6).

Выявленные и исследованные в настоящей работе РВА G3P[9] обладали комбинацией генотипов G3-P[9]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T3-E3-H3. Филогенетический анализ показал, что они разделяли 9 генов (VP1‒VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3, NSP5/6) с кошачьим РВ ВА222 (Италия, 2005 г.). Из них гены VP2, VP3, VP7, NSP1, NSP3 и NSP5 имели высокий процент идентичности нуклеотидных последовательностей (98,7‒100,0%), а VP1, VP4 и VP6 – более низкий (96,3‒98,1%). Нижегородские штаммы отличались от типового ВА222 генами NSP2 и NSP4, которые обладали другими генотипами.

Полученные результаты показывают близкое родство исследованных РВ с более ранними штаммами генотипа G3P[9] из Нижнего Новгорода. В период 2016‒2018 гг. были выявлены и исследованы на основе всех сегментов генома 3 аналогичных штамма РВА генотипа G3P[9] [40]. Их нуклеотидные последовательности использовались для проведения филогенетического анализа в настоящей работе. Сходство нижегородских штаммов G3P[9] разных лет составило для разных генов 99,7‒100,0%.

Межгрупповые реассортанты на основе ВА222-подобной комбинации ранее встречались на территории Южной Кореи. S. Jeong и соавт. (2014) в своей работе исследовали РВА генотипа G3P[9], выделенный в 2012 г. от невакцинированной 9-летней девочки с симптомами тяжелого гастроэнтерита. Исследуемый штамм имел генотип G3-P[9]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T3-E3-H3. Филогенетический анализ показал, что он разделял 9 генов (VP1‒VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3, NSP5/6) с прототипным ВА222, с разным уровнем сходства нуклеотидных последовательностей. По гену NSP2 была установлена кластеризация исследуемых штаммов с типичными DS-1-подобными РВ человека, а для NSP4 – с австралийским штаммом РВА кошек и собак. Этот штамм имел сложное эволюционное происхождение, потенциально включающее события реассортации между РВ кошек и DS-1-подобных РВА человека [70].

Аналогичные данные были получены группой исследователей из Китая. M. Cao и соавт. в 2023 г. исследовали 2 штамма генотипа G3P[9], выделенные в 2020 и 2023 гг. от 12-месячной девочки и 16-месячного мальчика соответственно. Оба штамма имели комбинацию генотипов: G3-P[9]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T3-E3-H3. Филогенетический анализ установил, что оба исследуемых РВА разделяли 8 генов (VP1‒VP4, VP7, NSP1, NSP3 и NSP4) с РВА, подобными РВ кошек и собак, с разным уровнем сходства нуклеотидных последовательностей (99,3‒99,6%). Оставшиеся 3 гена (VP6, NSP2 и NSP5/6) были связаны с типичными DS-1-подобными РВ человека (99,3‒100,0%) [68].

В проведенном исследовании показана циркуляция необычных штаммов, которые имели генотипы G2-P[4]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T3-E2-H3 и G2-P[4]-I2-R2-C2-M2-A3-N2-T3-E3-H2. Гены VP1‒VP3, VP6, NSP1, NSP3‒NSP5/6 одного из них и VP1‒VP3, VP6, NSP1, NSP3, NSP4 второго были связаны с прототипным штаммом ВА222 РВА (Италия, 2005 г.). Остальные гены (а именно VP4, VP7 и в случае одного штамма NSP5/6) произошли от человеческих DS-1-подобных штаммов генотипа G2P[4]. Штаммы с такой комбинацией генотипов были выявлены и охарактеризованы с помощью секвенирования всех сегментов генома впервые. В России и в мире сообщений о выявлении аналогичных штаммов G2P[4] ранее не отмечено. По всем генам, как по ВА222, так и по DS-1-подобным, данные штаммы имели ближайших родственников из Нижнего Новгорода, что позволяет предположить их локальное происхождение.

Реассортантные штаммы, охарактеризованные в данной работе, не могли быть выявлены с помощью G/[P]-генотипирования методом ПЦР, которое рутинно используется для изучения РВ. Это подчеркивает важность применения полногеномной системы классификации и современных методов секвенирования для мониторинга циркуляции этого возбудителя.

Заключение

Результаты исследования в совокупности с полученными ранее данными расширяют представление о значительном генетическом разнообразии РВ и роли реассортантов в его поддержании. Эта информация важна для создания новых ротавирусных вакцин, понимания эволюционных процессов в популяции РВА и указывает на актуальность изучения генетической эволюции редких и новых штаммов вирусов. Для контроля появления новых вариантов необходим постоянный молекулярный мониторинг циркулирующих РВА с использованием полногеномной классификации.

Финансирование. Исследование проведено в рамках выполнения Государственного задания Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этическое утверждение. Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Локальным этическим комитетом ФБУН «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор) (Протокол № 6 от 24.03.2021).

Об авторах

Елена Игоревна Великжанина

ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)

Автор, ответственный за переписку.
Email: www.e_velikzhanina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4069-1427

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций

Россия, 603950, г. Нижний Новгород

Татьяна Александровна Сашина

ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)

Email: tatyana.sashina@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3203-7863

канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций

Россия, 603950, г. Нижний Новгород

Ольга Владимировна Морозова

ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)

Email: Olga.morozova.bsc@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8058-8187

канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций

Россия, 603950, г. Нижний Новгород

Александр Юрьевич Кашников

ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)

Email: a.kashn@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1033-7347

научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций

Россия, 603950, г. Нижний Новгород

Наталия Владимировна Епифанова

ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)

Email: epifanovanv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7679-8029

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций

Россия, 603950, г. Нижний Новгород

Надежда Алексеевна Новикова

ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)

Email: novikova_na@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3710-6648

д-р биол. наук, профессор, ведущий научный сотрудник, заведующая лабораторией молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций

Россия, 603950, г. Нижний Новгород

Список литературы

Дополнительные файлы