Разработка, получение и характеристика вирусоподобных частиц SARS-CoV-2 (Coronaviridae: Orthocoronavirinae: Betacoronavirus: Sarbecovirus)

Полный текст

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения, по состоянию на 8 ноября 2023 г. в мире зарегистрировано более 770 млн подтвержденных случаев COVID-19, включая 6,9 млн смертей. По состоянию на 4 ноября 2023 г. было введено в общей сложности 13 534 474 309 доз вакцины¹. В России за 44 нед 2023 г. среди выявленного 34 191 случая COVID-19 было 22 993 случаев, закончившихся выздоровлением, 5042 случая потребовали госпитализации и 63 имели летальный исход².

Вакцинация является одним из наиболее эффективных и доступных медицинских вмешательств, которое ежегодно спасает миллионы жизней [1]. Несмотря на это, заболевания, которые удается предотвратить с помощью вакцин, возникают вновь, и уровень приемлемости вакцины остается неоптимальным как для плановых вакцинаций, так и для вакцинаций, не включенных в календарь прививок [2]. Существующие вакцины против SARS-CoV-2 – это векторные, вакцины на основе мРНК, инактивированные вакцины, а также вакцины на основе вирусоподобных частиц (Virus like particles, VLP) [3]. На эффективность вакцин влияет постоянное приобретение вирусных мутаций из-за присущей вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразе высокой частоты ошибок и существования сильноизменчивого мотива связывания с рецептором в S-белке [4].

Перспективный подход в создании эффективных вакцин – это разработка вакцин на основе VLP, которые представляют собой структурные белки вируса, способные к самосборке, имитирующие вирион, но не несущие в себе вирусного генома. В настоящее время вакцины на основе VLP проходят разные фазы клинических исследований – NVX-CoV2373 (Novavax) [5], Covifenz (Medicago) [6], ABNCoV2 (RadboudUniversity) [7] и LYB001 (Yantai Patronus Biotech Co Ltd) [8]. Однако в указанные вакцины включен только S-белок SARS-CoV-2. Представляется более перспективным разрабатывать вакцины на основе 4 структурных белков коронавируса для имитации вириона SARS-CoV-2.

SARS-CoV-2 относится к роду β-Coronavirus семейства Coronaviridae порядка Nidovirales [9]. Геном SARS-CoV-2 представлен РНК положительной полярности длиной около 30 тыс. нуклеотидов и имеет примерно 82% идентичности последовательностей с SARS-CoV и MERS-CoV и более 90% идентичности последовательностей основных ферментов и структурных белков. Вирион SARS-CoV-2 состоит из 4 структурных белков, которые включают белки шипа (S), оболочки (E), мембраны (M) и нуклеокапсида (N) [10, 11].

Белок N связывается с РНК вируса, образуя рибонуклеокапсид, находящийся внутри вирусной частицы. Белок N – наиболее консервативный белок коронавируса. Белки Е и М – это относительно небольшие белки (75 аа и 222 аа соответственно), составляющие вирусную оболочку. Белок S составляет шип на поверхности вируса. Этот белок играет важнейшую роль в патогенезе вируса. Рецептор-связывающий домен (Receptor binding domain, RBD) – домен, входящий в состав этого белка, отвечает за связывание вирусной частицы и клеточного рецептора. Считается, что антитела, нейтрализующие вирус, вырабатываются именно против этого белка.

VLP содержат большое количество повторяющихся фрагментов вирусных поверхностных белков, представляющих собой конформационные вирусные эпитопы, которые способны вызывать Т-клеточный и В-клеточный иммунный ответ. При иммунизации VLP стимулируют дендритные клетки, которые захватывают соответствующие антигены для презентации T- и В-лимфоцитам [12].

Технология получения VLP позволяет при необходимости быстро менять их состав, согласно текущей эпидемической ситуации. Так как изначально ген, кодирующий белок коронавируса, находится в виде ДНК в плазмидном векторе, в его последовательность можно вносить изменения при помощи сайт-направленного мутагенеза и таким образом корректировать антигенный состав вакцины, обеспечивая образование широкого спектра антител против пандемически значимых вариантов SARS-CoV-2.

Цель исследования – разработать технологию получения и очистки VLP на основе рекомбинантных белков E, M, N и S SARS-CoV-2, собранных в клетках насекомых, и дать их комплексную характеристику.

Материалы и методы

Молекулярно-эпидемиологические исследования

После комплексных эпидемиологических исследований для определения актуальных эпидемически значимых штаммов вирусов подбирали и оптимизировали последовательности генов вируса для последующего клонирования в донорную плазмиду, а затем в бакмиду [13].

Получение рекомбинантных бакуловирусов

Кодирующие последовательности были получены синтетическим путем, частота использования кодонов была оптимизирована для экспрессии в культуре клеток насекомых. Для создания каждой генетической конструкции использовали систему экспрессии Bac-to-Bac. Для получения бакуловируса, экспрессирующего белки М, Е, N и S актуальных штаммов коронавируса, применяли трансферный вектор pFastBac (донорную плазмиду). Данный вектор содержит экспрессионную кассету, в которой, помимо клонированных генов, находятся фланкирующие последовательности транспозона Tn7. Рекомбинантная трансферная плазмида используется для трансформации клеток DH10Bac Escherichia coli, которые содержат модифицированный бакуловирусный геном в виде бакмиды и вектор-помощник, кодирующий фермент транспозазу. Отбор рекомбинантных клонов DH10Bac осуществляли методом цветного теста. В выбранных колониях белого цвета перенос экспрессионной кассеты в бакуловирусный геном подтверждали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, один из которых специфичен к клонированной последовательности, а другой – к геному бакуловируса.

Получение и очистка VLP

Трансфекцию перевиваемой линии клеток Spodoptera frugiperda Sf-21 проводили очищенными препаратами бакмидной ДНК, содержащей кодон-оптимизированные последовательности генов коронавируса, с использованием катионного липосомного агента Cellfectin (Invitrogen, США), для каждой конструкции использовали по два клона (посевная концентрация клеток 5 × 10⁵ кл/мл на 10 мкл бакмиды). После трансфекции проводили еще два пассажа на клетках Sf-9.

VLP получали методом коинфекции – одновременного заражения перевиваемой линии клеток насекомых Trichoplusia ni (T.ni) различными сочетаниями рекомбинантных бакуловирусов. Перевиваемую культуру клеток насекомых T.ni культивировали в течение 4 сут после заражения.

После культивирования культуральную жидкость (КЖ) осветляли методом низкоскоростного центрифугирования для освобождения от клеток и клеточного дебриса при 1000 об/мин в течение 5 мин и при 6000 об/мин в течение 20 мин соответственно (4 °С, ротор Sorval SS34).

Для выделения и очистки синтезированных VLP осветленную КЖ наслаивали в ультрацентрифужные пробирки на слой 6 мл 20% раствора сахарозы (не допуская смешивания), приготовленного на буфере TNС (10 мМ Tris-HCl, 140 мМ NaCl, 10 мМ CaCl₂ рН 7,4). Центрифугировали в течение 2 ч при 28 000 об/мин (центрифуга Оptima XE-100, ротор SW 32Ti, Beckman Coulter, +4 °С). Надосадочную жидкость удаляли, полученные осадки ресуспендировали в буфере TNС и хранили при температуре 4 °С.

Характеристика VLP

Электронная микроскопия. Очищенные VLP в объеме 3 мкл наносили на медную сетку, покрытую углеродной подложкой (Ted Pella, США) и обработанную в атмосфере тлеющего разряда. Инкубировали 30 с при комнатной температуре. Затем наносили каплю 2% раствора ацетата урана, инкубировали 30 с. Исследование производили в просвечивающем электронном микроскопе JEOL 2100 (JEOL, Япония), оборудованном катодом из гексаборита лантана, при ускоряющем напряжении 200 кВ. Изображения получали с увеличением ×25 000 с помощью ПЗС-камеры Gatan X100 с размером матрицы 2000 × 2000 пикселей (Gatan, США).

Физические размеры VLP. Физический размер и однородность распределения VLP в очищенной суспензии определяли методом динамического светорассеяния на установке Malvern Zeta Sizer NANO.

Определение концентрации белка. Концентрацию общего белка в готовых очищенных препаратах VLP определяли с помощью коммерческого набора BCA Protein Assay Kit (Thermo, США).

Вестерн-блот. Анализ структурных белков VLP проводили методом электрофореза в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН) по методу Laemmli (1970) на приборе Mini-PROTEAN II (Bio-Rad, США) согласно инструкции производителя. После проведения электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мкм, Schleicher & Schuell, Германия) в мини-ячейке Mini Trans-Blot (Bio-Rad, cat. № 170-3930) согласно методике производителя. Мембраны инкубировали с положительными сыворотками крови лиц, переболевших COVID-19, и отрицательными сыворотками, полученными за 20 лет до пандемии, в разведении 1 : 50. Антитела, провзаимодействовавшие с белками из VLP, на мембране инкубировали с антителами к IgG человека, конъюгированными с пероксидазой хрена («Сорбент», Россия) в разведении 1 : 200, и после инкубации проявляли с использованием Super Signal West Femto Maximum (Thermo Scientific, США) в соответствии с протоколом производителя. Для детекции сигнала хемилюминесценции на мембране экспонировали зеленочувствительную рентгеновскую фотопленку (cat. №126041, Carestream, США). Пленку проявляли с использованием проявителя и фиксажа фирмы «ВИПС-МЕД» (Россия) согласно методике фирмы-производителя.

Реакция нейтрализации с сыворотками крови лиц, перенесших COVID-19. Клетки Vero Е6 заражали SARS-CoV-2, при появлении цитопатического действия вируса (ЦПД) флакон замораживали, оттаивали, КЖ центрифугировали при 3000 об/мин, аликвотировали и замораживали. Титр вируса определяли методом конечных разведений, для чего КЖ добавляли к монослою клеток Vero Е6 в разведениях от 10⁻¹ до 10⁻⁸. Титром вируса считали последнее разведение, где обнаруживалось ЦПД. Пятидесятипроцентную тканевую цитопатическую инфекционную дозу (ТЦИД₅₀) рассчитывали по методу Рида и Менча. При постановке реакции нейтрализации (РН) использовали разведение КЖ, содержащее 100 ТЦИД₅₀ в 100 мкл.

Из сывороток крови лиц, перенесших коронавирусную инфекцию, готовили разведения от 1 : 10 до 1 : 1280 и вносили по 100 мкл в лунки 96-луночного планшета. К разведениям сывороток добавляли по 100 мкл вируссодержащей суспензии и инкубировали смесь в течение 1 ч при 37 °С. Затем смесь переносили в 96-луночный планшет с монослоем клеток Vero E6. Через 72 ч реакцию учитывали, просматривая лунки планшета в микроскоп. Если в сыворотке крови присутствуют нейтрализующие вирус антитела, вирус не будет вызывать ЦПД клеток. Титром сыворотки крови (последним нейтрализующим разведением) считали разведение, при котором обеспечивается 100% защита клеток (отсутствует ЦПД).

Специфическая активность. Идентичность антигенов в VLP антигенам в вирусной частице SARS-CoV-2 оценивали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) по взаимодействию с антителами к SARS-CoV-2 в сыворотках лиц, переболевших COVID-19, охарактеризованных ранее в РН. В лунки планшета сорбировали VLP в течение 18 ч при 4 °С. Затем в лунки с сорбированными VLP вносили сыворотки здоровых лиц (отрицательный контроль) и лиц, перенесших COVID-19, в разведении 1 : 100, инкубировали 1 ч при 37 °С. Затем добавляли антитела к IgG человека, конъюгированные с пероксидазой хрена. (Sigma, США). После инкубации в течение 15 мин (20–25 °С) останавливали реакцию 1 М H₂SO₄. Интенсивность окраски в лунках определяли на спектрофотометре при длине волны 450 нм.

Уровень синтеза VLP оценивали по количественному содержанию RBD белка S методом ИФА. В качестве «захватывающих» и детектирующих антител использовали моноклональные антитела (МКА) к RBD, полученные и охарактеризованные ранее в лаборатории. Лунки иммунологических планшетов сорбировали МКА в концентрации 10 мкг/мл в течение 18 ч при 4 °С. Затем вносили рекомбинантный RBD в концентрациях 15,6; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000 нг/мл для построения калибровочной кривой и исследуемые образцы VLP в разведении 1 : 200–1 : 400. После инкубации в течение 1 ч при 37 °С добавляли пероксидазный конъюгат МКА и инкубировали 1 ч при 37 °С. Затем вносили хромоген-субстратную смесь с тетраметилбензидином («Хема», Россия). Инкубировали 15 мин (20–25 °С), останавливали реакцию 1 М H₂SO₄. Интенсивность окраски в лунках определяли на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Количественное содержание VLP выражали в концентрации RBD, которую вычисляли по величине оптической плотности, используя калибровочную кривую, по следующей формуле:

${\mathrm{C}}_{\mathrm{RBD}} = \frac{{\mathrm{A}}_{450}}{\mathrm{k}} \times n$

где: k – угол наклона калибровочной кривой;

n – кратность разведения исследуемой пробы VLP.

Иммуногенность VLP

Для оценки иммуногенности VLP изучали формирование гуморального (РН и непрямой ИФА, как описано выше) и клеточного иммунного ответа (реакция бласттрансформации лимфоцитов, РБТЛ) после 3-кратной иммунизации золотистых хомяков (Mesocricetus auratus) при внутримышечном введении VLP в концентрации 40 мкг на животное.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов

Все манипуляции выполняли в стерильных условиях. У хомяков извлекали селезенки и гомогенизировали в 3 мл чистой среды RPMI-1640 в стерильном гомогенизаторе. Суспензию клеток центрифугировали на одноступенчатом градиенте плотности фиколл-пака (HistoPaque-1077, Sigma, США), выделяли фракцию мононуклеарных клеток, отмывали дважды в чистой среде RPMI-1640 и помещали в 96-луночные культуральные панели с концентрацией 10⁵ клеток в 100 мкл в лунку. Антигены-стимуляторы добавлялись по 100 мкл в лунку к клеткам до конечных концентраций. В качестве положительного контроля служили спленоциты, активированные конканавалином А (КонА 12,5 мг, «ПанЭко», Россия). В качестве отрицательных контролей использовали: спленоциты из селезенок неиммунизированных хомяков; спленоциты без стимуляции антигенами, а также спленоциты, стимулированные неспецифическим антигеном (вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки, Crimean-Congo hemorrhagic fever). Клетки культивировали в полноростовой среде RPMI-1640, с 20% эмбриональной телячьей сывороткой, 2 мМ глутамина, 4,5 г/л глюкозы, 50 мкг/мл гентамицина, 0,2 ед/мл инсулина при 37 °С в атмосфере 5% СО₂. Пролиферацию спленоцитов оценивали в реакции бласттрансформации через 4–5 сут с помощью инвертированного микроскопа (×400). Результаты РБТЛ выражали в виде индекса стимуляции пролиферации (ИСП) – отношения среднего числа бластов в присутствии стимуляторов к среднему числу бластов в отсутствие стимуляторов. Положительным считали результат, если ИСП превышает 2.

Оценку гуморального иммунного ответа проводили методами непрямого ИФА и РН с сыворотками хомяков после 2-й и 3-й иммунизации. Оценку клеточного иммунитета (РБТЛ) проводили после 1-й и 2-й иммунизации.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программ Prizm Graphpad 8.4.3 (Graph Pad Software, США) и Statistica 12.6 (Stat Soft Inc., США). Результаты считали статистически достоверными при р < 0,05.

Результаты

Молекулярно-эпидемиологические исследования и получение рекомбинантных бакуловирусов

В результате проведенных молекулярно-эпидемиологических исследований [13] для получения рекомбинантных белков как антигенов вакцины были выбраны гены S-белка 4 актуальных штаммов, наиболее распространенных в Российской Федерации и Европе – подобный вирусу Ухань, Delta, Alpha и Omicron и гены белков E, M и N SARS-CoV-2. Выбранные аминокислотные последовательности были оптимизированы для наработки в клетках насекомых и клонированы в трансферный вектор pFastBacDual. Получили рекомбинантные бакуловирусы, несущие гены белка S 4 разных штаммов, а также белков Е, M и N SARS-CoV-2. Наличие вставок генов в рекомбинантных бакуловирусах было подтверждено методом ПЦР (рис. 1).

 

Рис. 1. Вставки генов соответствующего размера в рекомбинантных бакуловирусах, полученные в результате ПЦР. 1 – диагностический фрагмент гена белка S (597 п.н.); 2 – маркер молекулярных масс; 3 – вставка, содержащая ген белка M (768 п.н.); 4 – вставка, содержащая ген белка N (1359 п.н.); 5 – вставка, содержащая ген белка E (327 п.н.).

Fig. 1. Gene inserts of the appropriate size in recombinant baculoviruses obtained as a result of PCR. 1 – diagnostic fragment of the S protein gene (597 bp); 2 – marker of molecular weights; 3 – insert containing the M protein gene (768 bp); 4 – insert containing the N protein gene (1359 bp); 5 – an insert containing the E protein gene (327 bp).

 

Для оптимизации условий получения белков SARS-CoV-2 был использован 3-й пассаж рекомбинантных бакуловирусов, которым заражали перевиваемую культуру клеток насекомых T.ni. Оценку накопления целевых продуктов выполняли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле, а также методом ИФА, в котором в качестве материала для исследования использовали лизат клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными бакуловирусами в разных дозах, с учетом длительности инкубации (2–5 сут после заражения клеток). В качестве детектирующих антител использовали МКА к RBD S-белка SARS-CoV-2. В результате проведенной работы были установлены оптимальные клоны для каждой конструкции, а также длительность инкубации культуры клеток насекомых, инфицированных различными рекомбинантными бакуловирусами. Полученные данные были использованы при проведении опытов, направленных на оптимизацию параметров коинфекции – одновременного заражения перевиваемой линии клеток насекомых T.ni различными сочетаниями рекомбинантных бакуловирусов. На 1-м этапе рекомбинантные бакуловирусы использовали в одинаковой дозе заражения (0,02 ТЦД₅₀). В результате были сконструированы 4 различные VLP, содержащие на своей поверхности разные S-белки SARS-CoV-2: на поверхности каждой частицы был один их 4 S-белков актуальных клайдов, а также белки Е, M и N, что было подтверждено методом иммуноблоттинга (рис. 2).

 

Рис. 2. Вестерн-блот рекомбинантных белков VLP после обработки положительной (а) и отрицательной сывороткой (б). Дорожки: 1 – отрицательный контроль (клетки T.ni); 2 – N; 3 – M; 4 – E; 5 – S (подобный вирусу Ухань), 6 – S (Omicron); 7 – S (Delta); 8 – S (Alpha); 9 – положительный контроль (SARS-CoV-2).

Fig. 2. Western blot of recombinant VLP proteins after treatment with positive (a) and negative serum (b). Tracks: 1 – negative control (cells T.ni); 2 – N; 3 – M; 4 – E; 5 – S (Wuhan-like virus); 6 – S (Omicron); 7 – S (Delta); 8 – S (Alpha); 9 – positive control (SARS-CoV-2).

 

Таким образом, с использованием вестерн-блота было доказано, что учитываемые белковые полосы в образцах рекомбинантных белков VLP являются специфическими и соответствуют спайковому (S) гликопротеину, гликопротеину малой оболочки (E), мембранному (M) гликопротеину и нуклеокапсидному (N) белку.

Характеристика очищенных препаратов VLP

Морфологию, физический размер и однородность распределения очищенных VLP определяли с помощью электронной микроскопии, а также методом динамического светорассеяния на установке Malvern Zeta Sizer NANO (рис. 3).

 

Рис. 3. Морфология и физические размеры очищенных VLP. а – электронная микроскопия VLP; б – гистограмма распределения VLP по размеру.

Fig. 3. Morphology and physical dimensions of purified VLPs. a – electron microscopy of VLP; b – histogram of VLP size distribution.

 

Специфичность и уровень синтеза очищенных VLP оценивали по концентрации общего белка и по концентрации RBD белка S. Полученные VLP считали специфически активными при содержании RBD больше 5 мкг/мл. Исходя из данных электронной микроскопии, если более 90% полученных VLP собраны правильно и не разрушены, то концентрацию общего белка в очищенных препаратах VLP можно принять за концентрацию VLP. В табл. 1 представлены средние значения содержания VLP, полученные из 1 л КЖ.

 

Таблица 1. Эффективность синтеза VLP, содержащих S-белок 4 штаммов коронавируса: подобный вирусу Ухань, Delta, Alpha и Omicron

Table 1. Efficiency of VLP synthesis of 4 coronavirus strains containing S protein: similar to the Wuhan-like virus, Delta, Alpha and Omicron

VLP SARS-CoV-2	Содержание общего белка в очищенных VLP, полученных из 1 л КЖ, мг (n = 10) Total protein content in  purified VLPs obtained from  1 liter of culture fluid, mg (n = 10)
Подобный вирусу Ухань / Wuhan-like virus (n = 8)	5,6 ± 1,9
Delta (n = 11)	5,9 ± 1,7
Alpha (n = 11)	6,2 ± 1,2
Omicron (n = 8)	5,5 ± 1,9

 

Иммуноспецифичность VLP с использованием сывороток крови здоровых людей и людей, переболевших новой коронавирусной инфекцией

Синтезированные и очищенные VLP имитируют структуру вириона SARS-CoV-2, при этом антигенные детерминанты представлены аналогично таковым у SARS-CoV-2. Результаты исследования иммуноспецифичности (рис. 4) с сыворотками крови лиц, переболевших COVID-19, свидетельствуют о специфичности полученных VLP.

 

Рис. 4. Результаты исследования иммуноспецифичности VLP в ИФА с сыворотками крови лиц, охарактеризованных в РН. По оси абсцисс представлены сыворотки крови, охарактеризованные в РН; по оси ординат – оптическая плотность при длине волны 450 нм, легенда – VLP в концентрациях 8, 2, 0,5 и 0,125 мкг/лунку: отр 1 – сыворотка, отрицательная в РН; отр 2 – сыворотка, отрицательная в РН, взятая более 20 лет назад; 1 : 320 – сыворотка, положительная в РН, титр 1 : 320; 1 : 160 – сыворотка, положительная в РН, титр 1 : 160; 1 : 80 – сыворотка, положительная в РН, титр 1 : 80.

Fig. 4. Results of a study of the immune specificity of VLP in ELISA with human sera characterized by NT. The X-axis shows human sera characterized in NT; the Y-axis shows optical density at a wavelength of 450 nm, legend – VLP at concentrations of 8, 2, 0.5 and 0.125 micrograms/well: otp 1 – serum negative in NT; otp 2 – serum negative in NT collected more than 20 years ago; 1 : 320 – serum positive in NT, titer 1 : 320; 1 : 160 –serum positive in NT, titer 1 : 160; 1 : 80 – serum positive in NT, titer 1 : 80.

 

Таким образом, полученные VLP эффективно «узнаются» специфическими антителами из сывороток крови лиц, перенесших COVID-19. При этом наблюдается корреляция между титром в реакции нейтрализации и оптической плотностью при ИФА, что доказывает наличие специфически взаимодействующих антител с VLP.

Иммуногенность VLP

Для оценки иммуногенности VLP изучали формирование гуморального (РН и ИФА) после 2-й и 3-й иммунизации и клеточного иммунитета (РБТЛ) после 1-й и 2-й иммунизации золотистых хомяков (Mesocricetus auratus) при внутримышечном введении VLP в концентрации 40 мкг/доза. С помощью комплекса методов были получены результаты, представленные в виде среднего значения и среднеквадратического отклонения (M ± SEM) в табл. 2.

 

Таблица 2. Результаты наличия специфических IgG, нейтрализующих антител и ИСП в сыворотке крови и крови золотистых хомячков, иммунизированных внутримышечно VLP в концентрации 40 мкг/доза, M ± SEM

Table 2. Results of the presence of specific IgG, neutralizing antibodies and LPAs in the serum and blood of golden hamsters immunized intramuscularly with VLP at a concentration of 40 μg /dose, M ± SEM

Иммунизация Immunization	ИСП LPA	Иммунизация Immunization	РН, обр.зн. NT, val.	ИФА, опт.пл. ELISA, opt.dens.	ИФА, обр.зн. титра ELISA, Reciprocal titer value
1	0,4 ± 0,01	2	340 ± 173	1,094 ± 0,26	12,800
2	8,9 ± 0,91*	3	1280 ± 0*	1,613 ± 0,01	12,800

Примечание. * – значения, достоверно отличающиеся от значения предыдущей вакцинации (р < 0,05).

Note. * – values significantly different from the value of the previous immunization (p < 0.05).

 

Показано, что для формирования клеточного иммунитета достаточна двукратная иммунизация. После 2-й иммунизации происходит статистически значимое, почти 20-кратное увеличение ИСП (8,9 ± 0,91) по сравнению с 1-й иммунизацией (0,4 ± 0,01) (р < 0,05). При исследовании гуморального иммунитета установлено, что специфические вируснейтрализующие антитела IgG обнаруживаются после 2-й и 3-й иммунизации хомяков. При этом уровень IgG не меняется в зависимости от количества иммунизаций (оптическая плотность: 1,094 ± 0,26 и 1,613 ± 0,01 после 2-й и 3-й иммунизации соответственно) (р > 0,05). При этом отмечается достоверное увеличение вируснейтрализующих антител после 3-й иммунизации почти в 4 раза по сравнению со 2-й иммунизацией (обр.зн. 1280 ± 0 и 340 ± 173 после 2-й и 3-й иммунизации соответственно) (р < 0,05). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о формировании специфического гуморального и клеточного ответа у всех исследуемых иммунизированных хомяков в ответ на внутримышечное введение VLP в концентрации 40 мкг/доза.

Обсуждение

Пандемия COVID-19 привела к серьезным экономическим и социальным последствиям во всем мире. С самого начала коронавирус SARS-CoV-2, возбудитель COVID-19, постоянно менялся и продолжает эволюционировать до настоящего времени. На сегодняшний день в разных регионах мира зарегистрировано множество геновариантов SARS-CoV-2. Существуют серьезные опасения по вопросу эффективности имеющихся вакцин против новых вариантов вируса. С учетом вышесказанного, крайне актуальной остается проблема разработки новых вакцинных препаратов, которые не только вызывают эффективный иммунный ответ, но и индуцируют перекрестно-реактивный иммунитет, обеспечивая защиту от новых вариантов SARS-CoV-2 [14]. Результаты исследования циркулирующих в Европе и в Российской Федерации уникальных геновариантов SARS-CoV-2 показали, какие антигенные детерминанты необходимо учитывать при разработке вакцинного препарата. Был проведен анализ изменчивости генома SARS-CoV-2 в процессе распространения COVID-19.

В настоящей работе получены VLP, имитирующие вирион SARS-CoV-2, содержащие 4 структурных белка – Е, M, N и S SARS-CoV-2. При этом поверхностные детерминанты представлены S-белками актуальных клайдов – подобный штамму Ухань (19А), индийский (Delta), британский (Alpha) и Omicron. Таким образом, вакцина на основе полученных VLP обеспечивает образование антител широкого спектра и позволит предотвратить инфекцию, вызванную разными штаммами SARS-CoV-2, а также формировать иммунный ответ, аналогичный тому, который индуцируется при естественной инфекции [15]. Весомым преимуществом VLP-вакцин является отсутствие генетического материала, что исключает возможность репликации вирусного генома. Кроме того, антигены, представленные на поверхности VLP в их нативной конформации, более стабильны, чем в форме субъединиц, что приводит к использованию меньших доз антигена, необходимых для запуска защитного иммунного ответа.

Между штаммами Ухань и Omicron эпитопы Т-клеток высоко консервативны, в то время как многие эпитопы нейтрализующих антител находятся в вариабельных областях спайк-тримера, а субварианты Omicron BA.1–BA.5 имеют мутации в RBD, что снижает нейтрализующую способность антител, формируемых современными вакцинами [15, 16]. Это подчеркивает необходимость использования новых подходов в разработке вакцин и добавления других антигенов, таких как Е, M, N-белки, которые менее мутированы, чем белок S, в составе вакцины против COVID-19. Поскольку антитела менее эффективны к новым вариантам вируса, чем Т-клетки, вакцина, которая индуцирует как клеточный иммунитет, так и гуморальный, может иметь значительное преимущество.

Таким образом, синтезированные VLP, имитирующие вирион SARS-CoV-2, содержащие 4 структурных белка – Е, M, N и S SARS-CoV-2 актуальных клайдов, стимулирующие формирование гуморального и клеточного иммунитета, являются перспективным антигеном для дальнейшей разработки вакцины на основе VLP, которая позволит обеспечить эффективную защиту от SARS-CoV-2 [15, 16].

Использованная в настоящей работе бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых для создания VLP имеет ряд преимуществ: бакуловирусы не инфицируют человека, что делает работу безопасной; клетки насекомых растут в бессывороточной среде, не содержащей животных продуктов, ретровирусов и не являются онкогенными; синтез VLP в бакуловирусной системе экспрессии может быть масштабирован и оптимизирован для промышленного производства иммунобиологических препаратов.

На сегодняшний день одобренные и доступные на коммерческом рынке вакцины на основе VLP включают вакцины против вируса папилломы человека (Cervarix Gardasil, Gardasil 9), против вируса гепатита В (Energix Glaxo Smith Kline, Recombivax) [17]. Против инфекции COVID-19 показала иммуногенные и протективные свойства у мышей, крыс и хорьков VLP-вакцина 6p-VLP-58-1023-Al-K3 с адъювантом CpG ODN/alum, экспрессирующая все 4 структурных белковых антигена SARS-CoV-2 [18]. Эта вакцина прошла I фазу клинических исследований c участием человека [19].

Заключение

Была оптимизирована система синтеза и очистки вирусоподобных частиц – VLP из рекомбинантных белков, синтезированных в бакуловирусной системе экспрессии. В результате исследований получены устойчивые VLP, состоящие из 4 рекомбинантных белков SARS-CoV-2 – Е, M, N и S, имитирующие вирион SARS-CoV-2, способные индуцировать специфический иммунный ответ против SARS-CoV-2. Доказана специфичность полученных VLP. Разработанные VLP могут быть использованы в качестве антигена в иммунобиологическом лекарственном препарате для профилактики COVID-19.

 

¹ World Health Organization. COVID-19. Available at: https://covid19.who.int/

² В России за неделю выздоровело 22 993 человека. Режим доступа: https://объясняем.рф/stopkoronavirus/v-rossii-za-nedelyu-vyzdorovelo-22-993-cheloveka/

Об авторах

Олег Евгеньевич Латышев

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: oleglat80@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5757-3809

кандидат биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, Москва

Ольга Николаевна Зайкова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: zaykova_o_n@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4708-2069

кандидат биол. наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, Москва

Олеся Васильевна Елисеева

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: olesenka80@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0723-9749

кандидат биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, Москва

Татьяна Евгеньевна Савочкина

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: tasavochkina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4366-8476

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, Москва

Яна Юрьевна Чернорыж

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: revengeful_w@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9848-8515

кандидат мед наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, Москва

Антон Владимирович Сыроешкин

ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов»

Email: syroeshkin-av@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0003-3279-7520

доктор биол. наук, профессор, заведующий кафедрой фармацевтической и токсикологической химии

Россия, 117198, Москва

Глеб Владимирович Петров

ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов»

Email: petrov-gv@rudn.ru
ORCID iD: 0009-0004-1123-7393

аспирант 3-го года обучения, ассистент кафедры фармацевтической и токсикологической химии РУДН

Россия, 117198, Москва

Галина Константиновна Воркунова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: g.k.vorkunova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1346-3744

доктор биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, Москва

Виктор Филиппович Ларичев

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: vlaritchev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8262-5650

доктор мед наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биологии и индикации арбовирусов

Россия, 123098, Москва

Ирина Тимофеевна Федякина

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: irfed2@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6421-9632

кандидат биол. наук, заведующая лабораторией экологии вирусов, ведущий научный сотрудник отдела экологии вирусов

Россия, 123098, Москва

Станислав Андреевич Черепушкин

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: cherepushkin1@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1734-5369

научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, Москва

Валерий Владимирович Цибезов

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: tsibezov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2150-5764

кандидат биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории средств специфической профилактики вирусных болезней

Россия, 123098, Москва

Ксения Андреевна Южакова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: chekh-ks@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3130-5029

научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, Москва

Надежда Юрьевна Куликова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: nad007@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-3008-3383

научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, Москва

Варвара Викторовна Лебедева

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: lebedevavv@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3088-0403

научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, Москва

Дмитрий Юрьевич Якунин

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: yd364@mail.ru
ORCID iD: 0009-0009-4531-5739

аспирант лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, Москва

Алина Александровна Козлова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: malinkakozlova88@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2749-3258

кандидат биол. наук, научный сотрудник лаборатории биологии и индикации арбовирусов

Россия, 123098, Москва

Марина Сергеевна Баранец

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: shizotorex@mai.ru
ORCID iD: 0000-0002-3466-3588

кандидат мед. наук, научный сотрудник лаборатории биологии и индикации арбовирусов

Россия, 123098, Москва

Кирилл Иванович Юрлов

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: kir34292@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4694-2445

научный сотрудник лаборатории клеточной инженерии

Россия, 123098, Москва

Екатерина Ивановна Леснова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: wolf252006@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2801-6843

научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 123098, Москва

Татьяна Владимировна Гребенникова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: t_grebennikova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6141-9361

доктор биол. наук, профессор, чл.-корр. РАН, заместитель директора по научной работе подразделения Института вирусологии им. Д.И. Ивановского, руководитель Испытательного центра НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи

Россия, 123098, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы