Филогенетический анализ вариантов вируса Пуумала (Hantaviridae: Orthohantavirus), циркулирующих на территории Саратовской области

Полный текст

Введение

Известно, что на Приволжский федеральный округ (ПФО) Российской Федерации приходится более 80% всех ежегодно зарегистрированных случаев заболевания геморрагической лихорадкой с почечным синдромом (ГЛПС) [1, 2], и Саратовская область не является исключением. Так, по данным, изложенным в письме Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой от 11.03.2024 № 02/4030-2024-32 «Об эпидемиологической ситуации по геморрагической лихорадке с почечным синдромом в 2023 году и прогнозе на 2024 год», в 2023 г. в России зарегистрировано 5093 случая ГЛПС (3,47 на 100 тыс. населения; среднемноголетний показатель (2012–2023 гг., без учета 2020 и 2021 гг.) – 5,34 на 100 тыс. населения), из которых 84,7% случаев приходится на ПФО.

Районирование территории Саратовской области показало, что в 16 из 38 административных районов за период с 2010 по 2022 г. была отмечена высокая интенсивность эпидемических проявлений ГЛПС. К максимально неблагополучным относится в том числе Гагаринский район (бывший Саратовский), а также природный парк «Кумысная поляна», расположенный на территории г. Саратова. Площадь парка составляет 4417 га [3]. В рамках организации местного самоуправления территория Гагаринского района с 1 января 2022 г. включена в городской округ г. Саратова, при этом не входя в черту города.

В европейской части России, в том числе и Саратовской области, наиболее распространенным возбудителем ГЛПС является вирус Пуумала (Puumala orthohantavirus), основной природный носитель (хозяин) которого – рыжая полевка (Myodes glareolus Schreber, 1780) [4, 5]. Вирус Пуумала, как и другие хантавирусы, принадлежит к роду Orthohantavirus семейства Hantaviridae [6]. Вирусный геном представлен сегментированной одноцепочечной РНК отрицательной полярности. Большой сегмент генома (L) кодирует вирусную РНК-полимеразу RdRp, средний (М) – два поверхностных гликопротеина G1 и G2, а малый сегмент (S) – нуклеокапсидный белок (N) [7].

В предыдущей работе [8], совместно с коллегами из ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», было проведено секвенирование полных геномов (сегменты S, M и L) трех образцов, взятых от рыжих полевок, пойманных в природном парке «Кумысная поляна» (г. Саратов) в середине 2019 г. Анализ полученных результатов позволил подтвердить, что вспышку ГЛПС, отмеченную в то время в Саратове, вызвал именно вирус Пуумала. Полученные нуклеотидные последовательности оказались близкими к ранее описанным вариантам из республик Татарстан и Удмуртия, а также Самарской области. Проведены филогенетический анализ вариантов вируса Пуумала, циркулирующих у рыжих полевок, отловленных на территории Республики Татарстан [9, 10], и сравнение с образцами из Удмуртской Республики и Ульяновской области [11]. Анализ показал близость вирусных геномов из исследуемых регионов с вариантами, изолированными в Татарстане. Установлено, что выявленные изоляты вируса Пуумала из Тюменской, Архангельской и Омской областей образуют общую восточно-финскую ветвь, что вызывает дополнительные вопросы о путях распространения основного носителя. Кроме этого, приводятся данные сравнения генетических вариантов из Татарстана, Удмуртии, Самары и Саратова, при этом авторы делают вывод о вероятном возникновении вариантов вируса Пуумала в данных регионах в результате реассортации, поскольку они содержали сегменты S и L, относящиеся к башкирской ветви, и сегмент M, возможно полученный от предков сублинии из Курской, Московской и Ивановской областей [12]. Также предпринята попытка смоделировать филогеографическое распространение хантавируса Пуумала по всей Европе в течение последнего послеледникового периода [13].

Таким образом, целью представленной работы являются определение полной нуклеотидной последовательности генома разных вариантов вируса Пуумала, выделенных на территории Саратовской области, и проведение филогенетического анализа полученных данных.

Материалы и методы

Образцами для исследования послужили пробы органов мелких млекопитающих, в основном рыжей полевки, собранных в 2019–2022 гг. в пригородной и городской зоне Саратова (Природный парк «Кумысная поляна»), а также в Гагаринском, Энгельсском, Новобурасском и Хвалынском районах Саратовской области. Зоологическая группа осуществляла регулярные выезды в точки, определенные планом ежегодного мониторинга, где и проводился отлов.

Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с «Consensus author guidelines for animal use» (IAVES 23 July 2010). Исследование одобрено комиссией по биоэтике ФКУН «Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора (протокол № 8 от 21.11.2023).

Выделение нуклеиновых кислот осуществляли с помощью набора для экстракции РНК/ДНК «АмплиПрайм РИБО-преп», а обратную транскрипцию – с комплектом регентов «Реверта-L» (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребназора, Россия). Присутствие генетического материала хантавирусов определяли методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с набором реагентов «ОМ-Скрин-ГЛПС-РВ» (НПК «Синтол», Россия).

Для исследований была составлена панель из 38 образцов суспензий легких мелких млекопитающих, в которых методом ОТ-ПЦР была выявлена РНК вируса Пуумала. Для специфического обогащения вирусного генома (сегменты S, M и L) в образцах из полевого материала использовали набор праймеров, рассчитанный авторами (табл. 1).

 

Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидных праймеров, используемых в работе

Table 1. Oligonucleotide primer used in the work

Праймер Primer	Структура праймера Primer sequence	Температура отжига, °C Annealing T, °C	Длина ампликона, п.н. Amplicon length, bp
Сегмент S Segment S
Pum_S_1f	TAGTAGTAGACTCCTTGAAAAAGCTAC	50	370
Pum_S_1r	CAATGTCAATGGCGTTCAC
Pum_S_2f	GAAGAATGGCAGATGCTGTGTCCC	58	454
Pum_S_2r	ACGGTCTGTCTTCCACGAGTTGAC
Pum_S_3f	CGACTGGGATTGAACCTGATGATC	56	344
Pum_S_3r	CGGGTGTAAGTTCCTCAGCTTTC
Pum_S_4f	CATTTGAGGATATTAATGGCTTTAGG	54	376
Pum_S_4r	AATCAACTTATCAATGTCTGCCAC
Pum_S_5f	TGCGTAATATCATGAGTCCAGTGATG	56	355
Pum_S_5r	AGCCATCCCAGCAACATAAATG
Pum_S_6f	ACATCGAATCTCCTAATGCACC	54	354
Pum_S_6r	TGATCTATGAGTGACTGAGCAAGG
Pum_S_7f	TGCTCAGTCACTCATAGATCAGAAAG	53	400
Pum_S_7r	AGCTCAGTTTCACATTCTTGGG
Pum_S_7-2f	AATCAGGAGCCCTTAAAGATATG	53	467
Pum_S_7-2r	TCAGCATGTTGAGGTAGTATGTTGTG
Pum_S_fin_f	GTTTTGAATTAATGCACTAATCAGGG	50	350
Pum_S_fin_r	TAGTAGTATGCTCCTTGAAAAGCAATC
Сегмент М Segment M
Pum_М_1f	TAGTAGTAGACTCCGCAAGAAGAAGC	54	386
Pum_М_1r	ATCCTCTCAAATTCACTTCACTGC
Pum_М_2f	CATGGGAAATTAAAGGTGATCTTG	54	309
Pum_М_2r	AATTGCCCTGAAACACAGTATG
Pum_М_3f	GTTTGATCCCTACTTTAGTGGTTG	53	349
Pum_М_3r	CTTCATACTATCACCAGATGTCACC
Pum_М_4f	ATACTGTGTTTCAGGGCAATTGG	56	386
Pum_М_4r	CCTGTTACTTTCCCAGCAATACGTAG
Pum_М_5f	ATCGTTCTGCTGAAGTTCTTTCAAG	56	345
Pum_М_5r	AAGACTGTGCATTGTGTTGTCTTCTC
Pum_М_6f	ACTGGGTTCATCTCATTACCTGG	54	341
Pum_М_6r	TAACTCTACGGCAAGAGAGTGTG
Pum_М_7f	GAGTTATGTGTACCAGGTCTTCACGG	55	340
Pum_М_7r	GCTTGAAGGGCAGATGTTGTTG
Pum_М_8f	ATGGGCTCGATGGTCTGTGAGG	58	380
Pum_М_8r	TATCCCAGACCCGTGTGCTGTGTC
Pum_М_9f	CTCTCTTTAGGTATCGGAGTCGG	55	392
Pum_М_9r	CAGCAGTTTGCCAAGGATAAGC
Pum_М_10f	AAACTGCATTTCATTGCTATGGTTC	55	326
Pum_М_10r	TTGAAATTGTCCCTATCAAACACAC
Pum_М_10-2f	GGCTGTAACCCACTTGATTGCC	58	430
Pum_М_10-2r	CCATCAAACTGGCACACAGGTGTTG
Pum_М_11f	TAATATTTAAGCAATGGTGCACTAC	53	452
Pum_М_11r	CCTTAATTGAAGTAAGAAATGCAG
Pum_М_12f	GATGGGAATACAATTTCAGGATAC	53	307
Pum_М_12r	GCCTTAATTGAAGTAAGAAATGCAG
Pum_М_13f	GAATGGATTGATCCTGACAGTTCAC	56	502
Pum_М_13r	ATCCAATTTCCATTGAGGACCC
Pum_М_13-2f	CAATGTGTTACGGATCTACTACAGC	54	393
Pum_М_13-2r	GCAACTATCTACTAAGGCTTATGCTC
Pum_М_fin_f	GACAGGATACAACCAAGCAGATAGTG	54	417
Pum_М_fin_r	TAGTAGTAGACTCCGCAAGAACAAAAG
Сегмент L Segment L
Pum_L_1f	TAGTAGTAGACTCCGAGATAGAGAAG	51	468
Pum_L_1r	TGTGCTTCTACCTGTAGTTGTTGCTC
Pum_L_2f	ATGATGTGATACAAAGCATGGAG	53	453
Pum_L_2r	TCCTAAAGCCAGATTGACAATTAC
Pum_L_3f	GTTTATTGAGCAACAACTACAGGTAG	53	394
Pum_L_3r	GCCCAGTTACTTCTTTAAATGC
Pum_L_4f	TGTAAGAATTGGCTCGGAACTGATC	56	421
Pum_L_4r	TCAATCAATGCCTTCGACTTAGGATC
Pum_L_5f	ATCTCAAAGGATTCAAAGAAAGGG	54	391
Pum_L_5r	TCAAGTGATTTAGATGGCAGGATAC
Pum_L_6f	CGTGATATTACTGAATCTCTTATTGC	53	406
Pum_L_6r	TGAGATGTGGAAAGAAAGAAATGG
Pum_L_7f	CTTCTTGCTACAGCTACATGGTTTC	54	410
Pum_L_7r	ACGATAATGCTTATACACGACCC
Pum_L_8f	AAGACACTATTAGTTAGCTTAGCCC	52	354
Pum_L_8r	GCTGTTCAACAACTACCTGATTG
Pum_L_9f	TTCATCTTGAAACAGTTGAATGGG	54	438
Pum_L_9r	CTTTGGTATTTCCTAACAATTCTTGC
Pum_L_9-2f	TCATCTTGAAACAGTTGAATGGG	54	341
Pum_L_9-2r	AAACGAATTGCCTCAATGAGAG
Pum_L_10f	GTCAGGAGCATTACAAGAAGATGGTC	56	369
Pum_L_10r	CAACGAGGACTGGATTTCACTTTCTC
Pum_L_11f	ATTCAACAGGCTTTAGAGAAGGC	54	450
Pum_L_11r	GATATAATTTGGCCCACACACG
Pum_L_12f	AATATGGGTGAATTGTCTGATGAAG	54	440
Pum_L_12r	GAATGTAGATAGAAACTCCGCATTTG
Pum_L_13f	GGCAGGAAACTTTCATTGGCATG	57	440
Pum_L_13r	GACATAGAACCATCACCACCTAACGG
Pum_L_14f	TTATATGGTACTGCTCCTGGTATGG	54	383
Pum_L_14r	AGGATGTTGTTCACTCCAAAGCTC
Pum_L_15f	TTTGTAGGTAAAGTTCAGTGGAAAG	53	459
Pum_L_15r	TTGGTCTATGAATTTGTCTTGTTG
Pum_L_15-2f	CTTTGGAGTGAACAACATCCTGTC	54	320
Pum_L_15-2r	ATCCCTCCAGGCATATTCTTTAG
Pum_L_16f	GGATATGGAGCTCTTTCAAACACTTG	55	387
Pum_L_16r	CACAATTACAATCCTCGACTTTCC
Pum_L_17f	TTATTGGTTGAAGACTATGTCTCTTG	52	441
Pum_L_17r	ATTAAATGTTACCCTCAAATCTCC
Pum_L_18f	CTTTATGAAGGAGATTTGAGGGTAAC	53	423
Pum_L_18r	CCTTTAGATTATGGTATGCATGG
Pum_L_19f	CTAATGGATTTAGGGCTATGGC	54	385
Pum_L_19r	TGACCATTGAGTACTAGAGATTGTGC
Pum_L_20f	AGCACAATCTCTAGTACTCAATGGTC	53	405
Pum_L_20r	CGAACTCTGTTAAATCATACGGATC
Pum_L_fin_f	GTCCAAGCATTACAATTTCCATAC	52	304
Pum_L_fin_r	TAGTAGTATGCTCCGAGAAAAGAGC

 

Далее секвенирование полученных продуктов ПЦР проводили с помощью генетического анализатора АВ 3500xl и/или Ion S5, в соответствии с рекомендациями производителя (Thermo Fisher Scientific, США). Для сборки секвенированных фрагментов в одну последовательность использовали программное обеспечение MEGA7 (http://www.megasoftware.net/) и UGENE (http://ugene.net).

При построении филогенетических деревьев в работу брали последовательность сегмента S (центральная часть в 1071 нуклеотид), а также бо́льшую часть последовательности сегментов M и L генома вируса Пуумала, представленных в международной базе данных NCBI GeneBank. Данный раздел работы проводили с использованием алгоритма maximum parsimony в программном пакете BioNumerics 7.6 (Applied Maths, Бельгия).

Результаты и обсуждение

В результате проведенного исследования были получены нуклеотидные последовательности генома вируса Пуумала, циркулирующего на территории Саратовской области, из которых 33 с наиболее качественным уровнем прочтения депонированы в международной базе данных NCBI GenBank (табл. 2).

 

Таблица 2. Нуклеотидные последовательности вируса Пуумала, полученные в результате исследования

Table 2. List of Puumala orthohantavirus sequences obtained in this study and deposited in the NCBI GenBank database

№ No.	Образец Sample	Место получения образца Place of the sample collection	Год сбора материала Year of collection	Номер в базе NCBI GenBank GenBank Accession Number
				сегмент S segment S	сегмент M segment M	сегмент L segment L
1.	114	Гагаринский район Gagarinsky district	2019	OL343591.1	OL343569.1	OL343547.1
2.	131		2019	OL343593.1	OL343571.1	OL343549.1
3.	296		2019	OL343594.1	OL343572.1	OL343550.1
4.	348		2019	OL343595.1	OL343573.1	OL343551.1
5.	420		2019	OL343596.1	OL343574.1	OL343552.1
6.	422		2019	OL343597.1	OL343575.1	OL343553.1
7.	439		2019	OL343598.1	OL343576.1	OL343554.1
8.	525		2019	OL343599.1	OL343577.1	OL343555.1
9.	645		2019	OL343600.1	OL343578.1	OL343556.1
10.	656		2019	OL343601.1	OL343579.1	OL343557.1
11.	696		2019	OL343602.1	OL343580.1	OL343558.1
12.	701		2019	OL343603.1	OL343581.1	OL343559.1
13.	836		2019	OL343604.1	OL343582.1	OL343560.1
14.	988		2019	OL343605.1	OL343583.1	OL343561.1
15.	989		2019	OL343606.1	OL343584.1	OL343562.1
16.	1039		2019	OL343585.1	OL343563.1	OL343541.1
17.	1042		2019	OL343586.1	OL343564.1	OL343542.1
18.	1059		2019	OL343587.1	OL343565.1	OL343543.1
19.	1081		2019	OL343588.1	OL343566.1	OL343544.1
20.	1107		2019	OL343589.1	OL343567.1	OL343545.1
21.	1109		2019	OL343590.1	OL343568.1	OL343546.1
22.	1186		2019	OL343592.1	OL343570.1	OL343548.1
23.	3		2022	OQ032670.1	*	*
24.	29		2022	OQ032672.1	*	*
25.	30		2022	OQ032673.1	*	*
26.	31		2022	OQ032671.1	*	*
27.	99	Энгельсский район Engelssky district	2022	OQ032667.1	*	*
28.	100		2022	OQ032669.1	*	*
29.	101		2022	OQ032668.1	*	*
30.	117	Хвалынский район Khvalynsky district	2021	OR999067	*	*
31.	122		2021	OR999068	*	*
32.	129		2021	OR999069	*	*
33.	272	Новобурасский район Novoburassky district	2021	OR999070	*	*

Примечание. * – данные на этапе анализа.

Note. * – Data at the analysis stage.

 

Сравнительный анализ 26 нуклеотидных последовательностей полного генома вируса Пуумала из пригородной и городской зон Саратова (Гагаринский район) показал их высокую идентичность между собой (98,6–100%), независимо от года изоляции. Образцы из Новобурасского (№ 272) и Энгельсского (№№ 99, 100, 101) районов имели идентичность генома 98,4–99,1% с 26 образцами из Гагаринского района. Три образца из Хвалынского района Саратовской области (№№ 117, 122, 129) были идентичны на 95,5% со всеми вариантами из Гагаринского района. Таким образом, выявлено достаточно большое количество отличий среди вариантов генома вируса из Хвалынского района по сравнению с образцами из Энгельсского, Гагаринского и Новобурасского районов, граничащих друг с другом (рис. 1).

 

Рис. 1. Административное деление Саратовской области. Цветом выделены Гагаринский район и городской округ Саратова (1), Энгельсский (2), Новобурасский (3) и Хвалынский (4) районы.

Fig. 1. Administrative division of the Saratov region. The city district of Saratov (1), Engelssky (2), Novoburassky (3) and Khvalynsky (4) districts are highlighted in color.

 

С использованием имеющихся нуклеотидных последовательностей S-сегмента генома вируса Пуумала, представленных в международной генетической базе, был проведен анализ, включающий 368 вирусных вариантов (рис. 2, а) и построено общее филогенетическое дерево. Сравнение последовательностей М- или L-сегментов генома хантавирусов ограничивается гораздо меньшим их количеством относительно сегмента S, представленным в базе данных, но при этом картина кластеризации изменяется незначительно, сохраняя, как правило, то же взаимное расположение.

 

Рис. 2. Филогенетическое дерево, показывающее близость родства между 368 вариантами генома (сегмент S) вируса Пуумала с территории России, стран ближнего и дальнего зарубежья. а – по трем кластерам; б – увеличенный фрагмент филогенетического дерева – кластер 1 на рис. 2 а. На рис. 2 б образцы, обведенные красным цветом, остались единственными вариантами из республик Башкортостан и Татарстан, Самарской и Ульяновской областей в случае филогенетических деревьев по сегментам M и L.

Fig. 2. Phylogenetic tree showing the close relationship between 368 genome variants (segment S) strains of the Puumala orthohantavirus from Russia, near and far abroad countries. a – for three clusters; b – enlarged fragment of the phylogenetic tree – cluster 1 in Figure 2 a. The close relationship between genome variants (segment S) of 151 strains of the Puumala orthohantavirus from the Volga Federal District is shown. In Figure 2 b, samples circled in red remained the only variants from the republics of Bashkortostan and Tatarstan, Samara and Ulyanovsk regions in the case of phylogenetic trees for segments M and L.

 

При установлении филогенетического родства варианты генома вируса Пуумала из Саратовской области по сегменту S образовали общий кластер с вирусными последовательностями из Ульяновской, Самарской и Пензенской областей, а также республик Татарстан, Башкортостан и Удмуртия. Варианты последовательностей этого же сегмента генома, полученные на других территориях России (Омская, Тюменская, Архангельская, Московская, Ивановская и Курская области, Республика Карелия), оказались значительно удалены от кластера, сформированного из образцов с территории перечисленных выше субъектов ПФО. Стоит отметить, что на одной ветви, образованной геномами из Самарской области, находятся два образца (NCBI, MT822195 и MT822196), полученные из клинического материала, собранного в январе 2020 г. в Швейцарии (рис. 2 а, б). Но в аннотации к этим последовательностям нет информации о возможном месте заражения больных ГЛПС, в результате чего четкие выводы сделать сложно. В остальном в кластер, образованный из последовательностей генома вируса (сегмент S) с территории ПФО, не попало ни одного варианта из других федеральных округов России, стран ближнего или дальнего зарубежья.

Внутри кластера 1 (рис. 2 а, б), образованного геномами вируса Пуумала из образцов с территории ПФО, степень идентичности последовательностей составляет 91,4–100%. Несмотря на то что в сравнительном анализе использовалась только центральная часть последовательности сегмента S (1071 пн), каждый вариант из данного кластера имеет не менее 62 уникальных единичных мутаций, являющихся общими для всех образцов из кластера 1 и отличающих эти варианты от всех других (рис. 2 а, б ). На рис. 2 б показано, что варианты генома хантавируса Пуумала из городского округа Саратова и Энгельсского района и один – из Новобурасского района образуют компактную группу в виде отдельного ответвления. Места отлова носителей вируса Пуумала в пределах городского округа Саратова находились друг от друга от нескольких сотен метров до 9 км. Между местами отлова носителей вируса Пуумала в пределах городского округа Саратова и Энгельсского района расстояние по прямой составляет 14–19 км, а для образца из Новобурасского района – около 46 км. Несмотря на значительное удаление, для вариантов генома вируса Пуумала с данных территорий наблюдается высокая степень идентичности (98% и более), что может свидетельствовать о едином биотопе основных носителей и свободном их перемещении в пределах указанных регионов. Хвалынский район находится на севере Саратовской области (расстояние до других обследованных регионов более 100 км) и граничит с Ульяновской и Самарской областями (рис. 1). Данный факт четко отражается на расположении в кластере 1 (рис. 2 б) вариантов вируса Пуумала. Показано, что образцы из Хвалынского района находятся на разных ветвях с вариантами из Гагаринского, Энгельсского и Новобурасского районов, отличаясь от них на 55–78 однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) (Single Nucleotide Polymorphism, SNP), т.е. имеют идентичность с последними 92,7–96,9%. Ближайшими к вариантам хантавируса из Хвалынского района являются геномы вируса Пуумала из Самарской области, затем его варианты из Республики Татарстан и Ульяновской области (рис. 2 б).

Детальное рассмотрение расположения вариантов генома (сегмент S) вируса Пуумала из Саратовской области (рис. 2 б) показывает очень близкое родство между образцами с территории Гагаринского района, а также их большое сходство с образцами из Энгельсского и Новобурасского районов. Отличие между последовательностью сегмента S (1071 пн) у варианта вируса Пуумала, выделенного в августе 2021 г. в Новобурасском районе, от ближайшего к нему варианта Пуумала, полученного в мае 2019 г. на территории Гагаринского района, составляет 5 ОНП. Отличие между последовательностями сегмента S (1071 пн) у варианта вируса Пуумала, обнаруженного в июле 2022 г. в Энгельсском районе, от ближайшего к нему, полученного в феврале 2020 г. при обследовании Гагаринского района, составляет 15 ОНП. Между всеми исследованными вариантами вируса Пуумала, циркулирующими на территории Гагаринского района Саратовской области, максимальное отличие в последовательности сегмента S (1071 пн) составляет 22 ОНП (идентичность 98% и более).

Анализ молекулярных часов, проведенный группами исследователей [14, 15], показал, что S-сегмент генома хантавирусов эволюционирует со скоростью около 6,7 × 10⁻⁴ единичных замен в год. Эти данные свидетельствуют о довольно медленном изменении генома вируса Пуумала в природе. В целом кластеризация по сегменту S показывает общее происхождение от одного предкового вируса или нескольких близких друг другу его вариантов для всех использованных в анализе образцов с территории ПФО.

Сравнительный филогенетический анализ вируса Пуумала по сегментам М или L образцов, полученных на территории Саратовской области, показывает некоторые изменения в кластеризации, сохраняя, однако, общие тенденции взаимного расположения.

Следует отметить, что по сегментам М или L данных о последовательностях генома вируса Пуумала значительно меньше, чем по сегменту S. На рис. 2 б образцы, обведенные красным цветом, остались единственными вариантами из республик Башкортостан и Татарстан, Самарской и Ульяновской областей в случае филогенетических деревьев по сегментам M и L.

 

Рис. 3. Филогенетическое дерево, показывающее близость родства между 94 вариантами генома (сегмент М) вируса Пуумала с территории России, стран ближнего и дальнего зарубежья.

Примечание: Башкортостан (AB297666, AF442614, KT885051, L08754, MH251332, MK496160, MZ673553, NC_077666); Курская обл. (MZ580943, MZ580946, MZ580949, MZ580952); Ивановская обл. (OP561838); Московская обл. (OP561841); Самарская обл. (AB433850, AB433852); Ульяновская обл. (OP561826); Татарстан (Z84205); Удмуртия (OP561835); Пензенская обл. (OP561847); Швейцария (MT822194); Омская обл. (AF367061, AF442615, AF442616, AF442617); Архангельская обл. (OP561850); Тюменская обл. (OP561853).

Fig. 3. Phylogenetic tree showing the close relationship between 94 genome variants (segment M) of Puumala orthohantavirus strains from Russia, near and far abroad countries.

Note: Bashkortostan (NCBI: AB297666, AF442614, KT885051, L08754, MH251332, MK496160, MZ673553, NC_077666); Kursk region (MZ580943, MZ580946, MZ580949, MZ580952); Ivanovo region (OP561838); Moscow region (OP561841); Samara region (AB433850, AB433852); Ulyanovsk region (OP561826); Tatarstan (Z84205); Udmurtia (OP561835); Penza region (OP561847); Switzerland (MT822194); Omsk region (AF367061, AF442615, AF442616, AF442617); Arkhangelsk region (OP561850); Tyumen region (OP561853).

 

На рис. 3 представлен результат филогенетической кластеризации между 94 вариантами генома (сегмент M, локус в 2920 пн) вируса Пуумала с территории России, стран ближнего и дальнего зарубежья. Полученное филогенетическое дерево показывает, что образцы из Гагаринского района (Saratov ar.) по-прежнему образуют однородную группу и находятся в одном кластере с вариантами из субъектов ПФО, при этом ближайшими по подобию к ним являются варианты вируса из республик Удмуртия (OP561835, идентичность 94,9–95,6%), Татарстан (Z84205, идентичность 94,6–95,3%) и Самарской области (AB433850, идентичность 91,3–92,0% и AB433852, идентичность 90,6–91,3%). Обращает на себя внимание то, что при кластеризации по сегменту М последовательности генома вируса, полученные из Московской, Курской и Ивановской областей, располагаются ближе к вариантам с территории ПФО, нежели варианты из Республики Башкортостан входящей в ПФО. По сегменту М варианты из Башкирии образуют отдельную ветвь, не входящую в кластеры 1 и 2. Напротив, при филогенетической кластеризации вируса по сегменту S все последовательности из ПФО были в одном кластере и значительно удалены от вариантов из Центральной части России. Вероятно, у хантавируса, полученного в Республике Башкортостан, произошла реассортация по сегменту М с каким-то вариантом данного вируса из региона, не входящего в состав ПФО.

Заключение ряда авторов [12] о вероятном возникновении вариантов вируса Пуумала на территории Татарстана, Удмуртии, Самары и Саратова в результате реассортации, поскольку они содержали сегменты S и L, относящиеся к башкирской ветви, и сегмент M, полученный от предков сублинии из Курской, Московской и Ивановской областей, не получило подтверждения в настоящем исследовании. Очевидно стабильное сохранение единства филогенетической обособленности геномов вируса Пуумала на территории субъектов ПФО, за исключением вариантов с территории Башкортостана по сегменту М (рис. 3) и образца из Пензенской области – по сегменту L (рис. 4). На рис. 3, где представлено сродство по сегменту М, любой из вариантов генома вируса Пуумала в кластере 1 отличается как минимум на 433 ОНП (идентичность 85,2%) от любого из вариантов генома вируса Пуумала в кластере 2. Отличие вариантов из Башкортостана составляет не менее 531 ОНП (идентичность 81,8%) от любого из вариантов как в кластере 1, так и кластере 2. Ветвь с ближайшими вариантами вируса Пуумала из Финляндии имеет около 580 ОНП (идентичность 80,1%) от вариантов из Башкортостана.

 

Рис. 4. Филогенетическое дерево, показывающее близость родства между 76 вариантами генома (сегмент L) вируса Пуумала с территории России, стран ближнего и дальнего зарубежья.

Примечание: Башкортостан (AB297667, KT885050, MK496161, MK496164, MH251333, NC_077667); Самарская обл. (AB574183, AB574184); Ульяновская обл. (OP561825); Удмуртия (OP561834); Татарстан (EF405801); Швейцария (MT822193); курская обл. (MZ580944, MZ580947, MZ580953, MZ580950); Московская обл. (OP561840, OP561843); Ивановская обл. (OP561837); Пензенская обл. (OP561846); Архангельская обл. (OP561849); Тюменская обл. (OP561852).

Fig. 4. Phylogenetic tree showing the close relationship between 76 genome variants (segment L) of Puumala orthohantavirus strains from the territory of Russia, near and far abroad countries.

Note: Bashkortostan (NCBI: AB297667, KT885050, MK496161, MK496164, MH251333, NC_077667); Samara region (AB574183, AB574184); Ulyanovsk region (OP561825); Udmurtia (OP561834); Tatarstan (EF405801); Switzerland (MT822193); Kursk region (MZ580944, MZ580947, MZ580953, MZ580950); Moscow region (OP561840, OP561843); Ivanovo region (OP561837); Penza region (OP561846); Arkhangelsk region (OP561849); Tyumen region (OP561852).

 

Отсутствие данных с большинства областей России о циркулирующих на них вариантах вируса Пуумала очень затрудняет возможность сделать выводы о возможных путях возникновения реассортантов.

На рис. 4 представлен результат филогенетической кластеризации между 76 вариантами генома (сегмент L, локус в 6405 пн) вируса Пуумала с территории России, стран ближнего и дальнего зарубежья. Все варианты из Гагаринского района (Saratov ar.) Саратовской области неизменно находятся в одном кластере с другими вирусами Пуумала из субъектов ПФО. Ближайшими к вариантам из Саратовской области, как и в случае сегмента М, являются образцы вируса Пуумала из республик Удмуртия (OP561834, идентичность 95,2–95,8%) и Татарстан (EF405801, идентичность 94,5–95,1%), а также Самарской области (AB574183 и AB574184, идентичность 91,7–92,7%). При анализе сегмента L варианты вируса Пуумала из Республики Башкортостан, хотя и располагаются в одном кластере (кластер 1) вместе вариантами данного вируса из других субъектов ПФО, но значительно от них обособлены, максимальная идентичность составляет 86,1% (около 890 ОНП от ближайшего к ним варианта из Ульяновской обл. в этом кластере). Результат филогенетической кластеризации вариантов генома вируса Пуумала по сегменту L показывает, что образец из Пензенской области не располагается в кластере 1 вместе с вариантами вируса из ПФО, а находится в кластере 2 с вариантами из Ивановской, Московской и Курской областей. Как видно из рис. 2 б и рис. 3, образец из Пензенской области по сегментам S и M относится к кластеру 1, состоящему только из вариантов вируса с территории ПФО. Таким образом, показана возможная реассортация по сегменту L варианта вируса Пуумала из Пензенской области с вариантами этого вируса из Ивановской, Московской или Курской областей, видимо, в результате миграции рыжей полевки. В опубликованных ранее материалах авторы отмечали, что данный вариант генома мог возникнуть в результате двухэтапной рекомбинации [12].

Заключение

Полученные результаты филогенетического анализа разных вариантов вируса Пуумала из Саратовской области с последовательностями, представленными в базе NCBI GenBank, позволяют сделать следующие выводы:

• – все варианты штаммов вируса Пуумала, циркулирующие в Саратовской области, имеют высокую степень подобия геномов, что может свидетельствовать о единстве их происхождения;
• – генетические последовательности вируса Пуумала из Хвалынского района имеют значительные отличия от вариантов, полученных из центральных регионов Саратовской области;
• – все генетические последовательности вируса Пуумала, полученные из городского округа Саратова, в том числе и по сегментам генома S, M и L, не имеют реассортации.

Обобщая полученные данные можно отметить наличие выраженной территориальной приуроченности штаммов вируса Пуумала (точнее их носителей) к определенным регионам или областям. Это позволяет по последовательности сегментов вирусного генома довольно точно определять район возможного инфицирования заболевших и места обитания переносчиков данных геновариантов вируса Puumala orthohantavirus.

Материал подготовлен к публикации на основании исследований, выполненных в рамках НИР 92-2-21 «Разработка системы верификации результатов индикации и идентификации возбудителей опасных инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы с помощью молекулярно-генетических методов» (2021–2023 гг.).

Об авторах

Ярослав Михайлович Краснов

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: rusrapi@microbe.ru
ORCID iD: 0000-0002-4909-2394

кандидат хим. наук, ведущий научный сотрудник

Россия, 410005, Саратов

Екатерина Владимировна Найденова

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: katim2003@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6474-3696

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

Россия, 410005, Саратов

Наталья Петровна Гусева

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: rusrapi@microbe.ru
ORCID iD: 0000-0003-3763-9708

кандидат биол. наук, старший научный сотрудник

Россия, 410005, Саратов

Татьяна Алексеевна Полунина

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: rusrapi@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2234-2760

кандидат мед. наук, старший научный сотрудник

Россия, 410005, Саратов

Наталья Анатольевна Шарапова

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: rusrapi@microbe.ru
ORCID iD: 0000-0002-5289-7783

кандидат биол. наук, научный сотрудник

Россия, 410005, Саратов

Екатерина Анатольевна Соседова

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: rusrapi@microbe.ru
ORCID iD: 0009-0004-4443-2646

научный сотрудник

Россия, 410005, Саратов

Нина Владимировна Котова

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: rusrapi@microbe.ru
ORCID iD: 0000-0002-9270-523X

научный сотрудник

Россия, 410005, Саратов

Кирилл Сергеевич Захаров

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: zaharov_ks@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4726-309X

кандидат биол. наук, старший научный сотрудник

Россия, 410005, Саратов

Андрей Владимирович Казанцев

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: andreikazancev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1790-0411

научный сотрудник

Россия, 410005, Саратов

Ирина Владимировна Доманина

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: rusrapi@microbe.ru
ORCID iD: 0000-0002-4731-8089

научный сотрудник

Россия, 410005, Саратов

Владимир Николаевич Чекашов

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: rusrapi@microbe.ru
ORCID iD: 0000-0002-9593-4353

кандидат биол. наук, старший научный сотрудник

Россия, 410005, Саратов

Михаил Михайлович Шилов

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: rusrapi@microbe.ru
ORCID iD: 0000-0002-0083-8212

кандидат биол. наук, научный сотрудник

Россия, 410005, Саратов

Евгений Николаевич Кондратьев

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: rusrapi@microbe.ru
ORCID iD: 0000-0002-7508-4355

научный сотрудник

Россия, 410005, Саратов

Наталья Александровна Осина

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: davidova_n_work@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0954-5683

кандидат биол. наук, заведующий отделом микробиологии

Россия, 410005, Саратов

Владимир Викторович Кутырев

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: rusrapi@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3788-3452

академик РАН, профессор, директор

Россия, 410005, Саратов

Список литературы

Дополнительные файлы