Динамика репродукции вируса клещевого энцефалита в культурах клеток

Полный текст

Традиционные технологии получения инактивированных вакцин на основе развивающихся куриных эмбрионов в настоящее время не могут обеспечить потребности здравоохранения. Начиная с 1995 г Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует разрабатывать вакцины с использованием в качестве субстрата не куриных эмбрионов, а перевиваемых культур клеток, аттестованных в соответствии Контактная информация: Морозова Ольга Владимировна, д-р биол. наук, вед. научн. с с международными требованиями к клеточным субстратам [9, 10]. Эти культуры клеток обладают рядом преимуществ - способностью к культивированию в системах с развитой поверхностью (в роллерах и биореакторах), в бессывороточ-ных средах или средах с пониженным содержанием сыворотки; стабильностью свойств на протяжении длительного времени для работы с вакцинными штаммами; возможно- |. лаб. иммунологии; e-mail:thestarling@yandex.ru стью получения вирусной биомассы вакцинных штаммов с неизменными антигенными свойствами [7-10]. Однако перевиваемые культуры клеток могут накапливать посторонние агенты в процессе серийного пассирования культуры из питательных сред, сывороток, трипсина и т. п. В целом работа с использованием любых культур клеток сопряжена с риском их контаминации вирусами или микоплазмами. Для специфической профилактики флавивирусных инфекций в настоящее время в мире используют преимущественно инактивированные вакцины за исключением живых аттенуированных вакцин против вирусов желтой лихорадки и японского энцефалита. Для иммунизации населения против клещевого энцефалита на эндемичных территориях применяют 6 типов вакцин, инактивированных формалином: 2 варианта отечественных для взрослых и детей с 3 лет и 4 варианта зарубежных - 2 вакцины для взрослых и 2 вакцины для детей с 1 года жизни. Все 6 вакцин производят по сходной технологии, включающей инактивацию формалином вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) из первичных культур фибробластов куриных эмбрионов, при различиях штаммов вируса. При производстве инактивированных вакцин российские производители (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Московская область, и НПО “Микроген”, Томск) традиционно используют штаммы ВКЭ дальневосточного генетического типа (штаммы Софьин и 205 соответственно), а зарубежные фирмы “Baxter” (Австрия) и “Novartis” (Германия) - западноевропейские штаммы (Найдорф и К23 соответственно), несмотря на доминирование сибирского генетического типа ВКЭ в большинстве эндемичных областей России и ближнего зарубежья. До настоящего времени уровни иммунизации инактивированными вакцинами против клещевого энцефалита в большинстве регионов России не превышают нескольких процентов от общей численности населения (в среднем 5-7%). Вакцинация не всегда предотвращает заболевание, однако для иммунизированных лиц характерны более легкие лихорадочные формы клещевого энцефалита [5]. Цель данной работы состояла в сравнительном анализе инфекции перевиваемых монослойных культур клеток СПЭВ, Vero E6 и вакцинной линии Vero (B) штаммами ВКЭ сибирского и дальневосточного генетических типов. Материалы и методы Вирус. Штаммы ВКЭ дальневосточного типа (Софьин, номер доступа в GenBank X07755, штамм 205 (DQ989336)) и сибирского типа (Айна, номер доступа в GenBank AF091006) получены из Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоц-развития России, Москва. Штаммы ВКЭ 2530 (GenBank GU060547), 2689 и 2703 сибирского генетического типа были выделены от имаго клещей Ixodes persulcatus Schulze, собранных с растительности на территории Новосибирской области в 2009-2011 гг. Культуры клеток. Для культивирования ВКЭ использовали культуры клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ, а также клеток из ткани почки африканской зеленой мартышки Vero E6 и Vero (B) из Коллекции культур тканей ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России, Москва. Рабочий и посевной банки культуры клеток Vero (B) были аттестованы в ГИСК им. Л. А. Тарасевича [3]. Методы определения ВЕЭ Цитопатическое действие (ЦПД). Перевиваемые клетки Vero (B) и Vero E6 выращивали в среде Игла МЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и 160 мкг/мл ген-тамицина при 37oC в течение 2 сут до образования полного монослоя. Заражение ВКЭ проводили в минимальном объеме среды Игла МЕМ без сыворотки в течение 1 ч при 37oC с покачиванием. Затем монослои клеток отмывали и добавляли среду Игла МЕМ с 1% ЭТС. ЦПД наблюдали в течение 20 дней. Клетки почки эмбриона свиньи СПЭВ выращивали в среде 199 с 10% ЭТС до полного монослоя, заражение ВКЭ проводили аналогично вышеописанному. Выявленные по ЦПД штаммы ВКЭ идентифицировали в реакции гемагглютина-ции, используя 0,4% суспензию нативных или формалинизи-рованных эритроцитов гуся, при помощи иммуноферментно-го анализа и обратной транскрипции с последующей ПЦР в реальном времени. Реакция гемагглютинации (РГА). РГА проводили в соответствии с указаниями в работе [6], используя 0,4% суспензию нативных или формалинизированных эритроцитов гуся. Иммуноферментный анализ (ИФА). ИФА образцов культуральных жидкостей клеток СПЭВ и Vero, инфицированных ВКЭ, проводили с применением тест-системы “ВектоВКЭ-антиген” (ЗАО “Вектор-Бест”, Новосибирск). Калибровочный график зависимости оптической плотности продуктов ИФА от количеств антигена ВКЭ построен с помощью тест-системы “ВектоВКЭ-антиген” Д-1154 серии № 84 (выпуск 2008 г.) с применением очищенного гликопротеина Е ВКЭ, выделенного Е. К. Прессманом (Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН), и рекомбинантного белка Е, любезно предоставленного П. А. Белавиным (ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор” Роспотребнадзора, пос. Кольцово Новосибирской области). Обратная транскрипция (ОТ) с последующей ПЦР в реальном времени. Нуклеиновые кислоты из 100 мкл культуральных жидкостей перевиваемых клеток, инфицированных ВКЭ, выделяли с использованием набора “Проба-НК” производства “ДНК-технология” (Москва). ОТ проводили с использованием набора “Реверта-L” (“Интерлабсервис”, Москва). Для количественных оценок применяли ПЦР с праймерами и флюоресцентными зондами, соответствующими гену NS1 ВКЭ [2]. Патогенность для мышей. Для выявления патогенности ВКЭ прибегали к внутримозговому и подкожному заражению двухнедельных мышей ICR образцами культуральных жидкостей через 5-7 дней после инфицирования соответствующих клеток. Контрольной группе мышей аналогичным способом вводили культуральную жидкость интактных клеток. Наблюдали животных до 14 сут после инокуляции исследуемого материала. ВКЭ идентифицировали в гомоге-натах головного мозга зараженных мышей в РТГА [6], ИФА и ОТ-ПЦР [2]. Результаты и обсуждение Адаптация ВКЭ к клеткам СПЭВ, Vero (B) и Vero E6 Культуры клеток СПЭВ, Vero (B) и Vero E6 инфицировали 6 различными штаммами ВКЭ, выделенными от больных клещевым энцефалитом (штаммы Софьин и Айна) или от клещей (штаммы 205, 2530, 2689 и 2703), и изучали особенности репродукции вируса на протяжении 3 последовательных пассажей. Выбор штаммов был обусловлен доминированием сибирского и дальневосточного типов ВКЭ в большинстве природных очагов России и ближнего зарубежья. Штаммы дальневосточного генетического типа включали штамм Софьин ВКЭ, выделенный из мозга умершего больного на Дальнем Востоке в 1937 г., и штамм 205, выделенный от клещей I. persulcatus в Хабаровском крае в 1973 г Штаммы сибирского генетического типа включали штамм Айна, выделенный от больного в Иркутской области в 1963 г., и штаммы 2530, 2689, 2703, выделенные от I. persulcatus в Новосибирской области в 2009-2010 гг Три штамма (Софьин, Айна и 205) после многочисленных пассажей в культуре клеток СПЭВ и мозге лабораторных мышей хорошо изучены и, возможно, являются филогенетическими предшественниками современного биоразнообразия вирусных изолятов. Три свежевыделенных штамма исследованы на уровне исходного заражения мышей-сосунков и отражают современный этап эволюции ВКЭ. Все 6 штаммов никогда ранее не были адаптированы к клеткам Vero. Для 3 исследуемых клеточных линий на 1-м пассаже ЦПД наблюдали через 7-14 дней после заражения клеток Vero (B) и Vero E6 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1,0 0,5 0 0, 2,882 J*'' Айна Софьин Айна '' Софьин Vero (В) Vero (В) Vero Е6 Vero Е6 Айна СПЭВ Софьин СПЭВ 1,07 1,678 0,677 0,461 0,297 625 1,25 2,5 5,0 10,0 20,0 40,0 Количество очищенного гликопротеина Е, нг/мл Рис. 1. Диапазон количеств антигена Е ВКЭ при репродукции в клетках СПЭВ, Vero B и Vero E6. По оси ординат - оптическая плотность по результатам ИФА на антиген ВКЭ с использованием набора производства "Вектор-Бест" (Новосибирск) при 450 нм (о. е.); по оси абсцисс - количество гликопротеина Е. Линейность ПЦР в реальном времени : праймерами и зондом, специфичным для гена NS1 ВКЭ 42,07 10(7) 10(6) 10(5) 10(4) 10(3) 10(2) 10(1) Количество геном-эквивалентов в реакционной смеси I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Циклы Os S I о о _ 700 с - 45-1 600- С 40- _ 1 35- - 1 30- 500- 1 25“ 3 20- I g 15- 400 о Ю-£ 5“ ■ 0- | зоо: с; ; © ■ 200- 100- ■ РНК из культуральных жидкостей клеток Vero (В) —*— РНК из культуральных жидкостей клеток Vero Е6 —*— РНК из культуральных жидкостей клеток СПЭВ —о— Отрицательный контроль ПЦР Рис. 2. Накопление геномной РНК ВКЭ через 5 дней после заражения калеток СПЭВ, Vero (B) и Vero E6. или через 3-5 дней - для клеток СПЭВ. При последующих пассажах ВКЭ ЦПД обнаруживали на несколько дней раньше. Необходимо отметить отсутствие ЦПД после заражения клеток Vero различными штаммами ВКЭ при наличии ЦПД для сублиний Vero (B) иУ^ E6. Динамику репродукции жизнеспособного ВКЭ оценивали по ЦПД при титровании ВКЭ в клетках Vero (B), Vero E6 и СПЭВ в 96-луночных планшетах. В течение первых 2 дней после заражения клеток разными штаммами ВКЭ в течение 3 последовательных пассажей ЦПД не наблюдали. На 3-й день после заражения титры ВКЭ варьировали в диапазоне от 0 до 1,75 lg ЦПД50 с ростом на 9-16-й день постинфекции до 2,8 lg ЦПД50 для клеток Vero (B), до 5,5 lg ЦПД50 для Vero E6 и до 9 lg Ц50ПД50 для клеток СПЭВ по мере ув50еличения количества пассажей. РГА показала существенные различия в накоплении ге-магглютининов ВКЭ в культуральных жидкостях инфицированных клеток СПЭВ, Vero (B) и Vero E6. В клетках СПЭВ и Vero E6 титры РГА варьировали от 1:2—1:4 (на 3-й день после заражения) до 1:16-1:32 (на 9-й день) и далее до 1:160 (на 14-й день), в то время как для культуральных жидкостей инфицированных клеток Vero (B) результаты РГА оказались либо отрицательными для свежевыделенных штаммов ВКЭ сибирского типа, либо были отмечены титры 1:2-1:4 для штаммов Айна и Софьин при 2-м и 3-м пассаже в этих клетках даже через 7-14 дней после заражения. Кроме того, патогенность сибирских штаммов ВКЭ для лабораторных мышей ICR после одного пассажа на клетках Vero (B) оказалась пониженной по сравнению с таковой аналогичного вируса после одного пассажа на клетках Vero E6: инкубационные периоды у зараженных мышей были на 2-3 дня длиннее и летальность на 25% меньше (данные не представлены). Количественные оценки антигена Е ВКЭ в иммуноферментном анализе Динамику накопления антигена E ВКЭ в культуре клеток изучали в ИФА, сопоставляя с калибровочным графиком зависимости оптической плотности от количеств антигена Е с известной концентрацией. На 1-м пассаже абсолютные значения оптической плотности при 450 нм в диапазоне от 0,269 до 6,002 о. е. свидетельствовали о количествах антигена ВКЭ от 1 до более 20 нг/мл в соответствии с калибровочным графиком на линейном участке (рис. 1). Абсолютные и нормированные относительно отрицательного контроля значения оптической плотности и титры в ИФА от 1:128 до 1:256 для 6 исследованных штаммов ВКЭ свидетельствовали о приблизительно совпадающих количествах вирусного антигена. Принимая во внимание молекулярную массу гликопротеина Е ВКЭ около 60 кДа и количество копий димера Е в каждом вири-оне, равное 90, можно приблизительно оценить количества молекул антигена (до 1010) или вирионов (до 108) в 1 мл культуральной жидкости. Количественные оценки вирусной нагрузки в ОТ-ПЦР в реальном времени Анализ РНК, выделенных из культуральных жидкостей инфицированных клеток СПЭВ, Vero (B) и Vero E6, проводили в разное время от момента заражения. Анализ линейности и чувствительности ПЦР в реальном времени с праймерами и зондом, соответствующими гену NS1 ВКЭ, выполняли с использованием в качестве матрицы серии разведений рекомбинантной плазмиды pBR322-TBEVS*, содержащей клонированную полноразмерную ДНК-копию генома ВКЭ (штамм Софьин). Диапазон линейности составлял от 107 до 101 молекул; предел чувствительности - менее 10 геном-эквивалентов. На 1-м пассаже накопление геномной РНК ВКЭ достигало максимальных значений, соответствующих минимальным циклам флюоресценции от 20 до 25, через 5 дней после заражения клеток Vero (B) и Vero E6 (рис. 2) для всех 6 исследованных штаммов ВКЭ. Наблюдаемые в ОТ-ПЦР пороговые циклы от 20 до 35 приблизительно соответствовали количеству от 101 до 106 геном-эквивалентов в реакционной смеси. С учетом аликвоты РНК для обратной транскрипции и кДНК для ПЦР в реальном времени, а также неполной эффективности выделения РНК и ревертирования можно оценить количества копий геномов (от 103 до 108) в 1 мл культуральных жидкостей инфицированных клеток и соответственно равное количество вирионов, что совпадало с данными ИФА (см. рис. 1) и микроскопическими наблюдениями ЦПД для клеток СПЭВ, для которых титры жизнеспособных сибирских и дальневосточных штаммов ВКЭ достигали 9 lg ЦПД Однако для клеток Vero E6 титры жизнеспособного ВКЭ были не более 5 lg ЦПД50 через 16 дней после заражения, а для клеток Vero (B) не превышали 3 lg ЦПД50 при приблизительно одинаковых количествах РНК и антигена Е в культуральных жидкостях инфицированных клеток всех 3 типов. На основании данных титрования штаммов ВКЭ, ИФА и ОТ-ПЦР в реальном времени отечественная вакцинная клеточная линия Vero (B), охарактеризованная в соответствии с требованиями ВОЗ, и клетки Vero E6 можно применять для разработки вакцин против клещевого энцефалита. Работа проводилась частично при поддержке междисциплинарного интеграционного гранта № 83 СО РАН.

Список литературы

Дополнительные файлы