Antiviral and virucidal activity of sodium deoxyribonucleate and its complex with iron against viruses of different kingdoms and families

Full Text

Введение

Актуальнейшей проблемой современной медицины является борьба с острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ). Эта группа заболеваний, к сожалению, хорошо известна миллионам жителей нашей страны. Среди возбудителей ОРВИ – вирусы гриппа, аденовирусы, риновирусы, коронавирусы.

Представители последнего семейства – Coronaviridae – HCoV-229E, -OC43, -NL63 и -HKU1, HCoV-229E, круглогодично присутствуют в структуре ОРВИ. Однако печально известными в начале XXI в. стали три других вируса – SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2, вызывающие тяжёлые пневмонии, часто со смертельным исходом [1, 2].

Для борьбы с ОРВИ необходимы лекарства широкого противовирусного спектра действия, а также средства, повышающие защитные функции иммунного ответа. Подобным эффектом – противовирусным и иммуномодулирующим – обладают препарат дезоксирибонуклеата натрия (ДНК-Na) и его комплекс с железом (ДНК-Na-Fe), созданные на основе двухнитевой ДНК природного происхождения.

Показана их эффективность в отношении РНК- и ДНК-содержащих вирусов: вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусов гриппа, вирусов семейства герпеса, вируса японского энцефалита [3–5]. В то же время нами не обнаружена активность в отношении вируса энцефаломиокардита мышей, у вириона которого нет липидной оболочки.

Помимо антивирусных свойств, у ДНК-Na возможно наличие вирулицидных свойств – действие на вирусные частицы, находящиеся вне клетки. Данные об этом, а также информация о противовирусных свойствах ДНК-Na в отношении представителей семейств Coronaviridaе, Adenoviridae, Picornaviridae в доступной нам литературе не обнаружены. Поэтому целью исследования было изучение противовирусной активности ДНК-Na и его комплекса с железом в отношении вышеназванных семейств вирусов, а также вирулицидной эффективности в отношении этих вирусов и представителей семейств Retroviridae и Herpesviridae.

Материалы и методы

Исследования эффективности действия препаратов проводились на модели клеток, инфицированных вирусами. Для накопления вирусов использовали 50-миллилитровые культуральные флаконы. При определении инфекционных титров противовирусного и вирулицидного действия использовали 96-луночные культуральные планшеты. Каждая экспериментальная точка включала по четыре повтора.

Вирус полиомиелита типа 1, вакцинный штамм, получен из ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН. Титр вируса 6,5 lg ТЦИД₅₀.

Аденовирус человека, тип 5 получен из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии имени Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» (НИЦЭМ имени Н.Ф. Гамалеи) Минздрава России. Титр вируса 5,5 lg ТЦИД₅₀.

Коронавирус свиней – вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (Alphacoronavirus) получен из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии имени Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Титр вируса 6,5 lg ТЦИД₅₀.

ВИЧ 1-го типа (ВИЧ-1). В качестве источника ВИЧ использовали штамм ВИЧ-1_899А из коллекции штаммов ВИЧ Института вирусологии имени Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Титр вируса 7,0 lg ТЦИД₅₀.

Вирус герпеса простого (ВПГ). В качестве источника взят ВПГ типа 1 (ВПГ-1), штамм Л2, из Государственной коллекции вирусов «Института вирусологии имени Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ имени Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России. Титр вируса 5,0 lg ТЦИД₅₀.

Клетки. Для работы с вирусом полиомиелита и ВПГ использовали культуру клеток почки зелёных мартышек Vero. Для работы с аденовирусом использовали перевиваемую линию клеток человека HЕр-2. Для работы с ВИЧ использовали лимфобластоидные клетки человека МТ-4. Для работы с коронавирусом использовали культуру клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) из коллекции культур клеток Института вирусологии имени Д.И. Ивановского» ФГБУ «НИЦЭМ имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Суспензионные клетки МТ-4 культивировали в среде RPMI 1640 с 10% сыворотки эмбрионов коров (НПП «ПанЭко»), 146 мг L-глутамина (НПП «ПанЭко», 100 мкг/мл гентамицина (Shandong Weifang Pharmaceutical Factory Co., Ltd., Швейцария), а монослойные культуры СПЭВ, Vero и HЕp-2 – в среде DMEM (НПП «ПанЭко») с 10% сыворотки эмбрионов коров (НПП «ПанЭко»), 146 мг L-глутамина (НПП «ПанЭко», 100 мкг/мл гентамицина (Shandong Weifang Pharmaceutical Factory Co., Ltd., Швейцария). Монослойные культуры клеток пересевали с помощью смеси раствора Версена с трипсином (НПП «ПанЭко»). Клетки культивировали в 96-луночных пластиковых панелях и культуральных флаконах (SPL Lifesciences, Корея).

Препараты: ДНК-Na и ДНК-Na-Fe производства ООО «ФЗ Иммуннолекс» в виде коммерческого раствора. Активной субстанцией препарата является биологически активная натриевая соль нативной высокоочищенной низкополимерной дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок осетровых рыб, относящейся к классу полимерных соединений с молярной массой 270–500 кД, гиперхромным эффектом свыше 37%, модифицированная ионами железа [3].

Исследование цитотоксического действия. Клетки рассевали на 96-луночные планшеты и добавляли исследуемое средство в различных концентрациях. Инкубировали клетки при 37 °C в атмосфере с 5% СО₂ и 98% влажности. Через 3 дня определяли жизнеспособность с использованием 0,4% раствора трипанового синего и тетразолиевого красителя (метод МТТ) [6, 7]. В случае оценки жизнеспособности и подсчёта количества клеток с использованием трипанового синего клеточную суспензию и краситель смешивали в соотношении 1 : 1, через 5 мин помещали в камеру Горяева и определяли количество живых и мёртвых клеток под световым микроскопом. Процент живых клеток определяли путём умножения на 100 отношения количества живых клеток в 1 мл суспензии к общему количеству клеток в 1 мл суспензии. В опытах, в которых использовали МТТ бромида 3-(4,5-диметилтиазол)-2,5-дифенилтетразолия (Sigma-Aldrich, St. Louis, США), через определённое время для оценки жизнеспособности к каждой лунке добавляли 10 мкл 5 мг/мл MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, США). После инкубации 2–4 ч при 37 °C вносили в каждую лунку 100 мкл раствора диметилсульфоксида, содержащего 10% додецилсульфата натрия. Затем определяли оптическую плотность (ОП) при 490 нм. Выживаемость клеток рассчитывали по формуле (1):

(ОП опытных лунок – ОП среды) / (ОП контр. лунок – ОП среды) × 100%. (1)

Исследование противовирусного действия. К культуре клеток добавляли исследуемое средство по разным схемам: за 1 и 2 ч до инфицирования, одновременно с вирусом, через 1 ч после инфицирования клеток. Множественность инфекции – 10^–3 ТЦИД₅₀/клетка. Инкубировали культуры клеток при 37 °C в атмосфере с 5% СО₂ и 98% влажности 3–4 дня. Учёт результатов: определение подавления репродукции вируса в клетках с помощью световой микроскопии: исследование цитопатического эффекта вируса (ЦПЭ) [6, 8], как описано выше.

Степень защиты клеток от цитодеструктивного действия вируса определяли по формуле (2):

% защиты=$\frac{A-B}{K-B}\times 100,$ (2)

где А – число жизнеспособных клеток в опытной группе; В – то же в инфицированной культуре (контроль вируса); К – то же в неинфицированной культуре (контроль клеток).

В качестве препаратов сравнения использовали антиретровирусные препараты: ингибитор обратной транскриптазы ВИЧ ретровир (азидотимидин) (GlaxoSmithKline, Великобритания) и ингибитор протеазы ВИЧ криксиван (индинавир) (Merck Sharp & Dohme B.V., Нидерланды).

Исследование вирулицидного действия проводили методом смешивания вирусной суспензии и исследуемого средства (тест in vitro) при температуре 20 ± 2 °C, а также на тест-объекте – искусственной коже, где создавали вирусную пленку [8, 9]. В тесте in vitro смешивали тест-вирус (в соотношении 1 : 9) с исследуемым средством, инкубировали (согласно схеме исследования), готовили 10-кратные разведения смеси вируса и средства (10^–1–10^–8), а затем вносили в планшеты с культурой неинфицированных клеток. Планшеты инкубировали в СО₂-термостате при оптимальной для данного вируса температуре (34–37 °C) до развития 100% ЦПЭ (3–6 дней). Репродукцию вируса в клетках оценивали методом световой микроскопии по вирусиндуцированному ЦПЭ и окрашиванием клеток с помощью 0,4% раствора трипанового синего и тетразолиевого красителя [6–8], как описано выше.

При испытании на тест-объекте суспензию тест-вируса в объёме 0,2 мл наносили на поверхность тест-объекта и высушивали при температуре 20 ± 2 °C в течение 20–30 мин. Контаминированный вирусом тест-объект протирали тампоном, смоченным исследуемым средством, и оставляли на заданное время для обеззараживания. Контроль – проба, взятая с контаминированной вирусом поверхности, протёртая тампоном, смоченным водой. После истечения времени контакта вируса со средством контаминированную поверхность протирали тампоном, смоченным питательной средой. Аналогичную процедуру проводили с контролем (обработка поверхности без исследуемого средства). Затем проводили титрование тест-вируса на культурах клеток, как описано выше.

Индукция цитокинов. Клетки МТ-4 (концентрация 10⁶/мл) инкубировали с ДНК-Na-Fe в концентрации 1000 мкг/мл в культуральной среде RPMI 1640 в течение 1 ч, отмывали (центрифугирование 5 мин при 800 оборотов/мин), добавляли свежую среду RPMI 1640 и инкубировали 12 ч при 37 °C.

Определение цитокинов. Определение цитокинов в культуральной жидкости проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов «ИФА-Бест» («Вектор-Бест», Россия) согласно инструкции изготовителя. Результаты учитывали с помощью фотометра Stat Fax-3200 (США) при длине волны 450/630 нм.

Методы статистической обработки результатов. Статистический анализ данных описательной статистики и определения коэффициента Стьюдента проводили с помощью программы BioStat 2009, версия 5 (AnalystSoft Inc., США). Уровень значимости α был равен 0,05.

Результаты

Полученные данные (табл. 1–3) показали, что ДНК-Na и ДНК-Na-Fe в дозах 250–2500 мкг/мл не оказывали цитотоксического действия на клетки Vero, НЕр-2 и СПЭВ.

Исследование противовирусного действия ДНК-Na и ДНК-Na-Fe показало (табл. 1), что они обладали противовирусной активностью в отношении аденовируса при всех схемах введения (до инфицирования клеток, одновременно с вирусом) при всех исследованных концентрациях – 250–1000 мкг/мл. Однако ЭК₅₀ (50% эффективная концентрация) была достигнута только в случае дозы 1000 мкг/мл при применении ДНК-Na-Fe за 2 ч до инфицирования клеток. Индекс селективности (ИС) равен 10.

 

Таблица 1. Исследование противовирусной активности дезоксирибонуклеата натрия и его комплекса с железом в отношении аденовируса

Table 1. Study of antiviral activity of sodium deoxyribonucleate and its complex with iron against adenovirus

Препарат Agent	Концентрация, мкг/мл Concentration, µg/ml	Токсичность*, % Toxicity*, %	Защита клеток**, % Cell protection**, %
			за 2 ч до инфицирования 2 h before infection	за 1 ч до инфицирования 1 h before infection	одновременно с инфицированием Simultaneously with infection
ДНК-Na DNA-Na	1000	79,7 ± 0,03	40,6 ± 0,04	38,2 ± 0,03	31,2 ± 0,05
	500	83,0 ± 0,04	36,1 ± 0,03	33,8 ± 0,05	28,3 ± 0,05
	250	87,4 ± 0,04	32,9 ± 0,05	25,9 ± 0,06	23,0 ± 0,06
ДНК-Na-Fe DNA-Na-Fe	1000	82,0 ± 0,03	51,0 ± 0,07	42,9 ± 0,03	37,9 ± 0,04
	500	86,5 ± 0,04	42,0 ± 0,04	34,1 ± 0,04	35,3 ± 0,07
	250	91,4 ± 0,05	33,2 ± 0,04	28,3 ± 0,05	25,9 ± 0,03

Примечание. *По отношению к интактному контролю клеток. **Показатель защиты действия препарата от вируса, выраженный в %, ± стандартное отклонение (по формуле Рида–Менча).

Note. *In relation to intact cell control. **The indicator of drug-induced protection from the virus, expressed in %, ± standard deviation (according to the Reed–Mench formula).

 

Противовирусный эффект не был обнаружен в случае вируса полиомиелита ни при какой схеме введения обоих препаратов (табл. 2).

 

Таблица 2. Исследование противовирусной активности дезоксирибонуклеата натрия и его комплекса с железом в отношении полиовируса

Table 2. Study of antiviral activity of sodium deoxyribonucleate and its complex with iron against poliovirus

Препарат Agent	Концентрация, мкг/мл Concentration, µg/ml	Токсичность* % Toxicity*, %	Защита клеток**, % Cell protection**, %
			за 2 ч до инфицирования 2 h before infection	за 1 ч до инфицирования 1 h before infection	одновременно с инфицированием simultaneously with infection
ДНК-Na DNA-Na	1000	81,0 ± 0,03	0	0	0
	500	81,4 ± 0,04	0	0	0
	250	92,5 ± 0,05	0	0	0
ДНК-Na-Fe DNA-Na-Fe	1000	84,2 ± 0,03	0	0	0
	500	90,7 ± 0,04	0	0	0
	250	91,0 ± 0,05	0	0	0

Примечание. *По отношению к интактному контролю клеток. **Показатель защиты действия препарата от вируса, выраженный в %, ± стандартное отклонение (по формуле Рида–Менча).

Note. *In relation to intact cell control. **The indicator of drug-induced protection from the virus, expressed in %, ± standard deviation (according to the Reed–Mench formula).

 

Исследование противовирусного действия препаратов показало (табл. 3), что оба препарата обладали противовирусной активностью в отношении коронавируса при всех схемах введения (до инфицирования клеток, одновременно с вирусом, после инфицирования клеток) при всех исследованных концентрациях – 100–2500 мкг/мл. ЭК₅₀ для ДНК-Na составила ~2500 мкг/мл, для ДНК-Na-Fe – ~1000 мкг/мл. Уровень противовирусной защиты был практически одинаковым при всех схемах введения – и профилактической, и лечебной. ИС равен 4,6 и 10 соответственно.

 

Таблица 3. Исследование противовирусной активности дезоксирибонуклеата натрия и его комплекса с железом в отношении коронавируса

Table 3. Study of antiviral activity of sodium deoxyribonucleate and its complex with iron against coronavirus

Препарат Agent	Концентрация, мкг/мл Concentration, µg/ml	Токсичность* % Toxicity*, %	Защита клеток**, % Cell protection**, %
			за 2 ч до инфицирования 2 h before infection	за 1 ч до инфицирования 1 h before infection	одновременно с инфицированием simultaneously with infection
ДНК-Na DNA-Na	2500	85,3 ± 0,04	60,2 ± 0,07	57,0 ± 0,06	56,2 ± 0,08
	1000	86,5 ± 0,02	43,2 ± 0,05	40,9 ± 0,07	40,0 ± 0,03
	500	87,8 ± 0,03	40,7 ± 0,03	37,9 ± 0,03	37,9 ± 0,02
	250	96,0 ± 0,07	36,9 ± 0,02	36,1 ± 0,03	35,6 ± 0,04
	100	97,6 ± 0,05	34,0 ± 0,04	33,5 ± 0,03	33,1 ± 0,06
ДНК-Na-Fe DNA-Na-Fe	1000	92,0 ± 0,03	57,4 ± 0,03	55,3 ± 0,05	53,7 ± 0,05
	500	97,5 ± 0,04	44,2 ± 0,05	43,0 ± 0,04	37,3 ± 0,03
	250	98,4 ± 0,08	41,5 ± 0,06	39,8 ± 0,02	33,3 ± 0,06
	100	99,5 ± 0,02	40,7 ± 0,04	39,4 ± 0,05	32,9 ± 0,07
Ретровир Retrovir	2,5	84,0 ± 0,03	Н.и. / N.i.	26,8 ± 0,05	Н.и. / N.i.
	0,3	91,5 ± 0,05	Н.и. / N.i.	23,1 ± 0,04	Н.и. / N.i.
Криксиван Crixivan	2,5	80,2 ± 0,06	Н.и. / N.i.	27,7 ± 0,06	Н.и. / N.i.
	0,6	85,7 ± 0,04	Н.и. / N.i.	23,7 ± 0,02	Н.и. / N.i.

Примечание. Н.и. – не исследовали. *По отношению к интактному контролю клеток. **Показатель защиты действия препарата от вируса, выраженный в %, ± стандартное отклонение (по формуле Рида–Менча).

Note. N.i. – not investigated. *In relation to intact cell control. **The indicator of drug-induced protection from the virus, expressed in %, ± standard deviation (according to the Reed–Mench formula).

 

С целью изучения механизма противовирусного действия препаратов исследовали секрецию цитокинов клетками МТ-4 после обработки ДНК-Na-Fe.

После инкубации с препаратом методом ИФА обнаружены провоспалительные цитокины – интерлейкин (ИЛ) 1β (70 ± 0,014 пкг/мл), ИЛ-2 (2 ± 0,012 пкг/мл), ИЛ-6 (6 ± 0,017 пкг/мл), ИЛ-18 (11 ± 0,021 пкг/мл), интерферон (ИФН) α (37 ± 0,009 пкг/мл), ИФН-γ (24 ± 0,017 пкг/мл) и противовоспалительные цитокины – ИЛ-4 (2 ± 0,012 пкг/мл), ИЛ-10 (34 ± 0,011 пкг/мл), антагонист рецептора ИЛ-1 (12 ± 0,016 пкг/мл). В культуральной жидкости клеток, не обработанных препаратом, цитокины не обнаружены.

Исследование вирулицидной активности препаратов (табл. 4) показало наличие определенного эффекта в случае всех пяти вирусов при исследовании в суспензионном тесте in vitro при концентрации 1000 мкг/мл в пределах 1,0–3,0 lg ТЦИД₅₀. Наибольшая вирусная редукция обнаружена в случае коронавируса при времени обеззараживания 60 мин – 3,0 lg ТЦИД₅₀.

 

Таблица 4. Исследование вирулицидной активности препаратов в концентрации 1000 мкг/мл в отношении аденовируса, полиовируса, коронавируса, вируса иммунодефицита человека, вируса простого герпеса в суспензионном опыте (смешивание вируса и средства 1 : 9) in vitro

Table 4. Study of the virucidal activity of drugs in concentration 1000 µg/ml against adenovirus, poliovirus, coronavirus, human immunodeficiency virus, herpes simplex virus in suspension (virus and agent mixed 1 : 9) in vitro

Препарат Agent	Время обеззараживания, мин Decontamination time, min	Степень ингибирования, lg ТЦИД50* Degree of inhibition, lg TCID50*
		аденовирус Adenovirus	полиовирус Poliovirus	коронавирус Coronavirus	ВИЧ-1 HIV-1	ВПГ-1 HSV-1
ДНК-Na DNA-Na	60	1,3 ± 0,04	1,6 ± 0,06	3,0 ± 0,03	1,3 ± 0,06	2,0 ± 0,03
	15	1,0 ± 0,05	1,0 ± 0,05	2,0 ± 0,06	1,0 ± 0,04	1,7 ± 0,06
ДНК-Na-Fe DNA-Na-Fe	60	2,0 ± 0,05	2,3 ± 0,04	2,0 ± 0,04	1,0 ± 0,06	1,7 ± 0,04
	15	1,5 ± 0,03	2,0 ± 0,03	1,9 ± 0,05	1,0 ± 0,05	1,7 ± 0,05

Примечание. *Степень ингибирования вируса, выраженная в lg ТЦИД₅₀, ± стандартное отклонение (по формуле Рида–Менча).

Note. *The degree of inhibition of the virus, expressed in lg TCID₅₀, ± standard deviation (according to the Reed–Mench formula).

 

При уменьшении концентрации препаратов до 500 мкг/мл уровень редукции коронавируса оставался на прежнем уровне, но снижался при уменьшении концентрации до 250 мкг/мл или уменьшении времени обеззараживания до 15 мин (табл. 5). В случае применения способа обеззараживания методом протирания отмечено снижение исходного титра вируса на 4,0–5,0 lg ТЦИД₅₀. Согласно нормативным документам (Р 4.2.3676-20), снижение титра тест-вируса на 4,0 lg ТЦИД₅₀ и более позволяет считать средство обладающим вирулицидной активностью [9].

 

Таблица 5. Исследование вирулицидной активности препаратов при обработке тест-объектов, инфицированных коронавирусом

Table 5. Study of the virucidal activity of drugs in the treatment of test objects infected with coronavirus

Препарат Agent	Концентрация, мкг/мл Concentration, µg/ml	Способ применения Method of application
		смешивание вируса и средства 1 : 9 in vitro Virus and agent mixed 1 : 9 in vitro		протирание искусственной кожи Wiping an artificial leather
		время обеззараживания, мин decontamination time, min	степень ингибирования, lg ТЦИД50 degree of inhibition, lg TCID50	время обеззараживания, мин decontamination time, min	степень ингибирования, lg ТЦИД50* degree of inhibition, lg TCID50*
ДНК-Na DNA-Na	500	60	3,0 ± 0,03	15	5,0 ± 0,02
	250		2,3 ± 0,02		5,0 ± 0,05
	500	15	1,9 ± 0,06	5	4,3 ± 0,03
	250		1,9 ± 0,04		4,0 ± 0,04
ДНК-Na-Fe DNA-Na-Fe	500	60	3,0 ± 0,06	15	5,0 ± 0,05
	250		2,1 ± 0,04		5,0 ± 0,02
	500	15	2,3 ± 0,02	5	5,0 ± 0,03
	250		2,0 ± 0,03		4,0 ± 0,05

Примечание. *Степень ингибирования вируса, выраженная в lg ТЦИД₅₀, ± стандартное отклонение (по формуле Рида–Менча).

Note. *The degree of inhibition of the virus, expressed in lg TCID₅₀, ± standard deviation (according to the Reed–Mench formula).

 

Обсуждение

Более 80% всех инфекционных заболеваний человека приходится на вирусные инфекции, многие из которых носят эпидемический характер. Поэтому человечество всегда стремилось воздействовать на болезнетворного возбудителя, даже не зная его природу.

Принципиально способы воздействия веществ на вирусы можно условно разделить на действие вне клетки и внутри клетки. Препараты, действующие на вирус вне клетки, называют вирулицидными, а действующие внутри клетки, – противовирусными. Средства, обладающие одновременно и противовирусной, и вирулицидной активностью, естественно, представляют особый интерес.

В качестве объекта исследования были выбраны препараты ДНК-Na и ДНК-Na-Fe, ранее показавшие свою эффективность в отношении РНК- и ДНК-содержащих вирусов [3, 4].

Обнаружена противовирусная активность ДНК-Na и ДНК-Na-Fe в отношении аденовируса. Полученные результаты позволяют отметить, что степень защиты при воздействии ДНК-Na колебалась в пределах 25–40%. При этом наблюдалась зависимость эффективности от дозы и времени применения средства. Несмотря на небольшой разброс данных, можно отметить, что профилактическое применение за 1–2 ч до заражения было эффективнее, чем одновременное введение препарата с инфицированием клеток.

Однако в отношении полиовируса антивирусный эффект ДНК-Na и ДНК-Na-Fe не был обнаружен ни в одной из схем введения.

В цикле репродукции коронавируса есть этапы, связанные с функционированием фермента вируса полимеразы и использованием вирусом протеаз клетки TMPRSS2 и 3CLpro. Поэтому китайские специалисты, первые столкнувшиеся с эпидемией, попробовали применить различные ингибиторы вирусных ферментов [10]. В частности, было предложено использовать средства, которые применяют при лечении ВИЧ-инфекции, – препараты, ингибирующие ферменты ВИЧ.

В связи с этим нами были использованы в качестве референс-препаратов антиретровирусные средства ретровир и криксиван. Полученные результаты показали незначительную активность данных средств, что свидетельствует не в пользу их перспективности для ингибирования коронавируса.

Напротив, исследованные препараты ДНК-Na и ДНК-Na-Fe, созданные на основе двухспиральной ДНК природного происхождения, обладают противовирусной активностью в отношении представителя семейства Coronaviridae – вируса трансмиссивного гастроэнтерита. ДНК-Na-Fe более эффективен, чем ДНК-Na. В отличие от аденовируса, не наблюдается разницы в применении средства за 2 или 1 ч до инфицирования, одновременно или на 1 ч позднее. Следует отметить, что и при внесении препарата через 1 ч после инфекции сохранялась противовирусная активность.

Исследование вирулицидной активности препаратов на модели РНК- и ДНК-содержащих вирусов, оболочечных и безоболочечных, выявило вирулицидную активность препаратов. Наблюдается ингибирование инфекционности на 1–2 lg ТЦИД₅₀. Наиболее чувствительным к действию препаратов оказался коронавирус. Речь идет о тесте in vitro. При обработке поверхности, контаминированной вирусом, степень ингибирования достигала 4–5 lg ТЦИД₅₀, что говорит о вирулицидной активности препаратов.

Данные вирусы принадлежат к разным вирусным семействам: Coronaviridae, Adenoviridae, Picornaviridae, и по классификации Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV) общий у них только один раздел – группа. По остальным градациям – надцарство (realm), царство, (kingdom), тип, класс, порядок и семейство – они не совпадают.

Ключевым параметром для разделения вирусов на таксоны является тип их генетического материала – нуклеиновая кислота (НК): РНК- и ДНК-содержащие вирусы. Другая важная характеристика – наличие липидной оболочки у вириона, а также количество цепочек (нитей) НК.

Два из исследованных на наличие противовирусной активности вирусов являются однонитчатыми РНК-содержащими – вирус полиомиелита и коронавирус. Аденовирус – ДНК-содержащий вирус с двумя цепями НК. Полио- и аденовирус объединяет отсутствие липидной оболочки у вирусной частицы. Самый мелкий из них – полиовирус – 25–30 нм. Коронавирус и аденовирус крупнее – 70–90 и 120–160 нм соответственно.

Ранее нами была установлена противовирусная активность ДНК-Na-Fe в отношении ВИЧ, ВПГ, цитомегаловируса, вирусов гриппа человека и птиц, вируса японского энцефалита [3, 4]. Однако не было обнаружено ингибирования репродукции вируса энцефаломиокардита мышей, который так же, как и полиовирус, является мелким безоболочечным вирусом из семейства Picornaviridae (табл. 6).

 

Таблица 6. Противовирусная активность комплекса дезоксирибонуклеата натрия с железом в отношении вирусов разных семейств

Table 6. Antiviral activity of the complex of sodium deoxyribonucleate with iron against viruses of different families

Вирус Virus	Строение вириона Virion structure	Наличие оболочки The presence of the envelope	Размер вириона, нм Virion size, nm	Противовирусная активность* Antiviral activity*
Вирус герпеса простого Herpes simplex virus	Сферическая форма, линейная ДНК (2 цепочки) Spherical shape, linear DNA (double-stranded)	Оболочка липопротеидная Lipoprotein envelope	120–200	Есть Yes
Цитомегаловирус Cytomegalovirus	Сферическая форма, линейная ДНК (2 цепочки) Spherical shape, linear DNA (double-stranded)	Оболочка липопротеидная Lipoprotein envelope	120–200	Есть Yes
Вирус гриппа Influenza virus	Сферическая форма, РНК (1 цепочка), минус-нить, сегментированный Spherical shape, RNA (single-stranded), minus-strand, segmented	Оболочка липопротеидная Lipoprotein envelope	100	Есть Yes
Вирус японского энцефалита Japanese encephalitis virus	РНК (1 цепочка), плюс-нить, несегментированный RNA (single-stranded), plus-strand, unsegmented	Оболочка липопротеидная Lipoprotein envelope	40–70	Есть Yes
Вирус иммунодефицита человека Human immunodeficiency virus	Сферическая форма, 2 молекулы РНК (1 цепочка), плюс-нить, обратная транскрипция Spherical shape, 2 RNA molecules (single-stranded), plus-strand, reverse transcription	Оболочка липопротеидная Lipoprotein envelope	80–120	Есть Yes
Вирус энцефаломиокардита Encephalomyocarditis virus	Икосаэдрическая форма, РНК (1 цепочка), плюс-нить, несегментированный Icosahedral shape, RNA (single-stranded), plus-strand unsegmented	Нет оболочки No envelope	30	Нет No
Аденовирус Adenovirus	Икосаэдрическая форма, линейная ДНК (2 цепочки) Icosahedral shape, linear DNA (double-stranded)	Нет оболочки No envelope	70–90	Есть Yes
Полиовирус Poliovirus	Сферическая форма, РНК (1 цепочка), плюс-нить Spherical shape, RNA (single-stranded), plus-strand	Нет оболочки No envelope	25–30	Нет No
Коронавирус Coronavirus	Сферическая форма, РНК (1 цепочка), плюс-нить Spherical shape, RNA (single-stranded), plus-strand	Оболочка липопротеидная Lipoprotein envelope	120–160	Есть Yes

 

Пока остаётся неясным, почему исследуемые препараты избирательно не обладают противовирусным действием в отношении вируса полиомиелита и вируса энцефаломиокардита мышей, относящихся к семейству Picornaviridae. При этом их вирулицидное действие такое же, как и на другие исследуемые вирусы. Сам факт заслуживает дальнейшего внимания и исследования.

В поисках механизма противовирусного действия ДНК-Na ранее мы обнаружили индукцию в клетках продуктов амплификации ИЛ-1α, фактора некроза опухоли-α и β, а также низкомолекулярных факторов (< 3 кДа) в ответ на воздействие ДНК-Na-Fe [11]. В настоящем исследовании установили секрецию цитокинов: провоспалительных – ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-18, ИФН-α и -γ и противовоспалительных – ИЛ-4, ИЛ-10, антагониста рецептора ИЛ-1.

Секреция цитокинов также обнаружена A.M. Harandi и соавт. [12] при применении синтетических ДНК-олигонуклеотидов с высоким содержанием CpG (CpG – сокращение для цитозина и гуанина, разделённых фосфатом, связывающим эти два нуклеотида в структуре ДНК) для защиты от ВПГ-2 при вагинальной герпесвирусной инфекции у мышей. Авторы объясняют 80% защиту животных от смертельной инфекции именно продукцией ИФН-γ, ИЛ-12, ИЛ-18 и хемокина RANTES клетками слизистой половых путей мышей под воздействием ДНК-олигонуклеотидов.

Наличие в клетках Toll-подобных рецепторов (TLR), и в особенности TLR9, указывает на возможность лиганд-рецепторного взаимодействия TLR9 [13, 14] и ДНК-Na. В основе этого взаимодействия лежит сложный сигнальный путь, в конечном счёте приводящий к активации нескольких транскрипционных факторов, включая NF-κB, АР-1, IRF-7, что, в свою очередь, активирует продукцию провоспалительных цитокинов [5, 15].

При изучении иммуномодулирующей активности ДНК-Na-Fe в системе in vitro при использовании в качестве модели неопластической клеточной линии МТ-4, представляющей собой CD4⁺ Т-лимфоциты человека, трансформированные Т-лимфотропным вирусом человека 1-го типа, обнаружено снижение количества клеток, содержащих такие маркеры активации, как CD28, CD38, CD62L, CD69 и HLA-DR [16].

Белок СD62L, известный также как L-селектин, участвует в инфильтрации активированных T-лимфоцитов в различные органы и ткани, где с их участием возможно развитие многих биологических процессов, в том числе и патологических. Вероятно, благодаря такому действию ДНК-Na-Fe снижается распространение клеток, содержащих интегрированный патогенетический материал, по органам и тканям, что приводит к замедлению генерализации инфекционного процесса. В то же время ДНК-Na-Fe не влиял на экспрессию интегринов β1 (CD29), α4 (CD49d) и рецептора интегринов ICAM-1 (CD54) [17].

Очевидно, что ДНК-Na и ДНК-Na-Fe обладают противовирусным эффектом, однако механизм действия, по-видимому, не связан со специфическим воздействием на репликацию вирусов. Также оба препарата обладают иммуномодулирующим действием и способны снижать активацию клеток. Это свойство может быть особенно полезно при лечении цитокинового шторма, характерного для COVID-19, а также нормализации иммунного ответа при ВИЧ-инфекции. Снижение уровня активации клеток иммунной системы к тому же снижает риск развития оппортунистических инфекций.

Исследование непосредственного действия (вне клетки) ДНК-Na и ДНК-Na-Fe на все исследованные вирусы (полиовирус, аденовирус, коронавирус, ВИЧ-1, ВПГ-1) показало наличие определённого вирулицидного эффекта. Особенно это интересно в случае вируса полиомиелита, у которого не обнаружен противовирусный эффект.

Таким образом, можно предположить, что при непосредственном контакте как ДНК-Na, так и ДНК-Na-Fe и вируса происходит некое воздействие на вирионы, приводящее к снижению их инфекционной активности.

Подобный вирулицидный эффект обнаружен в отношении ВПГ при использовании олигонуклеотида ISIS 5652 в микромолярных количествах (1–2 мкМ) при 37 °C [18]. Авторы предполагают, что GT-олигонуклеотид индуцирует конформационные изменения в гликопротеине В ВПГ, который играет важную роль в прикреплении вируса к клетке и проникновении в неё. Отмечено исчезновение вирулицидного эффекта при 4 °C.

Следует отметить, что вирулицидный эффект в 2–3 lg ТЦИД₅₀ на практике означает снижение урожая вируса в 100–1000 раз.

Наличие у ДНК-Na и ДНК-Na-Fe одновременно и противовирусной, и вирулицидной активности в отношении адено- и коронавирусов позволяет рассчитывать на их перспективность в профилактическом и лечебном применении. Нанесённый на слизистые оболочки препарат будет воздействовать на разные стадии вирусного цикла, начиная с этапа их прикрепления к клеткам организма-хозяина.

Помимо корона- и аденовирусов, препараты ДНК-Na и ДНК-Na-Fe обладают, как нами было показано ранее, противовирусным действием в отношении вирусов гриппа человека и птиц [3, 4]. Поэтому можно предположить, что данные средства будут эффективны в отношении всех основных возбудителей ОРВИ.

Участие авторов. Все авторы сделали равный вклад в подготовку публикации.

Финансирование. Исследование выполнено за счет государственного бюджета.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Dmitry N. Nosik

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Email: dnnosik@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5757-5671

Professor, Head of the Laboratory of Antiviral and disinfectants

Russian Federation, 123098, Moscow

Lyudmila B. Kalnina

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Email: klb3@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2702-8578

candidate biological sciences, Leading Researcher of the Laboratory antiviral and disinfectants

Russian Federation, 123098, Moscow

Olga A. Lobach

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Email: victoriola@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9351-6433

candidate biological sciences, Senior Researcher of the Laboratory antiviral and disinfectants

Russian Federation, 123098, Moscow

Marina S. Chataeva

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Email: mschat@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5379-2406

researcher of the laboratory antiviral and disinfectants

Russian Federation, 123098, Moscow

Elena V. Berezhnaya

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Email: elvenel@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1551-718X

junior researcher of the laboratory antiviral and disinfectants

Russian Federation, 123098, Moscow

Marina S. Bochkova

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Email: bochkovams1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9295-8379

candidate biological sciences, Leading Researcher of the Laboratory antiviral and disinfectants

Russian Federation, 123098, Moscow

Irina A. Kiseleva

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Email: iakiseleva@ya.ru
ORCID iD: 0000-0003-3693-6081

candidate biological sciences, Leading Researcher of the Laboratory antiviral and disinfectants

Russian Federation, 123098, Moscow

Lyudmila M. Selimova

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Email: lselim@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3709-770X

doctor Biological Sciences, Associate Professor, Leading Researcher of the Laboratory antiviral and disinfectants

Russian Federation, 123098, Moscow

Nikolai N. Nosik

D.I. Ivanovsky Institute of Virology of National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Author for correspondence.
Email: nosiknn@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1943-6536

Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Laboratory of Virus Ontogeny

Russian Federation, 123098, Moscow

References

Supplementary files