Email this article Antigenic and immunogenic activity of virus-like particles based on rabbit hemorrhagic disease virus (Caliciviridae: Lagovirus) genotypes GI1 and GI2 recombinant major capsid proteins
- Authors: Mukhin A.N.1, Alekseev K.P.1, Yuzhakov A.G.2, Selezneva E.V.1, Moskvina A.S.3, Verkhovsky O.A.3, Aliper T.I.1
-
Affiliations:
- Vetbiochem LLC
- Federal Scientific Center – All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after K.I. Scriabin and Ya.R. Kovalenko of the Russian Academy of Sciences
- Research Institute for Diagnosis and Prevention of Human and Animal Diseases
- Issue: Vol 68, No 2 (2023)
- Pages: 132-141
- Section: ORIGINAL RESEARCH
- Submitted: 03.03.2023
- Published: 18.05.2023
- URL: https://virusjour.crie.ru/jour/article/view/6315
- DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-164
- EDN: https://elibrary.ru/rswvjz
- ID: 6315
Cite item
Full Text
Abstract
Introduction. Rabbit hemorrhagic disease is an acute highly contagious infection associated with two genotypes of pathogenic Lagovirus. Antibodies to major capsid protein (Vp60) are protective.
The aim of the work ‒ is an evaluation of antigenic and immunogenic activity of virus-like particles (VLPs) based on recombinant major capsid proteins of both genotypes of rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) (recVP60-GI1 and recVP60-GI2).
Materials and methods. Baculovirus-expressed VLPs were evaluated using electron microscopy and administered to clinically healthy 1.5–3 month old rabbits in a dose of 50 µg. Rabbits were challenged with 103 LD50 of virulent strains “Voronezhsky-87” and “Tula” 21 days post immunization. Serum samples were tested for the presence of RHDV-specific antibodies.
Results. VLPs with hemagglutination activity forming VLP 30–40 nm in size were obtained in Hi-5 cell culture. Specific antibody titers in rabbits measured by ELISA were 1 : 200 to 1 : 800 on 21th day post immunization with VLPs. Immunogenic activity of recVP60-GI1 VLPs was 90 and 40%, while it was 30 and 100% for recVP60-GI2 VLPs after the challenge with RHDV genotypes 1 and 2 respectively. The immunogenicity of two VLPs in mixture reached 100%.
Discussion. VLPs possess hemagglutinating, antigenic and immunogenic activity, suggesting their use as components in substances designed for RHDV specific prophylaxis in rabbits. Results of the control challenge experiment demonstrated the need to include the antigens from both RHDV genotypes in the vaccine.
Conclusion. Recombinant proteins recVP60-GI1 and recVP60-GI2 form VLPs that possess hemagglutinating an antigenic activity, and provide 90–100% level of protection for animals challenged with RHDV GI1 and GI2 virulent strains.
Full Text
Введение
Вирусная геморрагическая болезнь кроликов (ВГБК) – остро протекающая высококонтагиозная болезнь, характеризующаяся явлениями геморрагического диатеза во всех органах, в особенности в лёгких и печени, возбудителями которой являются вирусы, относящиеся к семейству Caliciviridae, роду Lagovirus. ВГБК является одной из причин, наносящих высокий экономический ущерб кролиководству во всём мире, и эндемичной в Восточной Азии и Европе болезнью [1–7].
В настоящее время выделяют 4 геногруппы лаговирусов: две патогенные – GI1 (GI1а–GI1d) и GI2 и две непатогенные – GI3 и GI4 [8]. Оба патогенных варианта вируса ГБК встречаются на территории РФ [9–11].
Геном вируса представлен линейной молекулой РНК положительной полярности, состоящей из 7437 н.о. Вирусный капсид состоит из главного структурного белка VP60, кодируемого последовательностью нуклеотидов открытой рамки считывания 1 (ORF-1), и минорного белка VP-2.
Единственным методом специфической профилактики болезни является вакцинация кроликов с применением инактивированных тканевых или рекомбинантных вакцин. Вакцинация вызывает у кроликов образование антител к главному капсидному белку (Vp60), которые являются протективными. Несмотря на близкое антигенное родство вирусов, полноценная перекрёстная защита отсутствует, поэтому вакцина должна содержать капсидный антиген вирусов обоих генотипов [12, 13].
Несмотря на то что получение рекомбинантных главных капсидных белков вирусов ГБК и определение их иммуногенной активности были показаны рядом авторов [7, 14–18], коммерчески доступных вакцин на их основе, применяемых на территории РФ, не существует.
Целью данного исследования является оценка антигенной и иммуногенной активности вирусоподобных частиц (ВпЧ) на основе рекомбинантных главных капсидных белков вирусов ГБК геногрупп GI1 и GI2 (recVP60-GI1 и recVP60-GI2).
Материалы и методы
Вирусы
В работе использовали:
– 10% суспензию печени кролика, заражённого штаммом «Воронежский-87» вируса ГБК , относящегося к геногруппе GI1, с активностью в реакции гемагглютинации 1 : 2048 (104 ЛД50/см3);
– 10% суспензию печени кролика, заражённого штаммом «Тула» вируса ГБК, относящегося к геногруппе GI2, с активностью в реакции гемагглютинации 1 : 2048 (104 ЛД50/см3).
Получение рекомбинантных вирусов ядерного полиэдроза калифорнийской совки Autographa californica (AcNPV) со вставкой ORF-1 вируса ГБК генотипов GI1 и GI2
Конструирование векторов, получение рекомбинантных бакуловирусов AcORF-1-GI1 и AcORF-1-GI2, оценку и наработку продуктов осуществляли, как описано в предыдущей работе [19].
Фрагмент нуклеотидной последовательности гена ORF-1 вируса ГБК геногруппы GI1:
GGATCCATGCATCACCATCACCATCATGGTTCCGGATCTGGCAGTGGTTCAGGATCTGGTGGCAAGGCTAGAGCAGCTCCCCAAGGTGAGACTGCTGGCACCGCTACCACTGCTTCCGTACCTGGAACCACAACTGACGGTATGGACCCAGGTGTGGTTGCTACAACCTCCGTGATCACTGCTGAGAACTCTTCAGCATCCATCGCTACCGCTGGTATCGGTGGACCACCTCAGCAGGTGGACCAACAGGAGACCTGGAGGACCAACTTCTACTACAACGACGTGTTCACCTGGTCTGTGGCTGACGCTCCTGGTTCCATCCTGTACACTGTCCAGCACTCTCCACAGAACAATCCCTTCACCGCTGTGTTGTCCCAGATGTATGCTGGTTGGGCAGGAGGCATGCAGTTTCGCTTCATCGTGGCTGGTAGTGGTGTGTTCGGAGGTCGTCTGGTTGCAGCTGTGATTCCTCCAGGTATCGAGATTGGTCCAGGTCTGGAGGTGCGTCAGTTCCCACACGTCGTGATCGACGCTCGTAGCTTGGAGCCTGTGACCATCACCATGCCAGACCTGCGTCCCAACATGTACCATCCCACTGGTGACCCCGGTCTCGTTCCCACCTTGGTGCTGTCCGTGTACAACAACCTGATCAATCCCTTTGGAGGTTCCACCTCTGCCATCCAGGTGACCGTGGAGACACGTCCCTCCGAGGACTTCGAGTTCGTGATGATCCGTGCTCCCAGCTCCAAGACTGTGGACTCCATCTCTCCTGCTGGTCTCCTGACCACACCTGTGCTGACCGGTGTTGGAAACGACAACCGTTGGAACGGTCAGATCGTTGGTCTGCAACCAGTTCCAGGTGGCTTCTCCACCTGCAACCGTCACTGGAACCTGAATGGATCCACCTATGGTTGGAGCTCACCACGCTTCGCTGACATCGACCATCGTAGAGGTTCTGCTAGCTATCCTGGCAACAATGCAACCAACGTGCTGCAGTTCTGGTACGCTAACGCTGGTTCAGCTATCGACAATCCCATCTCCCAGGTGGCTCCTGACGGATTTCCAGACATGTCCTTCGTTCCCTTCAATGGTCCTGGCATTCCTGCTGCAGGTTGGGTTGGATTTGGTGCCATCTGGAACTCCAACTCTGGTGCTCCCAACGTGACCACTGTGCAAGCCTACGAGCTTGGCTTTGCCACTGGTGCACCTGGCAACCTGCAACCCACTACCAACACCAGTGGTACCAACACCAGTGGTGCTCAGACTGTGGCCAAGTCCATCTACGCTGTTGTGACAGGTACTGCACAGAATCCAGCTGGACTCTTCGTGATGGCTTCTGGCATCATCTCCACCCCCAACGCTTCTGCTATCACCTACACCCCACAACCTGACCGCATCGTGACTACCCCTGGTACACCTGCAGCTGCACCTGTGGGCAAGAACACTCCCATCATGTTTGCATCCGTCGTGAGACGTACCGGTGACGTGAACGCTACCGCTGGATCAGCCAACGGTACTCAGTATGGTACAGGTTCCCAGCCCTTGCCTGTGACCATTGGTCTGTCCCTCAACAACTACTCATCTGCTCTGATGCCAGGTCAGTTCTTCGTGTGGCAGCTGACCTTCGCTTCTGGCTTCATGGAGATTGGTCTGTCCGTGGACGGCTACTTCTATGCAGGAACTGGTGCTTCCACTACCTTGATCGACCTGACCGAGCTGATCGACGTGAGACCAGTTGGTCCTCGTCCCTCCAAGAGCACTCTGGTGTTCAACCTGGGAGGTACAGCCAACGGCTTCTCCTACGTGTAAGCTT.
Фрагмент нуклеотидной последовательности гена ORF-1 вируса ГБК геногруппы GI2:
ATGCACCACCATCACCACCATGGTAAGGCTCGTGCTGCTCCACAAGGAGAGACTGCTGGTACTGCTACCACAGCTTCCGTTCCTGGCACCACTACAGATGGCATGGACCCAGGTGTGGTTGCTACAACCTCAGTCGTGACCACTGAGAACGCTTCCACCTCCATTGCTACCGCTGGTATCGGAGGTCCTCCACAGCAGGTGGACCAACAGGAGACTTGGCGTACCAACTTCTACTACAACGACGTGTTCACCTGGTCAGTTGCTGACGCTCCTGGTAACATCCTGTACACTGTGCAGCACTCTCCACAGAACAATCCCTTCACTGCTGTGCTGTCTCAGATGTATGCTGGATGGGCTGGTGGCATGCAGTTTCGCTTCATCGTTGCTGGTTCAGGTGTGTTTGGTGGACGTCTCGTGGCTGCTGTGATTCCTCCAGGCATCGAGATTGGACCTGGTCTGGAAGTGCGTCAGTTTCCTCACGTTGTGATCGATGCTCGCTCCTTGGAGCCCGTGACCATCACTATGCCCGACCTGCGTCCCAACATGTACCATCCCACTGGCAACCCTGGTCTGGTACCCACCTTGGTGTTGTCCGTGTACAACAACCTGATCAATCCCTTTGGTGGAAGCACCTCTGCTATCCAGGTGACCGTGGAGACCCGTCCCTCCGAGGACTTCGAGTTCGTGATGATTCGTGCTCCCAGCTCCAAGACCGTGGACTCCATCTCCCCTGCTGACCTCCTGACCACACCAGTGCTGACTGGAGTTGGAACCGACAACAGATGGAACGGTGAGATCGTTGGACTGCAACCAGTTCCAGGAGGTTTCTCCACCTGCAACCGTCACTGGAACCTGAATGGTTCCACCTTCGGATGGTCCTCTCCACGCTTCGCTGCTATCGACCACGATCGTGGCAATGCTTCCTTTCCTGGATCATCCAGCTCCAACGTGCTGGAGTTGTGGTATGCTTCAGCTGGTTCTGCTGCTGACAATCCCATCTCTCAGATTGCTCCAGATGGCTTTCCTGACATGTCCTTCGTACCCTTCTCAGGTGCAACCATTCCCACTGCTGGCTGGGTTGGCTTTGGAGGTATCTGGAACAGCAACAACGGTGCTCCCTTCGTGACCACCGTGCAGGCTTACGAACTGGGATTCGCTACCGGAGCTCCCTCCAATCCTCAACCCACTACCACAACCTCTGGTGCTCAGATCGTAGCTAAGTCCATCTATGGTGTGGCTAACGGTATCAACCAGACCACTGCTGGTCTGTTCGTGATGGCTTCAGGTGTGATCAGCACACCCAACTCCTCCGCTATCACCTACACTCCTCAACCTAACCGTATCGTGAACGCTCCAGGCACACCTGCTGCAGCTCCCATTGGTAAGAACACACCCATCATGTTCGCTTCCGTGGTTCGTCGCACTGGAGACATCAACGCTGAAGCTGGTTCCACCAACGGAACTCAGTATGGTGCTGGATCCCAACCATTGCCTGTCACTGTGGGACTGTCCCTGAACAACTACTCATCTGCTCTGATGCCAGGTCAGTTCTTCGTGTGGCAGCTGAACTTTGCTTCCGGTTTCATGGAACTCGGTCTGTCCGTGGATGGCTACTTCTATGCTGGTACTGGAGCTTCAGCTACCTTGATCGACCTGTCTGAGCTGGTGGACATTCGTCCTGTTGGTCCACGTCCCTCCACCTCCACCTTGGTCTACAACCTCGGAGGCACTACCAACGGATTCTCCTACGTGTAA.
Определение гемагглютинирующей активности recVP60-GI1 и recVP60-GI2
Реакцию гемагглютинации ставили с 0,75% суспензией эритроцитов человека группы О (I группы) в 0,15 М фосфатно-буферного раствора (ФБР) рН 7,2 микрометодом на полистироловых планшетах с U-образным дном по общепринятой методике. В качестве положительного контроля использовали 10% суспензию печени кролика, заражённого штаммом вируса ГБК «Воронежский-87», и 10% суспензию печени кролика, заражённого штаммом вируса ГБК «Тула». В качестве отрицательного контроля использовали 10% печень от заведомо здорового кролика и лизат культуры клеток Hi-5, инфицированные AcNPV без вставки. За титр принимали максимальное разведение АГ, дающее гемагглютинацию.
Электронная микроскопия
На электронно-микроскопическую медную сетку, покрытую парлодиевой плёнкой, наносили 5 мкл раствора смеси 1 : 1 очищенных recVP60-GI1 и recVP60-GI2 в концентрации 10 мг/мл по общему белку в 0,15 М ФБР (рН 7,2), отмывали водой от несвязавшихся компонентов и окрашивали 1% водным раствором уранилацетата (рН 4,5). Образцы просматривали с помощью электронного микроскопа просвечивающего типа НТ7700 (Hitachi, Япония).
Определение антигенной активности
Антигенную активность ВпЧ на основе рекомбинантных белков исследовали на клинически здоровых кроликах возраста 1,5–3,0 месяца. В исследовании использовали 4 группы животных по 20 голов в каждой. Первой группе животных внутримышечно вводили recVP60-GI1 в дозе 50 мкг, 2-й группе – recVP60-GI2 в дозе 50 мкг, 3-й группе – смесь 25 мкг recVP60-GI1 и 25 мкг recVP60-GI2, а животных 4-й группы не вакцинировали. Сыворотки крови кроликов, взятые до иммунизации и на 21-й день после неё, исследовали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с целью выявления специфических антител к вирусу ГБК. ИФА ставили, как описано в работе [20].
Определение иммуногенной активности
На 21-е сутки после иммунизации кроликов заражали вирулентными штаммами «Воронежский-87» вируса ГБК генотипа GI1 (50% животных) и «Тула» вируса ГБК генотипа GI2 (50% животных) в дозе 103 ЛД50. Наблюдение за животными проводили в течение 7 дней после заражения: отмечали гибель и появление клинических признаков. От погибших животных отбирали печень, сердце, селезёнку, лёгкие и почки для исследования с помощью ПЦР-РВ (полимеразная цепная реакция в реальном времени) с целью обнаружения РНК вируса ГБК. На 7-е сутки все выжившие животные были подвергнуты эвтаназии, пробы паталогического материала также исследовали с применением ПЦР-РВ.
Иммуногенную активность recVP60 для кроликов вычисляли по формуле (1):
ИА = (ЛК – ЛИ) / ЛК × 100%, (1)
где ИА – иммуногенная активность; ЛК – летальность в контрольной группе (%); ЛИ – летальность среди иммунизированных животных (%).
ПЦР-РВ
Для выделения тотальной РНК готовили 10% суспензии из образцов печени кроликов, полученные путём гомогенизации проб в стерильном ФБР и далее подвергшиеся центрифугированию при 13 200 об/мин в течение 5 мин. Суммарную РНК экстрагировали из каждой ткани кроликов с TRIzol (Invitrogen) согласно протоколу производителя. Наличие РНК вируса ГБК определяли методом ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией) с использованием универсальной пары праймеров, разработанных M. Pawlikowska и соавт. [21]. Для дифференциации вирусов второго генотипа использовали ОТ-ПЦР в РВ, описанную у K.P. Dalton и соавт. [22]. ОТ-ПЦР проводили с помощью набора One-tube real-time RT-PCR kit («Альфа Фермент», Россия).
Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus author guidelines for animal use (IAVES July, 23, 2010). Протокол исследования одобрен этическим комитетом ООО «Ветбиохим» (протокол № 1 от 13.11.2020).
Результаты
В результате проведённых работ были получены рекомбинантные вирусы ядерного полиэдроза калифорнийской совки Autographa californica (AcNPV) со вставкой ORF-1 вируса ГБК генотипа GI1 (AcORF-1-GI1) и генотипа GI2 (AcORF-1-GI2).
При заражении культуры клеток Sf-9 рекомбинантными бакуловирусами на 3–4-е сутки после заражения отмечали цитопатические изменения в инфицированных культурах. Титрование полученных вируссодержащих суспензий методом бляшкообразования показало наличие рекомбинантных бакуловирусов AcORF-1-GI1 и AcORF-1-GI2 в титрах – 105,0–105,5 БОЕ50/см3.
При заражении культуры клеток Нi-5 рекомбинантными бакуловирусами со множественностью 0,1 БОЕ50/клетка отмечали экспрессию recVP60-GI1 и recVP60-GI2. После очистки 1 г клеточных осадков было получено 5 мл препарата recVP60-GI1 с концентрацией общего белка 20 мг/мл и 4 мл препарата recVP60-GI2 с концентрацией общего белка 18 мг/мл.
Гемагглютинирующая активность очищенных препаратов recVP60-GI1 и recVP60-GI2 с концентрацией 50 мкг/мл в ФБР составила 1 : 32 000.
В 0,15 М ФБР с рН 7,2–7,4 рекомбинантные белки образовывали ВпЧ. В растворах recVP60-GI1, recVP60-GI2 и их смеси 1 : 1 с концентрацией по общему белку 10 мг/мл при проведении электронной микроскопии наблюдали ВпЧ размером 30–40 нм (рисунок).
Рис. Электронно-микроскопическое изображение вирусоподбных частиц recVP60. Fig. Transmission electron microscopy images of recVP60 virus-like particles.
До вакцинации животные были серонегативны в отношении вируса ГБК: уровень антител в ИФА составил < 1 : 200 (1 : 200 – минимальное разведение сыворотки, используемое в тест-системе ИФА).
На 21-е сутки после однократного введения ВпЧ с содержанием 50 мкг рекомбинантных капсидных белков у всех иммунизированных кроликов наблюдался синтез специфических антител к главным капсидным белкам вируса ГБК. Уровень антител составил 1 : 200–1 : 800, у кроликов контрольной группы сероконверсии не наблюдалось (табл. 1, 2).
Таблица 1. Результаты контрольного заражения кроликов вирулентным штаммом вируса геморрагической болезни кроликов GI1
Table 1. Results of the challenge experiment with virulent rabbit hemorrhagic disease virus GI1
Группа Group | № животного Animal No. | Титр антител в ИФА Antibody titer in ELISA | Результаты ПЦР PCR results | Результат контрольного заражения 103 ЛД50 «Воронежский-87» Results of challenge with 103 LD50 of “Voronegsky-87” strain | |
Вирусоподобные частицы Virus-like particles Rec VP60-GI.1 | 1 | 1 : 400 | – | жив | |
2 | 1 : 400 | – | жив | ||
3 | 1 : 800 | – | жив | ||
4 | 1 : 400 | – | жив | ||
5 | 1 : 200 | – | жив | ||
6 | 1 : 200 | + | пал | ||
7 | 1 : 400 | – | жив | ||
8 | 1 : 400 | – | жив | ||
9 | 1 : 800 | – | жив | ||
10 | 1 : 400 | – | жив | ||
Всего пало/выжило Total died/survived | 1 | 9 | |||
Летальность 10% Mortality 10% | Иммуногенная активность 90% Immunogenic activity 90% | ||||
Вирусоподобные частицы Virus-like particles Rec VP60-GI.2 | 1 | 1 : 400 | + | пал | |
2 | 1 : 400 | + | пал | ||
3 | 1 : 800 | + | пал | ||
4 | 1 : 200 | + | пал | ||
5 | 1 : 400 | – | жив | ||
6 | 1 : 200 | + | пал | ||
7 | 1 : 400 | + | пал | ||
8 | 1 : 400 | + | пал | ||
9 | 1 : 400 | – | жив | ||
10 | 1 : 800 | – | жив | ||
Всего пало/выжило Total died/survived | 7 | 3 | |||
Летальность 70% Mortality 70% | Иммуногенная активность 30% Immunogenic activity 30% | ||||
Вирусоподобные частицы Virus-like particles Rec VP60-GI.1 + Rec VP60-GI.2 | 1 | 1 : 800 | – | жив | |
2 | 1 : 800 | – | жив | ||
3 | 1 : 800 | – | жив | ||
4 | 1 : 200 | + | пал | ||
5 | 1 : 400 | – | жив | ||
6 | 1 : 200 | – | жив | ||
7 | 1 : 400 | – | жив | ||
8 | 1 : 400 | – | жив | ||
9 | 1 : 800 | – | жив | ||
10 | 1 : 400 | – | жив | ||
Всего пало/выжило Total died/survived | 1 | 9 | |||
Летальность 10% Mortality10% | Иммуногенная активность 90% Immunogenic activity 90% | ||||
Контрольная группа (не иммунизировали) Control group (non-immunized) | 1 | < 1 : 200 | + | + | пал |
2 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
3 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
4 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
5 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
6 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
7 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
8 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
9 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
10 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
Всего пало/выжило Total died/survived | 10 | 0 | |||
Летальность 100% Mortality 100% | |||||
Таблица 2. Результаты контрольного заражения кроликов вирулентным штаммом вируса геморрагической болезни кроликов GI2
Table 2. Results of the challenge experiment with virulent rabbit hemorrhagic disease virus GI2
Группа Group | № животного Animal No. | Титр антител в ИФА Antibody titer in ELISA | Результаты ПЦР PCR results | Результат контрольного заражения 103 ЛД50 «Тула» Results of challenge with 103 LD50 of «Tula» strain | |
Вирусоподобные частицы Virus-like particles Rec VP60-GI.1 | 1 | 1 : 400 | – | жив | |
2 | 1 : 400 | + | пал | ||
3 | 1 : 800 | – | жив | ||
4 | 1 : 400 | + | пал | ||
5 | 1 : 400 | – | жив | ||
6 | 1 : 200 | + | пал | ||
7 | 1 : 400 | + | пал | ||
8 | 1 : 200 | + | пал | ||
9 | 1 : 800 | – | жив | ||
10 | 1 : 400 | + | пал | ||
Всего пало/выжило Total died/survived | 6 | 4 | |||
Летальность 60% Mortality 60% | Иммуногенная активность 40% Immunogenic activity 40% | ||||
Вирусоподобные частицы Virus-like particles Rec VP60-GI.2 | 1 | 1 : 400 | – | жив | |
2 | 1 : 400 | – | жив | ||
3 | 1 : 800 | – | жив | ||
4 | 1 : 200 | – | жив | ||
5 | 1 : 400 | – | жив | ||
6 | 1 : 200 | – | жив | ||
7 | 1 : 400 | – | жив | ||
8 | 1 : 400 | – | жив | ||
9 | 1 : 400 | – | жив | ||
10 | 1 : 800 | – | жив | ||
Всего пало/выжило Total died/survived | 0 | 10 | |||
Летальность 0% Mortality 0% | Иммуногенная активность 100% Immunogenic activity 100% | ||||
Вирусоподобные частицы Virus-like particles Rec VP60-GI.1 + Rec VP60-GI.2 | 1 | 1 : 800 | – | жив | |
2 | 1 : 800 | – | жив | ||
3 | 1 : 800 | – | жив | ||
4 | 1 : 200 | – | жив | ||
5 | 1 : 400 | – | жив | ||
6 | 1 : 200 | – | жив | ||
7 | 1 : 400 | – | жив | ||
8 | 1 : 400 | – | жив | ||
9 | 1 : 800 | – | жив | ||
10 | 1 : 400 | – | жив | ||
Всего пало/выжило Total died/survived | 0 | 10 | |||
Летальность 0% Mortality 0% | Иммуногенная активность 100% Immunogenic activity 100% | ||||
Контрольная группа (не иммунизировали) Control group (non-immunized) | 1 | < 1 : 200 | + | + | пал |
2 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
3 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
4 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
5 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
6 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
7 | < 1 : 200 | – | – | жив | |
8 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
9 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
10 | < 1 : 200 | + | + | пал | |
Всего пало/выжило Total died/survived | 9 | 1 | |||
Летальность 90% Mortality 90% | |||||
После контрольного заражения вирулентным штаммом вируса ГБК 1-го генотипа «Воронежский-87» выжили 9 из 10 животных, иммунизированных recVP60-GI1 и смесью recVP60-GI1 и recVP60-GI2 (иммуногенная активность 90%, летальность 10%) Иммуногенная активность recVP60-GI2 составила 30%, т.е. из 10 иммунизированных кроликов выжило 3 (летальность 70%). При этом в контрольной группе отмечалась 100% летальность.
После контрольного заражения вирулентным штаммом вируса ГБК 2-го генотипа «Тула» выжили все животные, иммунизированные recVP60-GI2 и смесью recVP60-GI1 и recVP60-GI2 (иммуногенная активность 100%), иммуногенная активность recVP60-GI1 составила 40%. В контрольной группе отмечалась 90% летальность.
Гибель кроликов наступала в течение 12–72 ч после заражения. У всех погибших кроликов в образцах патологического материала из печени, сердца, селезенки, почек и лёгких методом ПЦР был обнаружен генетический материал вируса ГБК генотипа, соответствующего вирусу, использованному для контрольного заражения.
У всех выживших кроликов, подвергнутых эвтаназии на 7-е сутки после заражения, в образцах патологического материала из печени, сердца, селезёнки, почек и лёгких методом ПЦР генетического материал вируса ГБК обнаружено не было (табл. 1, 2).
Обсуждение
Как и нативные лаговирусы, очищенные препараты recVP60-GI1 и recVP60-GI2 и их смесь обладали гемагглютинирующей активностью, что говорило о возможности образования молекулами recVP60 в 0,15 M растворе ФБР ВпЧ. Электронная микроскопия показала наличие ВпЧ размером около 30–40 нм. Структуры, состоящие из рекомбинантных VP60, напоминали капсид калицивирусов.
Изучение антигенной активности полученных на основе recVP60-GI.1 и recVP60-GI.2 ВпЧ показало, что введение кроликам ВпЧ из белка как одного варианта, так и их смеси, вызывает синтез специфических антител. На 21-е сутки после введения рекомбинантных капсидных белков у всех иммунизированных животных уровень антител в ИФА стал 1 : 200 и выше.
Наличие антигенных свойств у ВпЧ на основе рекомбинантных главных капсидных белков открывает широкие перспективы использования их в качестве компонентов препаратов для специфической профилактики ВГБК у кроликов.
Результаты контрольного заражения показали разницу в иммуногенности ВпЧ на основе рекомбинантных белков при заражении вирусами разных генотипов. Иммуногенная активность против гетерологичного вируса не превышала 40%, тогда как при использовании вируса такого же генотипа или в случае иммунизации кроликов ВпЧ на основе смеси рекомбинантных белков иммуногенная активность была 90–100%. Данные результаты хорошо соотносятся с ранее известным феноменом – ограниченной защитой кроликов, вакцинированных вакцинами против ВГБК, изготовленных на основе штаммов 1-го генотипа, при заражении лаговирусами 2-го генотипа [12, 13].
Учитывая высокое антигенное родство лаговирусов 1-го и 2-го генотипов и то, что использованная нами тест-система ИФА не позволяла дифференцировать антитела к капсидным белкам разных генотипов вируса ГБК, связь между уровнем антител и способностью животных противостоять контрольному заражению оценивали только для кроликов иммунизированных монопрепаратами.
Проводимые серологические исследование показали, что выжили все кролики, имевшие до контрольного заражения уровень антител к вирусу ГБК 1 : 400 и выше.
Среди животных, иммунизированных ВпЧ на основе recVP60-GI.1 и заражённых вирусом ГБК 1-го генотипа, два кролика на момент заражения имели антитела на уровне 1 : 200. Из них пал только один. В группе, иммунизированной ВпЧ на основе recVP60-GI.2 и зараженной вирусом ГБК 2-го генотипа, оба кролика с титром антител 1 : 200 выжили. При этом вирулентность в контрольной группе, зараженной вирусом ГБК 1-го генотипа, была в целом выше вирулентности в контрольной группе, зараженной вирусом ГБК 2-го генотипа.
Заключение
Таким образом, полученные в бакуловирусной системе экспрессии генов главные капсидные белки вируса ГБК генотипов GI.1 и GI.2 в 0,15 М ФБР с рН 7,2–7,4 образуют ВпЧ. Их введение как в моновариантах, так и в смеси вызывает у кроликов синтез специфических антител и защищает животных при контрольном заражении вирулентными штаммами «Воронежский-87» вируса ГБК генотипа GI1 и «Тула» вируса ГБК генотипа GI2 в дозе 103 ЛД50 на уровне 90–100%. Уровень специфических антител к вирусу ГБК в ИФА 1 : 400 и выше защищает при контрольном заражении 100% животных.
About the authors
Aleksey N. Mukhin
Vetbiochem LLC
Author for correspondence.
Email: amuhin@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0001-7008-5212
Ph.D. (Biol.), Leading Researcher
Russian Federation, 109316, MoscowKonstantin P. Alekseev
Vetbiochem LLC
Email: kalekseev@hotmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9536-3127
Ph.D. (Biol.), Leading Researcher
Russian Federation, 109316, MoscowAnton G. Yuzhakov
Federal Scientific Center – All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after K.I. Scriabin and Ya.R. Kovalenko of the Russian Academy of Sciences
Email: anton_oskol@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0426-9678
Ph.D. (Biol.), Head of laboratory
Russian Federation, 109428, MoscowEkaterina V. Selezneva
Vetbiochem LLC
Email: selja07@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-5592-2948
microbiologist of department of quality control
Russian Federation, 109316, MoscowAnna S. Moskvina
Research Institute for Diagnosis and Prevention of Human and Animal Diseases
Email: annamoskvina17@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4542-8196
Ph.D. (Biol.), Leading Researcher
Russian Federation, 123098, MoscowOleg A. Verkhovsky
Research Institute for Diagnosis and Prevention of Human and Animal Diseases
Email: info@dpri.com
ORCID iD: 0000-0003-0784-9341
Professor, President
Russian Federation, 123098, MoscowTaras I. Aliper
Vetbiochem LLC
Email: coronavirusr@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2696-1363
Professor, Director of science and innovation
Russian Federation, 109316, MoscowReferences
- Liu S.J., Xue H.P., Pu B.Q., Quian N.H. A new viral disease in rabbits. Anim. Husb. Vet. Med. 1984; 16(6): 253–5.
- Mitro S., Krauss H. Rabbit hemorrhagic disease: a review with special reference to its epizootiology. Eur. J. Epidemiol. 1993; 9(1): 70–8. https://doi.org/10.1007/bf00463093
- Puggioni G., Cavadini P., Maestrale C., Scivoli R., Botti G., Ligios C., et al. The new French 2010 Rabbit Hemorrhagic Disease Virus causes an RHD-like disease in the Sardinian Cape hare (Lepus capensis mediterraneus). Vet. Res. 2013; 44(1): 96. https://doi.org/10.1186/1297-9716-44-96
- Abrantes J., Lopes A.M., Dalton K.P., Melo P., Correia J.J., Ramada M., et al. New variant of rabbit hemorrhagic disease virus, Portugal, 2012-2013. Emerg. Infect. Dis. 2013; 19(11): 1900–1902. https://doi.org/10.3201/eid1911.130908
- Dalton K.P., Nicieza I., Abrantes J., Esteves P.J., Parra F. Spread of new variant RHDV in domestic rabbits on the Iberian Peninsula. Vet. Microbiol. 2014; 169(1-2): 67–73. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2013.12.015
- Duarte M., Henriques M., Barros S.C., Fagulha T., Ramos F., Luis T., et al. Detection of RHDV variant 2 in domestic rabbits in Azores. Vet. Rec. 2015; 176(19): 499–500. https://doi.org/10.1136/vr.h2402
- OIE. Rabbit Haemorrhagic Disease. USA; 2020. Available at: https://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?page_refer=MapEventSummary&reportid=34728
- Le Pendu J., Abrantes J., Bertagnoli S., Guitton J.S., Le Gall-Reculé G., Lopes A.M., et al. Proposal for a unified classification system and nomenclature of lagoviruses. J. Gen. Virol. 2017; 98(7): 1658–66. https://doi.org/10.1099/jgv.0.000840
- Mukhin A.N., Yuzhakov A.G., Selezneva E.V., Drozdova E.I., Verkhovskiy O.A., Aliper T.I. Outbreak of the disease caused by the rabbit hemorrhagic disease virus 2 in the Russian Federation. Agrarnaya nauka. 2021; (4): 25–7. https://doi.org/10.32634/0869-8155-2021-348-4-25-27 EDN: https://www.elibrary.ru/ynmqnh (in Russian)
- Burmakina G., Malogolovkina N., Lunitsin A., Titov I., Tsybanov S., Malogolovkin A. Comparative analysis of rabbit hemorrhagic disease virus strains originating from outbreaks in the Russian Federation. Arch. Virol. 2016; 161(7): 1973–9. https://doi.org/10.1007/s00705-016-2864-1
- Federal Research Center for Virology and Microbiology. The third case of detection of a new type of rabbit hemorrhagic disease virus – VGBK-2 in the Russian Federation. Available at: https://ficvim.ru/2019/02/tretij-sluchaj-obnaruzheniya-virusa-gemorragicheskoj-bolezni-krolikov-novogo-tipa-vgbk-2-v-rossijskoj-federacii/ (in Russian)
- Le Gall-Recule G., Lavazza A., Marchandeau S., Bertagnoli S., Zwingelstein F., Cavadini P., et al. Emergence of a new lagovirus related to Rabbit haemorrhagic disease virus. Vet. Res. 2013; 44(1): 81. https://doi.org/10.1186/1297-9716-44-81
- Peacock D., Kovaliski J., Sinclair R., Mutze G., Iannella A., Capucci L. RHDV2 overcoming RHDV immunity in wild rabbits (Oryctolagus cuniculus) in Australia. Vet. Rec. 2017; 180(11): 280. https://doi.org/10.1136/vr.104135
- Vlasova N.N., Vlasov N.A., Alekseev K.P. Construction of plasmid vector of expressing virus of haemorrhagic disease of rabbits. Veterinariya. 2006; (11): 53–5. https://www.elibrary.ru/hvjxut (in Russian)
- Gromadzka B., Szewczyk B., Konopa G., Fitzner A., Kesy A. Recombinant VP60 in the form of virion-like particles as a potential vaccine against rabbit hemorrhagic disease virus. Acta Biochim. Pol. 2006; 53(2): 371–6.
- Guo H., Zhu J., Tan Y., Li C., Chen Z., Sun S., et al. Self-assembly of virus-like particles of rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein expressed in Escherichia coli and their immunogenicity in rabbits. Antiviral Res. 2016; 131: 85–91. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2016.04.011
- López-Vidal J., Gómez-Sebastián S., Bárcena J., Nuñez Mdel C., Martínez-Alonso D., Dudognon B., et al. Improved production efficiency of virus-like particles by the baculovirus expression vector system. PLoS One. 2015; 10(10): e0140039. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0140039
- Qi R., Miao Q., Zhu J., Tang J., Tang A., Wang X., et al. Construction and immunogenicity of novel bivalent virus-like particles bearing VP60 genes of classic RHDV(GI.1) and RHDV2(GI.2). Vet. Microbiol. 2020; 240: 108529. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2019.108529
- Alekseev K.P., Moskvina A.S., Verkhovskiy O.A., Selezneva E.V., Chernykh O.Yu., Mukhin A.N. Obtaining recombinant capsid protein VP60 of rabbit haemorrhagic disease virus and its antigenic and immunogenic activity study. Veterinariya Kubani. 2020; (5): 34–7. https://doi.org/10.33861/2071-8020-2020-5-34-37 EDN: https://www.elibrary.ru/vxzgjm (in Russian)
- Selezneva E.V., Mukhin A.N., Ezdakova I.Yu., Verkhovsky O.A., Aliper T.I. The application of recombinant Vp60-based ELISA for haemorrhagic disease virus antibody detection to vaccination against RHD. AIP Conf. Proc. 2022; 2467: 070028-1–070028-5. https://doi.org/10.1063/5.0092529
- Pawlikowska M., Hukowska-Szematowicz B., Deptuła W. Phylogenetic analysis of selected strains of Rabbit haemorrhagic disease virus on the basis of N-terminal fragment of the gene encoding structural protein VP60. Bull. Vet. Inst. Pulawy. 2010; 54: 129–33.
- Dalton K.P., Arnal J.L., Benito A.A., Chacón G., Martín Alonso J.M., Parra F. Conventional and real time RT-PCR assays for the detection and differentiation of variant rabbit hemorrhagic disease virus (RHDVb) and its recombinants. J. Virol. Methods. 2018; 251: 118–22. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2017.10.009
Supplementary files
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).