The results of certification of Pharmacopoeial standard for smallpox vaccine

Full Text

Введение

Фармакопейный стандартный образец активности, специфичности и некротической активности оспенной вакцины, серия 130406 (далее – ФСО ГФ РФ 3.2.00113) применяется для контроля специфической активности, специфичности (подлинности), некротической активности и термостабильности живых оспенных вакцин биологическими методами, а также для подтверждения подлинности, антигенной активности и специфической безопасности инактивированной оспенной вакцины биологическими методами. Материал стандартного образца представляет собой производственную серию лекарственного препарата «Вакцина оспенная живая, лиофилизат для приготовления раствора для внутрикожного ведения и накожного скарификационного нанесения», серия 130406, производство акционерного общества «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» (АО «НПО «Микроген»). Серия препарата была произведена в 2006 г., впервые аттестована в 2007 г., успешно проходила аттестацию с целью продления срока годности в 2012, 2015, 2018 и 2021 гг. (дата продления срока годности – 31.12.2021, годен до 31.12.2024). Аттестация ФСО ГФ РФ 3.2.00113 биологическими методами была подробно описана нами ранее в научных публикациях [1]. Методики аттестации являются фармакопейными и указаны в требованиях ГФ РФ, ФС.3.3.1.0033.15 Вакцина оспенная живая и ГФ РФ, ФС.3.3.1.0034.15 Вакцина оспенная инактивированная¹². По итогам аттестации в 2021 г. серия 130406 приобрела статус фармакопейного стандартного образца, которому был присвоен номер ФСО ГФ РФ 3.2.00113 (ОСО 42-28-113). Необходимо отметить, что при аттестации по показателю «Специфическая активность» ФСО ГФ РФ 3.2.00113 используется 1 Международный стандартный образец оспенной вакцины, впервые аттестованный в 1962 г. (далее – МСО)³.

На сегодняшний день в РФ зарегистрирована культуральная вакцина нового поколения «ОртопоксВак Вакцина для профилактики натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций на основе вируса осповакцины живая культуральная» (далее – «ОртопоксВак»)⁴ [2]. Современные требования к качеству таких вакцин, которые отражены в п. 4.6. главы 30 Решения Коллегии Евразийской экономической комиссии № 89⁵ и тенденции к переходу с методов контроля на животных (in vivo) на методы in vitro, в соответствии с п. 2.3.1.8 Решения Коллегии Евразийской экономической комиссии № 100 (в ред. от 25.06.2024 № 75)⁶, диктуют необходимость применения культурального метода для оценки «Специфичности (подлинности)» и «Специфической активности» оспенных вакцин нового поколения.

Цель работы – проведение аттестации ФСО ГФ РФ 3.2.00113 по основным аттестуемым характеристикам, а также оценка возможности использования новой методики определения специфической активности, специфичности (подлинности) с применением культурального метода.

Материалы и методы

Объектом исследования являлся ФСО ГФ РФ 3.2.00113. В качестве стандартного образца использовали МСО (NIBSC, каталожный номер SMV).

Оценку показателей «Специфическая активность», «Специфичность (подлинность)», «Некротическая активность» проводили в соответствии с требованиями ГФ РФ, ФС. 3.3.1.0033.15 Вакцина оспенная живая, раздел «Специфическая активность»².

При оценке возможности аттестации ФСО ГФ РФ 3.2.00113 культуральным методом по показателям «Специфическая активность» и «Специфичность (подлинность)» применяли методику, предоставленную ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (Новосибирск). При испытаниях использовали 2 паспортизированные культуры клеток:

• культуру клеток 4647 – коллекционный шифр Линия клеток получена в 1974 г. Л.Л. Мироновой в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАН из почки африканской зеленой мартышки. Приобретена из коллекции культур ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора;
• культуру клеток Vero. Номер в коллекции ATCC – CCL Номер лота: 58954145.

Выбор культур клеток был обусловлен тем, что культуральная вакцина «ОртопоксВак» производится с использованием в качестве субстрата культуры клеток 4647. Применение второй культуры клеток Vero обусловлено необходимостью проверки устойчивости методики.

При исследовании использовали паспортизированные питательные среды, сыворотки крови плодов коровы, растворы для работы с культурами клеток коммерческого производства. Работу с культурами клеток проводили в асептических условиях в соответствии с общепринятыми правилами, а также с соблюдением требований Санитарных правил и норм СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».

Составы сред и растворов (приготовление проводили непосредственно перед использованием в асептических условиях)

Среда для получения суспензии клеток (среда для снятия клеточного монослоя):

• 0,25% раствор трипсина – 1 часть (1/3);
• 0,02% раствор версена – 2 части (2/3).

Или применяли готовый раствор трипсина-версена стерильный, коммерческого производства.

В качестве питательной среды для культивирования клеток (ростовая питательная среда) в разных циклах испытаний последовательно применяли 3 различных наименования питательных сред, а именно: питательную среду ДМЕМ, или питательную среду Игла МЕМ с L-глутамином, или питательную среду RPMI-1640 с L-глутамином. К каждой питательной среде добавляли 5–10% сыворотки крови плодов коровы и растворы антибиотиков (гентамицин или пенициллин-стрептомицин) в рабочих концентрациях. В качестве поддерживающей питательной среды применяли аналогичные наименования питательных сред со сниженным содержанием сыворотки крови плодов коровы (2–5%).

Определение показателей «Специфическая активность» и «Специфичность (подлинность)» (проводилось 3 исполнителями и состояло из нескольких этапов)

1. Подготовка планшетов с культурой клеток

Культуру клеток Vero и 4647 выращивали в культуральных флаконах в СО₂-инкубаторе с 5% содержанием углекислого газа при температуре 37 ± 1 °С в течение 24–48 ч до образования клеточного монослоя. Для культивирования применяли ростовые питательные среды, описанные выше.

Для снятия клеток с поверхности культуральных флаконов использовали подогретую до 37 ± 1 °С смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена, выдерживали клетки при температуре 37 ± 1 °С до состояния набухания, удаляли смесь диспергирующего раствора трипсина-версена и добавляли в культуральный флакон около 50 мл ростовой питательной среды. Получали клеточную суспензию в растворе ростовой питательной среды и затем проводили подсчет клеток в автоматическом счетчике клеток производства фирмы Biorad.

Посевная концентрация клеточной суспензии в опытах составляла 250–500 тыс. клеток в 1 мл. Суспензию клеток разливали в 6-луночные планшеты, после чего проводили инкубацию в СО₂-инкубаторе с 5% содержанием углекислого газа при температуре 37 ± 1 °С в течение 24–48 ч до образования клеточного монослоя.

2. Приготовление разведений образцов ФСО ГФ РФ 3.2.00113

С целью отработки методики и сравнения полученных результатов применяли 2 способа восстановления образцов:

• 1-й способ – 1 ампулу образца восстанавливали в 2,0 мл поддерживающей питательной среды, получая разведение 10⁻¹, после чего проводили последовательное приготовление 10-кратных разведений от 10⁻² до 10⁻⁸ (восстановление и приготовление разведений в соответствии с требованиями раздела «Специфическая активность» ГФ РФ, ФС.3.1.0033.15 Вакцина оспенная живая);
• 2-й способ – 1 ампулу образца восстанавливали в 1,0 мл поддерживающей питательной среды, получая предварительное разведение 10⁻⁰, после чего проводили последовательное приготовление 10-кратных разведений от 10⁻¹ до 10⁻⁸.

Количество 10-кратных разведений варьировалось в зависимости от результатов, получаемых при исследованиях.

3. Инфицирование культур клеток Vero и 4647 разведениями ФСО ГФ РФ 3.2.00113

Из 6-луночных планшетов со сформированным клеточным монослоем аккуратно удаляли ростовую питательную среду и в каждые 3 лунки (ряд) вносили не менее 2–3 10-кратных разведений ФСО (10⁻⁵, 10⁻⁶, 10⁻⁷ или 10⁻⁶, 10⁻⁷, 10⁻⁸) в объеме 0,1 мл или 0,3 мл. Количество и разведения для инфицирования культур клеток зависели от целей того или иного этапа испытаний. В качестве отрицательного контрольного образца в каждом опыте использовали 3 лунки с незараженным монослоем культуры клеток, в которые вносили 0,1 или 0,3 мл поддерживающей питательной среды.

Планшеты с инфицированными культурами клеток выдерживали в СО₂-инкубаторе при температуре 37 ± 1 °С в течение 60 мин для адсорбции вируса.

Затем добавляли по 2,0 мл в каждую лунку 6-луночных планшетов поддерживающей питательной среды и продолжали инкубацию в СО₂-инкубаторе при температуре 37 ± 1 °С в течение 48–72 ч.

4. Учет результатов

Учет результатов проводили через 48–72 ч визуальным способом после окрашивания инфицированного клеточного монослоя, для этого аккуратно удаляли содержимое лунок в контейнер с дезинфицирующим раствором, инфицированный клеточный монослой фиксировали и окрашивали 0,2% спиртовым раствором кристаллического фиолетового с формальдегидом. Через 10–15 мин краситель удаляли, а культуральный планшет с окрашенным монослоем подсушивали. Подсчитывали количество специфических образований – бляшек (очагов разрушенного монослоя клеток округлой формы в виде белых пятен на синем фоне) в монослое культуры клеток. Затем вычисляли среднее арифметическое количество (В) бляшек в лунках, инфицированных разведением, вызвавшим образование не менее 5–10 бляшек. Вычисляли количество БОЕ/мл по формуле:

$A=\frac{B}{C\times d}, \left[1\right]$

где: А – специфическая активность, БОЕ/мл; В – среднее арифметическое количество бляшек в монослое культуры клеток; С – разведение вируса; d – объем инокулята (мл).

При расчетах учитывали разведения препарата, в котором происходило образование не менее 5–10 бляшек на монослое клеток.

В случае внесения в лунку 0,3 мл разведения средний результат, полученный в 3 лунках, делили на 3 или учитывали в формуле расчета.

Пример расчета:

$A=\frac{11}{{10}^{-6}\times \mathrm{0,1}}=\mathrm{1,0}\times {10}^8БОЕ/мл,$

Специфическая активность составляет 1,0 × 10⁸ БОЕ/мл.

Основные критерии приемлемости:

1. в отрицательном контроле не должно происходить образование специфических образований – бляшек;
2. в учитываемом для расчета разведении должно наблюдаться образование не менее 5–10 специфических образований – бляшек.

Исследование по оценке возможности проведения испытаний ФСО ГФ РФ 3.2.00113 культуральным методом (включало в себя несколько этапов)

1. Проведение предварительного исследования. При предварительном исследовании оценивали возможность формирования специфических образований – бляшек, подбирали способ восстановления ФСО ГФ РФ 3.2.00113 и определяли 10-кратные разведения с целью оценки показателя «Специфическая активность» и «Специфичность (подлинность)».
2. Проведение исследования ФСО ГФ РФ 3.2.00113 с одновременным применением МСО. Приготовление разведений в этом исследовании осуществлял 1 исполнитель в соответствии с требованиями инструкции по применению³.
3. Оценка возможности проведения аттестации ФСО ГФ РФ 3.2.00113 культуральным методом. На данном этапе исследование было разделено на 3 основных этапа (аналитических цикла), выполнение каждого этапа проводилось каждым из 3 исполнителей. При испытаниях использовали различные способы восстановления образцов, разные составы ростовых и поддерживающих питательных сред, применение разных объемов разведений ФСО для инфицирования клеточного монослоя.

Статистическую обработку данных проводили на персональном компьютере в Windows 7 с использованием редактора Microsoft Officе Excel (Microsoft, США).

Результаты

При аттестации ФСО ГФ РФ 3.2.00113 с применением фармакопейных методик были получены следующие результаты:

а) специфическая активность – на хорионаллантоисной оболочке (ХАО) куриных эмбрионов: 3,8 ± 2,5 × 10⁸ оспообразующих единиц на 1 мл (ООЕ/мл);

б) специфичность (подлинность):

• при нанесении на скарифицированную кожу кроликов дозы 10⁴ ООЕ/0,1 мл образуются типичные оспины;
• на ХАО 12-дневных куриных эмбрионов образуются белые плотные поражения диаметром от 0,5 до 3 мм;

в) некротическая активность – при внутрикожном введении кроликам дозы, равной 10⁴ ООЕ/0,1 мл, некрозы отсутствуют.

Потеря в массе при высушивании составила 1,24%, рН – 6,99; средняя масса – 0,0106 ± 0,0004 г, коэффициент вариации массы – 3,80%; термостабильность – не менее 1 × 10⁸ ООЕ/мл.

На основании полученных результатов аттестованных характеристик и дополнительных сведений для ФСО 3.2.00113 был установлен срок годности 1 год – до 31.12.2025.

Результаты оценки возможности испытания ФСО ГФ РФ 3.2.00113 по показателям «Специфичность (подлинность)» и «Специфическая активность» культуральным методом

Предварительное исследование проводилось каждым из 3 исполнителей. В качестве ростовой и поддерживающей питательных сред была использована среда Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и стабильным L-глутамином с добавлением сыворотки крови плодов коровы и антибиотиков в рабочих концентрациях на двух культурах клеток Vero и 4647. Испытанию подвергались образцы ФСО ГФ РФ 3.2.00113. Каждую из ампул исследуемых образцов исполнитель растворял в 2,0 мл поддерживающей питательной среды для получения разведения 10^–1, после чего проводил приготовление последовательных 10-кратных разведений в соответствии с требованиями ГФ РФ, ФС.3.3.1.0033.15 Вакцина оспенная живая, раздел «специфическая активность».

После удаления из 6-луночных планшетов с культурами клеток Vero и 4647 ростовой питательной среды, каждый исполнитель инфицировал по 1 ряду (3 лунки) разведениями 10^–6, 10^–7, 10^–8 в объеме 100 мкл на 1 лунку. В пустые лунки, в которые не вносили разведения ФСО, добавляли 100 мкл поддерживающей питательной среды – отрицательный контроль. Пример учета результатов бляшкообразования представлен на рис. 1.

 

Рис. 1. Учет результатов бляшкообразования.

Fig. 1. Interpretation of the results of plaque formation.

 

При предварительном исследовании были получены следующие результаты:

1. При инфицировании культур клеток Vero и 4647 ФСО ГФ РФ 3.2.00113 разведениями 10^–6 и 10^–7 наблюдалось образование специфических образований – бляшек, что предполагает возможность использования данной методики при подтверждении показателя «Специфичность (подлинность)» (рис. 2, 3). При инфицировании двух культур разведением 10^–8 наблюдались единичные бляшки, в некоторых лунках они отсутствовали. Таким образом, при подтверждении показателя «Специфичность (подлинность)» целесообразным является использование разведений 10^–6 и 10^–7.

 

Рис. 2. Бляшки под микроскопом при увеличении 4 (общее увеличение 40).

Fig. 2. Plaques under a microscope at magnification ×4 (total magnification ×40).

 

Рис. 3. Бляшки в лунке планшета с культурой клеток 4647.

Fig. 3. Plaques in the plate well with cell culture 4647.

 

2. В опыте было определено, что при приготовлении разведений ФСО ГФ РФ 3.2.00113 аналогично требованиям ГФ РФ, ФС.3.3.1.0033.15 на Вакцину оспенную живую расчет специфических поражений – бляшек целесообразно проводить в разведении 10^–6, где количество бляшек составило более 10 штук (у 3 исполнителей), что позволило получить более корректный результат. Расчет по разведению 10^–7 приводит к завышению значений показателя «Специфическая активность». Полученные результаты показаны в примерах расчета табл. 1.

 

Таблица 1. Примеры расчета бляшек на культуре клеток Vero и 4647

Table 1. Examples of plaque calculation in Vero and 4647 cell culture

Разведения ФСО Dilutions of Pharmacopoeia standard	Количество бляшек на культуре клеток Pock count on cell culture				Значение показателя «Специфическая активность», БОЕ/мл Specific activity, Plaque-forming units/mL
	Исполнитель 1 Operator 1 (n = 3)	Исполнитель 2 Operator 2 (n = 3)	Исполнитель 3 Operator 3 (n = 3)	Среднее значение и стандартное отклонение Mean value and standard deviation (n = 9)
Культура клеток Vero Cell culture Vero
10–6	50,0	50,0	19,7	39,9 ± 17,5	4,0 × 108
10–7	9,3	4,7	7,0	7,0 ± 2,3	0,7 × 109 или / or 7,0 × 108
10–8	0,3	1,3	0,5	0,7 ± 0,5	–
Культура клеток 4647 Cell culture 4647
10–6	50,0	50,0	34,7	45 ± 8,8	4,5 × 108
10–7	8,7	11,7	5,0	8,5 ± 3,4	0,8 × 109 или / or 8,0 × 108
10–8	0,3	4,3	0,3	1,6 ± 2,3	–

 

Как следует из результатов, представленных в табл. 1, расчет бляшек в разведении 10^–6 позволил получить адекватные результаты значений показателя «Специфическая активность» на культурах клеток Vero и 4647. Полученные результаты коррелировали со значением показателя «Специфическая активность» ФСО, полученного при проведении испытания на ХАО развивающихся куриных эмбрионов 3,8 ± 2,5 × 10⁸ ООЕ/мл.

3. При проведении тестового эксперимента при просмотре в микроскоп на этапе первичной (контактной) инкубации планшетов в СО₂-инкубаторе при температуре 37 ± 1 °С в течение 60 мин, в некоторых случаях были обнаружены очаги частичного разрушения и дегенерации клеточного монослоя. Данное явление может быть связано с недостаточным количеством инфицирующего материала, вносимого в каждую лунку (100 мкл), которое не покрывало всю поверхность клеточного монослоя, в результате чего монослой в процессе инкубации подвергался пересыханию и частичной дегенерации. В одном из опытов это привело к снижению значений показателя «Специфическая активность» (1,97 × 10⁸ и 3,5 × 10⁸ БОЕ/мл). Таким образом, при проведении последующих экспериментов была установлена необходимость увеличения инфицирующей дозы до 300 мкл для разведений ФСО на этапе инфицирования культуры клеток.

Минимальные и максимальные значения показателя «Специфическая активность» на культуре клеток Vero составили от 1,97 × 10⁸ до 5,20 × 10⁸ БОЕ/мл, а на культуре клеток 4647 – от 3,5 × 10⁸ до 5,20 × 10⁸ БОЕ/мл, что показало их сходимость.

Исследование с применением 1 Международного стандартного образца оспенной вакцины

Основанием для проведения опыта на культурах клеток с применением МСО (The 1^st International Standard for Smallpox Vaccine, NIBSC, кат. № SMV) была возможность его использования, указанная в инструкции. Аттестованной характеристикой МСО является значение LD₅₀ на культуре клеток, значение которой составляет 10^5,8 в 1 мл (1963 г.)³. Исходя из данных литературы, аттестация МСО проводилась в 1963 г. с применением клеточной культуры KB (KB Hela – клетки карциномы шейки матки человека) и первично-трипсинизированной культуры клеток куриного эмбриона [3]. В связи с тем, что МСО охарактеризован культуральным методом, это являлось дополнительной возможностью для проведения оценки ФСО ГФ РФ 3.2.00113 культуральным методом и удовлетворяло требованиям, предъявляемым при установлении аттестуемых характеристик стандартных образцов [4]. Однако ввиду того, что аттестация МСО проходила в 1963 г., применялись другие культуры клеток, а также иная характеристика количественной оценки (LD₅₀, а не БОЕ/мл), можно предположить, что нами могут быть получены иные результаты и их учет будет целесообразно проводить по фактическим данным.

В опыте были исследованы такие валидационные характеристики, как специфичность, правильность, линейность, была проведена сравнительная оценка получаемых результатов при разных способах восстановления исследуемых образцов ФСО ГФ РФ 3.2.00113, сравнительная оценка результатов, полученных при использовании различных инфицирующих доз. Схема исследования представлена на рис. 4, 5.

 

Рис. 4. Схема исследования с Фармакопейным стандартным образцом.

Fig. 4. Scheme of the research using Pharmacopoeial standard.

 

Рис. 5. Схема исследования с Международным стандартным образцом.

Fig. 5. Research Scheme of the research using International Standard.

 

Определение валидационных характеристик

Определение специфичности

Определение специфичности (подлинности) заключалось в сравнении специфических поражений – бляшек, полученных при инфицировании монослоя клеток Vero и 4647 разведениями МСО и ФСО.

При определении специфичности были получены результаты, соответствующие следующим критериям приемлемости:

• при инфицировании культур клеток Vero и 4647 разведениями МСО и ФСО наблюдалось образование специфических образований – бляшек, схожих по морфологии;
• в отрицательном контроле у 3 исполнителей во всех опытах были получены отрицательные результаты.

Результаты опыта представлены на рис. 6.

 

Рис. 6. Культуры клеток Vero и 4647 инфицированные разведениями МСО.

Fig. 6. Cell cultures Vero и 4647 infected with dilutions of International standard.

 

На основании полученных результатов и соответствия образцов ФСО установленным критериям приемлемости можно сделать вывод о том, что валидационная характеристика «Специфичность (подлинность)» подтверждена и методика может быть применима с целью определения аналогичного показателя ФСО ГФ РФ 3.2.00113.

Определение повторяемости (сходимости) и внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности

С целью подтверждения повторяемости (сходимости) был установлен следующий критерий приемлемости:

• количество бляшек, образованных вирусом осповакцины при воспроизведении испытания исполнителем в разных разведениях, позволяет получить сходимые результаты (n = 3 при внесении одного разведения в 3 лунки 1 исполнителем). Всего в опыте было использовано 3 разведения (10^–4, 10^–5, 10^–6 для МСО). Аналогичный опыт был проведен каждым из 3 исполнителей.

С целью подтверждения внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности был установлен критерий приемлемости:

• результаты не менее 3 определений показателя «Специфическая активность» каждым из 3 исполнителей отдельно для каждой культуры клеток Vero и 4647 позволяет получить сходимые данные.

Полученные результаты представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Результаты определения показателя «Специфическая активность» МСО на культурах клеток

Table 2. The results of the determination of the indicator “Specific activity” of International Standard in cell cultures

Наименование культуры клеток Cell culture	Объем инфицирующей дозы The volume of infectious dose	Исполнитель Operator	Разведения МСО Dilutions of International standard	Количество бляшек на культуре клеток Pock-count on cell culture	Значение показателя «Специфическая активность», БОЕ/мл Specific activity, Plaque-forming units/mL	Среднее значение/ стандартное отклонение Mean value/ standard deviation
Vero	300 мкл / μL	1	10–4	Более 100; более 100; более 100	Не учитывается	0,5 × 108/0,14
			10–5	Более 100; более 100; более 100	Не учитывается
			10–6	16; 18; 13	0,52 × 108
		2	10–4	Более 100; более 100; более 100	Не учитывается
			10–5	85; 90; 95	Не учитывается
			10–6	18; 17; 17	0,58 × 108
		3	10–4	Более 100; более 100; более 100	Не учитывается
			10–5	78; 71; 81	Не учитывается
			10–6	10; 8; 10	0,31 × 108
4647	300 мкл / µL	1	10–4	Более 100; более 100; более 100	Не учитывается	0,2 × 108/0,06
			10–5	54; 46; 50	Не учитывается
			10–6	7; 6; 8	0,23 × 108
		2	10–4	Более 100; более 100; более 100	Не учитывается
			10–5	56; 57; 51	Не учитывается
			10–6	4; 4; 4	0,1 × 108
		3	10–4	Более 100; более 100; более 100	Не учитывается
			10–5	38; 35; 39	Не учитывается
			10–6	5; 4; 5	0,15 × 108

 

В опыте при приготовлении разведений МСО одним исполнителем и последующим инфицированием культур клеток Vero и 4647 разными исполнителями были подтверждены 2 валидационные характеристики, а именно:

1. Повторяемость (сходимость). Были получены сходимые результаты не менее 3 определений у каждого из 3 исполнителей на каждом из 3 уровней определяемых величин при испытании МСО:

• для разведения 10^–4 количество бляшек, образованных вирусом осповакцины, в каждой из трех лунок составило более 100 штук (для культуры клеток Vero и 4647);
• для разведения 10^–5 количество бляшек, образованных вирусом осповакцины, в каждой из трех лунок составило в среднем 89 штук (для культуры клеток Vero) и в среднем 47 штук (для культуры клеток 4647);
• для разведения 10^–6 количество бляшек, образованных вирусом осповакцины, в каждой из трех лунок составило в среднем 14 штук (для культуры клеток Vero) и в среднем 5 штук (для культуры клеток 4647).

2. Внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность. Были получены сходимые результаты при определении показателя «Специфическая активность» культуральным методом при испытании МСО каждым из 3 исполнителей:

• на культуре клеток Vero среднее значение показателя составило 0,5 × 10⁸ БОЕ/мл, стандартное отклонение – 0,14 (исполнитель 1 – 0,52 × 10⁸ БОЕ/мл; исполнитель 2 – 0,58 × 10⁸ БОЕ/мл; исполнитель 3 – 0,31 × 10⁸ БОЕ/мл);
• на культуре клеток 4647 среднее значение показателя составило 0,2 × 10⁸ БОЕ/мл, стандартное отклонение – 0,06 (исполнитель 1 – 0,23 × 10⁸ БОЕ/мл; исполнитель 2 – 0,1 × 10⁸ БОЕ/мл; исполнитель 3 – 0,15 × 10⁸ БОЕ/мл).

Таким образом, на основании полученных результатов при испытании МСО были подтверждены валидационные характеристики методики «Повторяемость (сходимость)» и «Внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность».

Определение линейности

В одной повторности одним исполнителем с целью определения линейности были использованы разведения 10^–3,10^–4,10^–5,10^–6 при инфицировании культур клеток Vero и 4647 (рис. 6).

Критерием приемлемости при определении линейности было установлено наличие линейной зависимости количества специфических поражений (бляшек) на культурах клеток Vero и 4647 при инфицировании клеточного монослоя разными разведениями МСО.

Как следует из результатов, представленных на рис. 6, при внесении разных концентраций (разведений) МСО на культуры клеток Vero и 4647 образуются специфические поражения – бляшки, количество которых пропорционально внесенной концентрации испытуемого образца, что свидетельствует о линейности методики.

С целью оценки валидационной характеристики «Линейность» на основании результатов расчета количества специфических поражений (бляшек) на культурах клеток Vero и 4647 при инфицировании клеточного монослоя разными разведениями МСО была построена диаграмма, а также вычислена величина достоверности аппроксимации R² (коэффициент детерминации). При испытании разведений МСО на культурах клеток Vero и 4647 коэффициент детерминации находился в пределах 0,954 и 0,951 соответственно, что подтвердило линейность методики.

Определение правильности

С целью определения правильности в опыте с применением МСО, на основании требований Европейской фармакопеи 11.0 издания⁷ был установлен следующий критерий приемлемости:

• валидируемая методика признается правильной, если значения показателя «Специфическая активность» исследуемых образцов, полученные 3 исполнителями, не отличаются друг от друга более чем на ± 0,5 log БОЕ/мл.

Для оценки правильности оценивались значения показателя «Специфическая активность» МСО и ФСО ГФ РФ 3.2.00113, полученные 3 исполнителями. Результаты представлены в табл. 3.

 

Таблица 3. Результаты оценки правильности при определении показателя «Специфическая активность» МСО и ФСО ГФ РФ 3.2.00113 на культурах клеток

Table 3. The results of the assessment of correctness in determining the indicator “Specific activity” of the International standard and Pharmacopeia standard 3.2.00113 in cell cultures

Наименование культуры клеток Cell culture	Исполнитель Operator	Логарифм концентрации значения показателя «Специфическая активность» МСО, Log10 БОЕ/мл Log10 concentration specific activity of International standard, Log10 Plaque-forming units/mL	Стандартное отклонение Standard deviation	Логарифм концентрации значения показателя «Специфическая активность» ФСО, Log10 БОЕ/мл Log10 of concentration specific activity of Pharmacopeia standard, Log10 Plaque-forming units/mL	Стандартное отклонение Standard deviation
Vero	1	7,71	0,14	8,32	0,06
	2	7,76		8,20
	3	7,49		8,23
4647	1	7,36	0,18	8,17	0,17
	2	7,00		7,90
	3	7,17		7,84

 

Как видно из табл. 3, значения показателя «Специфическая активность» исследуемых образцов МСО и ФСО ГФ РФ 3.2.00113, полученные 3 исполнителями и выраженные в единицах логарифма концентрации, не отличались друг от друга более чем на ± 0,5 log БОЕ/мл, правильность методики подтверждена.

Таким образом, в опыте с применением МСО были подтверждены следующие валидационные характеристики методики определения показателей «Специфичность (подлинность)» и «Специфическая активность» культуральным методом:

• специфичность;
• повторяемость (сходимость);
• внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность;
• линейность;
• правильность.

С целью дальнейшей отработки методики при определении показателей «Специфичность (подлинность)» и «Специфическая активность» с применением культурального метода было проведено 3 основных этапа (аналитических цикла), состоящих из не менее чем 3 опытов. Выполнение каждого этапа проводилось каждым из 3 исполнителей. При испытаниях варьировались способы восстановления образцов, составы ростовых и поддерживающих питательных сред, время инкубации инфицированных культур клеток.

На 1-м этапе (аналитическом цикле) для работы с культурами клеток использовалась среда Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и стабильным L-глутамином с добавлением сыворотки крови плодов коровы и антибиотиков в рабочих концентрациях.

Во 2-м аналитическом цикле для работы с культурами клеток использовалась среда ДМЕМ с добавлением сыворотки крови плодов коровы и антибиотиков в рабочих концентрациях.

В 3-м аналитическом цикле применяли среду RPMI с добавлением сыворотки крови плодов коровы и антибиотиков в рабочих концентрациях.

Средние результаты, полученные 3 исполнителями при выполнении 3 аналитических циклов, представлены в табл. 4.

 

Таблица 4. Результаты испытаний по показателю «Специфическая активность» ФСО ГФ РФ 3.2.00113 на культурах клеток Vero и 4647

Table 4. Test results for the indicator “Specific activity” of Pharmacopeia standard 3.2.00113 on Vero and 4647 cell cultures

Особенности методики	Значение показателя «Специфическая активность», на культуре клеток Vero, БОЕ/мл Specific activity on cell culture Vero Plaque-forming units/mL		Значение показателя «Специфическая активность», на культуре клеток 4647, БОЕ/мл Specific activity on cell culture 4647 Plaque-forming units/mL
	Инкубация инфицированных планшетов в течение 2 сут	Инкубация инфицированных планшетов в течение 3 сут	Инкубация инфицированных планшетов в течение 2 сут	Инкубация инфицированных планшетов в течение 3 сут
Восстановление образцов в 2,0 мл поддерживающей питательной среды для получения разведения 10–1 и последующим приготовлением разведений в соответствии с требованиями ГФ РФ, ФС.3.3.1.0033.15 «Вакцина оспенная живая»	1,80 × 108 стандартное отклонение 0,3 (р = 0,25)	3,65 × 108 стандартное отклонение 1,2 (р = 0,12)	1,01 × 108 стандартное отклонение 0,4 (р = 0,17)	3,61 × 108 стандартное отклонение 1,1 (р = 0,13)
Восстановление образцов в 1,0 мл поддерживающей питательной среды для получения разведения 100 и последующим приготовлением разведений в соответствии с требованиями ГФ РФ, ФС. 3.3.1.0033.15 «Вакцина оспенная живая»	1,3 × 108 стандартное отклонение 0,7 (р = 0,23)	1,7 × 108 стандартное отклонение 0,9 (р = 0,21)	0,5 × 108 стандартное отклонение 0,3 (р = 0,05)	1,1 × 108 стандартное отклонение 1,1 (р = 0,04)

 

Как следует из результатов, при восстановлении образцов в 2,0 мл поддерживающей питательной среды на культуре клеток Vero и 4647 с целью получения разведения 10^–1 были получены сопоставимые данные. Значение показателя «Специфическая активность» при испытании на культурах клеток Vero и 4647 составляло 3,65 × 10⁸ и 3,61 × 10⁸ БОЕ/мл соответственно (при округлении можно установить значение показателя «Специфическая активность» 3,6 × 10⁸ БОЕ/мл для 2 культур клеток) в случае инкубации инфицированных планшетов в течение 3 сут. При инкубации инфицированных планшетов в течение 2 сут среднее значение показателя «Специфическая активность» на культуре клеток 4647 было ниже и составило 1,0 × 10⁸ БОЕ/мл, тогда как значение показателя «Специфическая активность», полученное с применением культуры клеток Vero, составило 1,8 × 10⁸ БОЕ/мл.

При использовании дополнительного разведения при восстановлении образцов в 1,0 мл поддерживающей питательной среды для получения разведения 10⁰ (по аналогии с пробоподготовкой препарата «ОртопоксВак») и последующим приготовлением 10-кратных разведений результаты значений показателя «Специфическая активность» были ниже, что является закономерным. При инкубации инфицированных планшетов в течение 3 сут на культуре клеток Vero значение показателя «Специфическая активность» составило 1,7 × 10⁸ БОЕ/мл, а на культуре клеток 4647 – 1,1 × 10⁸ БОЕ/мл (значение показателя культуре клеток 4647 было в 1,5 раза ниже). При инкубации инфицированных планшетов в течение 2 сут наблюдалась аналогичная тенденция. Значение показателя «Специфическая активность» на культуре клеток Vero составило 1,3 × 10⁸ БОЕ/мл, а на культуре клеток 4647 – 0,5 × 10⁸ БОЕ/мл (значение показателя культуре клеток 4647 было в 2,6 раза ниже). Однако при использовании дополнительного разведения 10⁰ для восстановления образцов были отмечены неоднозначные результаты значений стандартных отклонений. Распределение результатов было нормальным во всех случаях, за исключением результатов, полученных на культуре клеток 4647 при приготовлении предварительного разведения 10⁰ после инкубирования инфицированных планшетов в течение 3 сут.

Обсуждение

В соответствии с результатами, полученными при аттестации ФСО ГФ РФ 3.2.00113 с применением фармакопейных методик, подтверждены его основные аттестованные характеристики. По итогам работы оформлены паспорт и инструкция по применению, срок годности ФСО составил 1 год.

При оценке возможности испытания ФСО ГФ РФ 3.2.00113, ГФ РФ 3.2.00113 по показателям «Специфичность (подлинность)» и «Специфическая активность» культуральным методом можно сделать следующие выводы:

1. Установлено, что возможно проведение испытаний ФСО ГФ РФ 3.2.00113 по показателям «Специфичность (подлинность)» и «Специфическая активность» c применением культурального метода.
2. При испытании по показателю «Специфичность (подлинность)» во всех проведенных исследованиях наблюдалось образование специфических образований – бляшек при инфицировании культур клеток Vero и 4647 разведениями ФСО 10^–5,10^–6,10^–7, что подтверждает возможность испытаний с применением данного метода.
3. В 3 аналитических циклах с применением различных питательных сред были получены сходимые и воспроизводимые результаты. Было установлено, что наиболее приемлемые результаты получаются при восстановлении образцов в 2,0 мл поддерживающей питательной среды для получения разведения 10^–1 и последующим приготовлением разведений в соответствии с требованиями ГФ РФ, ФС.3.3.1.0033.15 «Вакцина оспенная живая» и последующей инкубацией в течение не менее 3 сут (не менее 72 ч) до получения результатов.
4. Расчет показателя «Специфическая активность» целесообразно проводить в разведении, где количество образованных бляшек составляет 5–10 и более штук (при исследовании ФСО ГФ РФ 3.2.00113 определение показателя «Специфическая активность» проводилось в разведении 10^–6). С целью получения воспроизводимых результатов объем инфицирующих разведений, вносимый в лунки 6-луночного планшета, должен составлять 0,3 мл перед инкубацией в течение 60 мин в СО₂-инкубаторе. В опытах целесообразно использования разведений ФСО 10^–5,10^–6,10^–7. При последующих расчетах целесообразно проводить пересчет значения показателя «Специфическая активность» на инфицирующую дозу (0,3 мл).
5. При валидации методики с применением МСО были подтверждены такие валидационные характеристики методики, как специфичность, повторяемость (сходимость), внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность, линейность, правильность.

В ходе исследования была подтверждена возможность использования новой методики определения специфической активности, специфичности (подлинности) с применением культурального метода. На основании полученных результатов были установлены следующие критерии приемлемости методики определения показателей «Специфичность (подлинность)» и «Специфическая активность» культуральным методом:

1. При учете результатов в клетках, не инфицированных разведениями ФСО (отрицательный контроль), не должно наблюдаться признаков цитопатогенного действия, клеточной деградации, образования специфических поражений.
2. Расчет показателя «Специфическая активность» целесообразно проводить в разведении, где количество образованных бляшек составляет 5–10 и более штук.
3. При испытании должно быть подтверждено значение показателя «Специфическая активность», установленное культуральным методом, выраженную в виде аттестованного значения (Xср) при доверительной вероятности 0,95, а также расширенной неопределенности (U), которую вычисляют как ± 2S от среднего значения (коэффициент охвата k = 2, уровень доверия 95%).

Возможно внесение обоснованных дополнений и изменений в установленные критерии приемлемости в ходе проведения последующих испытаний с применением культурального метода.

Заключение

Проведена аттестация фармакопейного стандартного образца активности, специфичности и некротической активности оспенной вакцины по основным аттестуемым характеристикам. Был установлен срок годности 1 год – до 31.12.2025. При исследовании ФСО подтверждена возможность использования новой методики определения специфической активности, специфичности (подлинности) с применением культурального метода, установлены основные критерии приемлемости.

 

¹ Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV издания. ФС.3.3.1.0033.15 Вакцина оспенная живая. Доступно по: https://pharmacopoeia.regmed.ru/pharmacopoeia/izdanie-14/3/3-3/3-3-1/vaktsina-ospennaya-zhivaya/

² Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV издания. ФС.3.3.1.0034.15 Вакцина оспенная инактивированная. Доступно по: https://pharmacopoeia.regmed.ru/pharmacopoeia/izdanie-14/3/3-3/3-3-1/vaktsina-ospennaya-inaktivirovannaya/

³ Всемирная организация здравоохранения. Международный стандартный образец оспенной вакцины. Код по каталогу NIBSC: SMV. Инструкция по применению (Версия 4.0, от 18/03/2008). Доступно по: https://nibsc.org/products/brm_product_catalogue/detail_page.aspx?catid=SMV

⁴ Государственный реестр лекарственных средств. Доступно по: https://grls.minzdrav.gov.ru/Grls_View_v2.aspx?routingGuid=da624460-36a0-47be-bf46-850be407fc42

⁵ Коллегия Евразийской экономической комиссии. Решение от 3 ноября 2016 года № 89. «Об утверждении правил исследований биологических лекарственных средств Евразийского экономического союза» (с изменениями на 22 января 2025 года). Доступно по: https://docs.cntd.ru/document/456026116

⁶ Коллегия Евразийской экономической комиссии. Решение от 11 августа 2020 г. № 100 «О Фармакопее Евразийского экономического союза». (в редакции Решений Коллегии Евразийской экономической комиссии от 25.10.2022 № 10, от 25.06.2024 № 75). Доступно по: https://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_359911/

⁷ European Pharmacopoeia 11.0.04/2022:0164 corrected 11.0 «Smallpox vaccine (Live)». Доступно по: https://pheur.edqm.eu/home (дата обращения: 11.05.2025)

About the authors

Anastasia V. Muhacheva

Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products

Author for correspondence.
Email: muhacheva@expmed.ru
ORCID iD: 0000-0003-0769-6867

Chief expert of viral vaccines laboratory

Россия, 127051, Moscow

Ekaterina V. Baranova

Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products

Email: baranovaev@expmed.ru
ORCID iD: 0009-0001-7598-8936

2 category expert of viral vaccines laboratory

Россия, 127051, Moscow

Marina P. Bogyantseva

State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

Email: bogryantseva@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-0467-5024

Cand. Sci. (Biol.), Chief of biological and technological control department

Россия, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

Elena A. Nechaeva

State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

Email: nechaeva@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-6901-7738

Cand. Sci. (Med.), Deputy director general for science and production

Россия, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

Margarita P. Smolina

State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being

Email: smolina_mp@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0009-0005-1859-7065

Chief of the development and control laboratory the immunobiological medicines cell culture department

Россия, 630559, Koltsovo, Novosibirsk Region

Karine A. Sarkisyan

Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products

Email: sarkisyan@expmed.ru
ORCID iD: 0000-0003-0445-7086

Cand. Sci. (Med.), Chief of the viral vaccines laboratory

Россия, 127051, Moscow

Snezhana S. Jandimirova

Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products

Email: yandimirovass@expmed.ru
ORCID iD: 0009-0008-8196-5926

leading expert of viral vaccines laboratory

Россия, 127051, Moscow

Elena A. Shubina

Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products

Email: shubinaea@expmed.ru
ORCID iD: 0009-0007-9535-9145

Laboratory engineer of viral vaccines laboratory

Россия, 127051, Moscow

References

Supplementary files