Comparative study of MDCK and CaCo-2 cell lines for influenza virus isolation

Full Text

Введение Глобальный надзор за гриппом осуществляется Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) с 1947 г., однако высокий уровень изменчивости вирусов гриппа, связанный с быстрым накоплением приобретенных мутаций и селективным отбором наиболее приспособленных штаммов в организме хозяина, делает гриппозную инфекцию одной из наиболее экономически значимых и трудно контролируемых и в настоящее время. ВОЗ выделение вирусов гриппа признано золотым стандартом в диагностике гриппозной инфекции [1]. Только исследование выделенных вирусов дает возможность следить за их изменчивостью и ежегодно отбирать актуальные штаммы для включения в состав противогриппозных вакцин. В последние годы произошел практически полный отказ от использования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) - традиционной модельной системы для выделения вирусов гриппа из проб от людей, так как установлено, что вирусы, выделенные на РКЭ, изменяют свои характеристики. Адаптация вирусов к РКЭ приводит к утрате сайтов гликозилирования поверхностных белков вируса, изменению сродства к рецепторам на клеточной поверхности, изменению антигенных характеристик и появлению мутаций, изменяющих свойства как поверхностных, так и внутренних белков вируса гриппа [2]. В связи с этим значительно возрастает значение клеточных линий в качестве модели, пригодной для выделения и дальнейшего исследования вирусов гриппа. Неоспоримое лидерство принадлежит клеткам почки собаки линии (MDCK), полученной S. Madin и N. Darby в 1958 г. [3]. Одна из сублиний этих клеток - MDCK II -отличалась по некоторым признакам большей поляризо-ванностью и дифференцировкой по сравнению с сублинией MDCK I и позже обнаружила высокую чувствительность к репродукции вирусов гриппа всех подтипов [4]. На мембране клеток MDCK представлены рецепторы как птичьего а-2,3, так и человеческого а-2,6 типов, что позволяет поддерживать репродукцию вирусов гриппа различного происхождения [5]. Важным фактором при работе с вирусами гриппа является возможность быстро и четко визуализировать результаты вирусной репродукции в световом микроскопе, которые проявляются в развитии цитопатического действия (ЦПД). Однако не все вирусы гриппа могут эффективно выделяться на клетках MDCK, в связи с чем были созданы генно-инженерные варианты клеток стабильно экспрессирующие человеческую CMP-N-ацетилнейраминат:P-галактозид а-2,6 сиалилтрансферазу - фермент, который приводит к сверхэкспрессии рецепторов человеческого а-2,6 типа на поверхности клеток. В настоящее время созданы следующие клеточные линии: MDCK-SIAT [6], MDCK ST6 Gal 1 [7], MDCK-SIAT7 [8], а также линия клеток почки зеленой мартышки Vero-SIAT1 [9]. Линия MDCK-SIAT с повышенным уровнем рецепторов а-2,6 Gal исследована на эффективность выделения вирусов гриппа из клинических образцов от человека и показала высокий уровень изоляции вирусов, причем последовательность НА1 субъединицы гемагглютинина оставалась генетически стабильной после серии пассажей на клетках MDCK-SIAT1 - признак, который часто изменяется в клетках MDCK или куриных эмбрионах [2]. Важным является тот факт, что линии клеток MDCK не экспрессируют фермент, необходимый для протеоли-за вирусного НА на две субъединицы: НА1 и НА2, и для успешной адсорбции и проникновения вируса гриппа в клетку необходимо присутствие экзогенного трипсина в культуральной жидкости. Одно из наиболее ранних сообщений об использовании клеток аденокарциномы человека, полученной в 1983 г. Pinto и соавт. [10], относится к 1998 г. [11]. С того времени, когда O. Zhirnov и H.D. Klenk [12] обнаружили уникальную особенность клеток СаСо-2 осуществлять протеолиз гемагглютинина вируса гриппа на НА1 и НА2, который происходил в клетках на поздних стадиях внутриклеточного транспорта вирусного НА в транссети аппарата Гольджи и участках плазматической мембраны, интерес среди вирусологов к этой клеточной линии значительно возрос. Дифференцированность и поляризация клеток СаСо-2 позволяют вирусу гриппа наиболее эффективно инфицировать клетки и осуществлять выход зрелых вирусных частиц через апикальную поверхность [13]. Кроме того, наличие эндогенной про-теазы, позволяющей проводить заражение клеток без добавления трипсина, делает эти клетки незаменимыми при работе с вирусами гриппа. Вирусы гриппа, как и в клетках MDCK, вызывают в клетках СаСо-2 развитие ЦПД и выход НА-вируса в культуральную жидкость. Присутствие на мембране клеток СаСо-2 рецепторов обоих типов - как человеческого а-2,6, так и птичьего а-2,3 - позволяет проводить работу с вирусами различного происхождения. Цель данной работы - сравнение чувствительности двух сублиний клеток СаСо-2 и клеток MDCK к вирусам гриппа и оценка эффективности выделения вирусов гриппа из клинических образцов в клетках СаСо-2 и MDCK. Материалы и методы Вирусы гриппа. В работе использовали следующие вирусы гриппа из коллекции музея вирусов гриппа ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России: А/Новосибирск/ 4/04 (H3N2); Д/Санкт-Петербург/5/09 (H1N1)pdm09; A/Cвинья/1976/31(H1N1); А/Брисбен/59/07 (H1N1); Л/Брисбен/10/07 (H3N2); Л/Курица/Курган/5/05 (H5N1). Клеточные линии. В работе использовали два варианта клеток ободочной кишки человека (СаСо-2): линию, полученную из Коллекции клеточных культур Института цитологии РАН и обозначенную как СаСо-2(1), и линию, полученную из Австрии (Green Hills) и обозначенную как 41 Рис. 1. Морфология клеток карциномы ободочной кишки человека сублиний СаСо-2 (2) (а и в) и СаСо-2 (1) (б и г). а - монослой клеток СаСо-2 (2) с признаками дифференцировки; б -слабодифференцированный монослой клеток СаСо-2 (1); в - цитопати-ческие изменения в монослое клеток сублинии СаСо-2 (2) и г - в сублинии СаСо-2 (1), вызванные вирусом пандемического гриппа А/Санкт-Петербург/5/09 (H1N1)pdm09. Ув. 200. СаСо-2(2). Линия CaCo-2(2) (ATCC, США) была любезно предоставлена для исследования А.Ю. Егоровым (Green-Hills, Австрия). Культивирование клеток проводили в питательных средах ЕМЕМ или альфа- МЕМ с добавлением 5% фетальной сыворотки (ф. с.). Клетки почки собаки линии МDСК, полученные из референс-центра ВОЗ (CDC, Атланта, США), были адаптированны к росту на среде ЕМЕМ или альфа-МЕМ с добавлением 2% ф. с. Пересев клеток проводили на 6-7-е сутки с кратностью 1:3 (клетки СаСо-2) и 1:5 (клетки МDСК). Отторжение клеток от поверхности флакона осуществляли с помощью раствора версена с добавлением химопсина. Материалы для выделения вирусов гриппа. Материалы для выделения вирусов гриппа (назофарингеальные мазки и секционные материалы) получены из больниц и поликлиник Санкт-Петербурга, а также из базовых вирусологических лабораторий Федерального центра по надзору за гриппом. Выделение вирусов проводили в клеточной культуре MDCK, полученной из референс-центра ВОЗ (CDC, Атланта, США), по методике, приведенной в [1], и клетках СаСо-2(2). Монослой CaCo-2 формировался медленнее, чем монослой MDCK, и работу с СаСо-2 начинали на 2-е сутки после полного формирования монослоя. Выделение на культуре клеток CaCo-2 проводили сходным образом, однако в поддерживающую среду не вносили трипсин. Реакцию гемагглютинации (РГА) ставили по методике, рекомендованной ВОЗ, с использованием 0,75% взвеси человеческих эритроцитов группы 0 (I) [1]. Определение апоптоза проводили по методике, описанной в [14]. Инфекционную активность вирусов гриппа на культуре клеток изучали согласно методике, рекомендованной ВОЗ и приведенной в [1]. Расчет ТЦИД50 проводили по методу L. Reed и H. Muench [15]. Результаты Изучение чувствительности двух вариантов клеточной линии СаСо-2. Ранние эксперименты по изучению чувствительности клеток СаСо-2 и МDСК к вирусам гриппа А проводили с использованием варианта СаСо-2(1), который получен из Института цитологии РАН. Клетки, культивируемые на среде ЕМЕМ + 5% ф. с., имели морфологию хорошо дифференцированных, поляризованных клеток. После пересева клетки росли в виде островков, образованных полигональными клетками, и к 4-6-м суткам после пересева островки сливались, образуя плотный монослой с признаками дифференцировки в виде крупных пузырчатых клеток и четко очерченных пустот в монослое. При сравнительном титровании на клетках МDСК (с добавлением трипсина) и СаСо-2(1) (без добавления трипсина) двух вирусов гриппа А/Новосибирск/4/04 (H3N2) и вируса птичьего гриппа А/Курица/Курган/5/05(H5N1) получили одинаковые результаты: 5-5,5 ^ТЦД50 для обоих вирусов на обеих клеточных линиях. Позже клетки СаСо-2(1) перевели на питательную среду альфа-МЕМ + 5% ф. с. С увеличением пассажей на этой среде у клеток СаСо-2(1) стали наблюдать признаки изменения морфологии - клетки становились более распластанными и менее дифференцированными, и только к 5-6-м суткам после пересева монослой клеток уплотнялся и клетки приобретали вид многогранников, при этом пересевались клетки без образования островков (рис. 1). Превращение клеток СаСо-2(1) из высокодифференцированных в менее дифференцированные отразилось на их чувствительности к вирусам гриппа А. Титры всех исследуемых вирусов на клетках СаСо-2(1) были несколько ниже, чем на клетках МDCК и на начальных пассажах на среде ЕМЕМ (табл. 1). Работу продолжили на другом варианте клеток СаСо-2(2), полученных из Австрии. Данная линия клеток, культивируемая на среде альфа-МЕМ + 5% ф. с., длительное время сохраняет все признаки дифференцировки: полигональная форма клеток от начала до конца пересева, формирование на следующие сутки после пересева островков клеток, сливающихся в плотный монослой с характерными признаками дифференцировки (см. рис. 1). При проверке чувствительности этой линии клеток к вирусам гриппа А/Санкт-Петербург/5/09 (H1N1)pdm09 и А/Брисбен/10/07 (TON2) установили идентичные результаты по сравнению с таковыми клеток линии МDСК (5,2-5,7 ^ТЦД50 для обоих вирусов). При заражении как клеток линии СаСо-2(1), так и линии СаСо-2(2) вирусом гриппа А/Санкт-Петербург/5/09 (H1N1)pdm09 через 18-20 ч после заражения происходила индукция апоптоза, которая наблюдалась в виде деградации ядерного хроматина после окрашивания клеток красителем Hoechst-33258 (рис. 2). Т аблица 1 Чувствительность (в ^ТЦД^/мл) клеточных линий MDCK и CaCo-2(1) к вирусам гриппа птиц, свиней и человека Клеточная линия/ вирус гриппа А/Свинья/1976/31 (H1N1) А/Брисбен/59/07 (H1N1) А/СПб/5/09 (H1N1pdm-09) А/Брисбен/10/07 (H3N2) А/Курица/Курган/5/05 (H5N1) MDCK 4,5 4,7 5,3 5,6 6,2 CaCo-2 3,7 3,7 4,3 4,4 5,4 Примечание. При титровании вирусов гриппа на клеточной линии CaCo-2 трипсин в среду не вносили. 42 MDCK CaCo-2 Рис. 2. Состояние ядер клеток сублинии СаСо-2 (2). Окрашивание красителем Hoechst 33258 (люминесцентная микроскопия). а - незараженные клетки; б, в - деградация хроматина в результате апоптоза, индуцированного в клетках вирусом гриппа А/Санкт-Петербург/5/09 (H1N1)pdm09. Ув. 450, с иммерсией. Проведенная работа по клонированию клеток СаСо-2 двух линий показала, что все 6 клонов, полученных из линии СаСо-2(1), сохраняли характеристику родительской линии, т. е. были менее дифференцированными, а чувствительность к вирусу гриппа А/Санкт-Петербург/5/09 (H1N1)pdm09 сохранилась на прежнем уровне (на 1 lg ТЦД50 ниже, чем на клетках MDCK). В то же время все 6 клонов, полученных от линии СаСо-2(2), сохранили свою дифференцированность, а 3 клона поддерживали репродукцию вируса гриппа А/Санкт-Петербург/5/09 (H1N1)pdm09 на два порядка выше, чем в родительской линии и клетках MDCK. Учитывая полученные результаты, работу по сравнению эффективности выделения вирусов гриппа А и В из клинических материалов провели с использованием линии клеток СаСо-2(2). Выделение вирусов пандемического гриппа из клинических образцов от больных. Для оценки эффективности выделения вирусов гриппа на клетках MDCK и СаСо-2(2) отобрали 30 проб, в которых присутствие РНК пандемического гриппа А (H1N1)pdm09 было подтверж- Рис. 3. Распределение титров вирусов гриппа В, выделенных на клеточных линиях MDCK и CaCo-2. По горизонтали - титр вирусов; по вертикали - количество штаммов. дено методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Получили следующие результаты: использование клеток MDCK позволило выделить 10 вирусов гриппа, а в клетках СаСо-2(2) выделили 9 вирусов. Титры ГА-вирусов, выделенных на обеих клеточных линиях, были низкими (1:4 и ниже), однако последующие 1-2 пассажа увеличивали титры ГА-вирусов на клетках MDCK до 1:161:32 и на клетках СаСо-2(2) до 1:8-1:16. Невысокую эффективность выделения вируса H1N1pdm09 можно объяснить прежде всего биологической особенностью циркулирующего вируса, имеющего слабое сродство к клеточным линиям как MDCK, так и особенно к клеткам человеческого происхождения, по сравнению с таковой вирусов эпидемического гриппа подтипов A(H1N1) и A(H3N2). Более того, наличие в пробах вирусной РНК, обнаруженной с помощью ПЦР, еще не свидетельствует о присутствии полноценного инфекционного вируса, способного к репродукции в клетках. Тем не менее результаты выделения вируса пандемического гриппа на клетках СаСо-2(2) были сравнимы с результатами, полученными на клетках MDCK. Выделение вирусов пандемического гриппа из постмортальных материалов. Выделение вирусов проводили из 30 образцов постмортального материала, в которых обнаружили вирусную РНК методом ПЦР. Результаты выделения в клетках MDCK оказались полностью отрицательными, тогда как при использовании клеток СаСо-2 удалось выделить 4 вируса пандемического гриппа. Титры ГА-вируса были также низкими, но после дополнительных 2 пассажей титры увеличились до 1:8-1:32. Необходимо отметить, что выделение вирусов гриппа из постмортальных образцов редко дает положительные результаты из-за многоступенчатой обработки секционных материалов, которая приводит к значительным потерям инфекционных вирусных частиц. Таблица 2 Сводные данные по эффективности выделения вирусов гриппа на культурах клеток MDCK и СаСо-2(2) Клеточная линия Выделение вирусов гриппа из проб от больных (назофарингеальные мазки), количество штаммов Титры в РГА с эритроцитами человека при выделении вируса Выделение вируса гриппа из постмортальных материалов, количество штаммов грипп A(H1N1)pdm09 (п* = 30) Ct** < 28 грипп В (п = 40) Ct < 28 грипп A(H1N1)pdm09 грипп В грипп A(H1N1)pdm09 (п = 30) Ct < 25 MDCK 10 28 < 1:4 1:4-1:128 0 CaCo-2(2) 9 26 < 1:4 1:4-1:64 4 Примечание. * п - общее количество ПЦР-позитивных проб, отобранных для выделения вирусов гриппа на клеточных линиях MDCK и СаСо-2; **Ct - значение порогового цикла в реакции ПЦР в режиме реального времени, при котором детектировали вирусную РНК в исследуемых пробах/образцах. 43 Выделение вирусов гриппа В из клинических материалов от больных. Для выделения вируса гриппа В отобрали 40 материалов, в которых методом ПЦР определили наличие РНК вируса гриппа В. На клеточной линии MDCK выделили 28 вирусов и 26 вирусов на клетках СаСо-2(2), т. е. результаты выделения были сравнимы на обеих клеточных линиях. Большинство вирусов выделялось уже при первичном заражении и имело высокие титры ГА, хотя количество вирусов с высокими титрами ГА на клетках СаСо-2(2) было ниже, чем на клетках MDCK (рис. 3). Общий результат эффективности выделения вирусов гриппа А и В из клинических образцов от больных на двух клеточных линиях MDCK и СаСо-2(2) можно считать практически одинаковым (табл. 2). Следует отметить более высокий процент выделения вируса гриппа В на обеих клеточных линиях по сравнению с таковым пандемического вируса гриппа А. Положительным моментом является выделение 4 вирусов пандемического гриппа из постмортальных материалов только на клетках СаСо-2 при отрицательном результате на клетках MDCK. Обсуждение Клетки СаСо-2, полученные в 1983 г. M. Pinto и соавт. [10] из аденокарциномы ободочной кишки человека, обнаружили спонтанную дифференцировку в энтериоциты при формировании сомкнутого монослоя. В связи с этим эту клеточную линию широко используют в качестве модели для изучения дифференцировки и регуляции интестинальных функций. Клетки СаСо-2 характеризуются по-ляризованностью, о чем свидетельствуют работы по изучению эндоцитоза и экзоцитоза биологически активных белков при использовании ингибиторов микротрубочек и актина [13]. Уже самые ранние работы на клетках СаСо-2 обнаружили ее гетерогенность, которая проявлялась в характеристике клонов, полученных из родительской линии, различающихся по морфологии, интенсивности роста, продукции факторов роста и других биологически активных молекул, проницаемости, электрической устойчивости и другим маркерам [16]. Результаты работ последних лет подтвердили гетерогенность клеток СаСо-2, а также влияние на клоновую изменчивость длительности и условий культивирования [17]. Эти данные могут объяснить наши результаты при работе с линией СаСо-2(1), клетки которой при увеличении количества пассажей на среде альфа-МЕМ приобрели менее дифференцированный вид с потерей по-ляризованности и соответственно снижением чувствительности к вирусам гриппа А. Результаты исследований, которые провели на другой линии клеток СаСо-2(2), сохранившей свою дифферен-цированность при переводе на другую питательную среду, убедительно подтверждают факт существования и распространенности среди исследователей линий клеток СаСо-2, различающихся по степени дифференци-ровки и стабильности. Неучтенные факторы при культивировании клеток могут способствовать снижению дифференцировки клеток и соответственно снижению чувствительности к ряду вирусов. Австрийскую линию клеток СаСо-2(2), имеющую стабильные характеристики дифференцировки, успешно использовали при выделении вирусов гриппа А и В. Результаты по эффективности выделения на клетках СаСо-2(2) вирусов гриппа А и В мало отличаются от результатов, полученных на клетках МDСК. В то же время на клетках СаСо-2(2) выделили 4 вируса пандемического гриппа А из постмортальных материалов при отрицательном результате на клетках МDСК. В последние годы появилось несколько сообщений об использовании клеток СаСо-2 для работы с вирусами гриппа А различного происхождения. Об успешном применении клеток СаСо-2 при выделении вирусов гриппа от свиней сообщили C. Chiapponi и соавт. [18]. Об использовании клеток СаСо-2 для работы с низкопатогенными штаммами вируса птичьего гриппа было сообщено A. Jahangir и соавт. [19]: 17 низкопатогенных вирусов репродуцировались в высоких титрах и образовывали бляшки в клетках СаСо-2 более эффективно, чем в клетках MDCK, при этом не отмечено фенотипических и генотипических изменений на протяжении 10 пассажей. Однако эти клетки оказались менее чувствительными при выделении птичьих вирусов, чем куриные эмбрионы. Высокая чувствительность клеток СаСо-2, сравнимая с таковой клеток МDСК, к вирусам гриппа А различного происхождения: А(ШШ) эпидемического, А(ШШ) пандемического и А(Й5Ш), отмечена в работе [20]. Наши результаты, а также результаты, полученные другими исследователями, позволяют сделать вывод о несомненной ценности и значимости клеточной линии аденокарциномы ободочной кишки человека линии СаСо-2. Особенный интерес клетки СаСо-2, которые являются дифференцированными энтероцитами человека, могут представлять при изучении кишечных вирусов, и в частности при кишечных формах гриппозной инфекции. Авторы выражают благодарность канд. мед. наук М.П. Грудинину и другим сотрудникам лаборатории молекулярной вирусологии за ПЦР-диагностику в режиме реального времени.

References

Supplementary files