Taxonomic status of the Burana virus (BURV) (Bunyaviridae, Nairovirus, Tamdy group) isolated from the ticks Haemaphysalis punctata Canestrini et Fanzago, 1877 and Haem. concinna Koch, 1844 (Ixodidae, 10 Haemaphysalinae) in Kyrgyzstan

Full Text

Прототипный штамм LEIV-Krg760 вируса Бурана (BURV - Burana virus) был изолирован из клещей Haemaphysalis punctata Canestrini et Fanzago, 1877 (Ixodidae, Haemaphysalinae), собранных с коров в апреле 1971 г. в Токмакском заказнике в восточной части Чуйской долины у подножья Киргизского хребта, в окрестностях пос. Бурана (43°10’ с. ш., 74°40’ в. д.) в Кыргызстане [1-3]. Всего в 1961-1975 гг. изолированы пять штаммов при обследовании 9377 иксодовых клещей Haema- physalis punctata Canestrini et Fanzago, 1877 и Haem. concinna Koch, 1844 (Ixodidae, Haemaphysalinae) [4-7]. Согласно предварительным данным, BURV не способен агглютинировать эритроциты птиц и млекопитающих, не имеет антигенных связей ни с одним из 59 арбовирусов различных антигенных групп из сем. Togaviridae, Flaviviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Orthomyxoviridae, Arenaviridae и 35 негруппированными вирусами [1-3]. В настоящей работе методом полногеномного секвенирования (next-generation sequencing) определена полная последовательность генома BURV. На основании молекулярно-генетического и филогенти- ческого анализа установлена принадлежность BURV к роду Nairovirus сем. Bunyaviridae. В составе рода Nairovirus BURV филогенетически наиболее близок к вирусу Тамды (TAMV), который так же, как и BURV, экологически связан с иксодовыми клещами пастбищных и пустынных биоценозов [8]. Ранее показано, что TAMV является прототипным представителем новой филогенетической группы Tamdy в составе рода Nairovirus [9]. Таким образом, в результате проведенной работы BURV классифицирован как новый вирус группы Tamdy рода Nairovirus сем. Bunyaviridae. Материалы и методы Прототипный штамм вируса Бурана (LEIV-Krg760) получен из Государственной коллекции вирусов (ГКВ) РФ при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизированной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4 сут) мышей забивали в соответствии с правилами этичного содержания и использования лабораторных животных. Рис. 1. Результаты филогенетического анализа, проведенного методом максимального правдоподобия (maximum likelihood) на основе сравнения частичных последовательностей каталитического центра РНК-зависимой РНК- полимеразы (RdRp) вирусов рода Nairovirus. Справа - наименования антигенных и филогенетических групп. Здесь и на рис. 2, 3: BURV обозначен черным кружком. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 700 мкл лизирующего буфера RLT (QIA- GEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделяли набором «RNeasy mini kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) из 350 мкл буфера в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориме- тра Qubit (Invitrogen, США). Подготовка библиотек и секвенирование. Для депле- ции рибосомальной РНК использовали набор GenRead rRNA depletion Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для получения кДНК 50 нг деплециро- ванной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85 С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с помощью набора «MinElute PCR Purification Kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор «TruSeq DNA Sample Prep Kits v2» (Illumi- na, США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза «QIAxcel Advanced System» (QIA- GEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом полимерно-цепной реакции в реальном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (BioRad, США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Рис. 2. Результаты филогенетического анализа, проведенного методом ближайшего соседа на основе выравнивания полноразмерных аминокислотных последовательностей полипротеина-предшественника оболочечных белков GnGc (M-сегмент) вирусов рода Nairovirus. Здесь и на рис. 3: в качестве внешней группы для анализа использовали вирусы родов Phlebovirus, Hantavirus и Orthobunyavirus. Секвенирование ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq (Illumina, США) с помощью набора «MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)» в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов осуществляли, используя программу «CLC Genomics Workbench 5.5» (CLC bio, США). Сборку контигов проводили de novo с параметрами, установленными по умолчанию. Предварительный поиск гомологичных последовательностей осуществляли с применением сервиса BLASTX (http://blast.ncbi.nlm. nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» (DNAstar, США). Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму ClustalW. Генетическую дистанцию определяли по модели p-dis- tance с попарным удалением гэпов. Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили с помощью программы MEGA5 по методу максимального правдоподобия (maximum likelihood) с 1000-кратным бутстреп-тестированием. Результаты и обсуждение В результате обработки данных полногеномного сек- венирования РНК из материала, содержащего BURV (ткани мозга зараженных мышей), получили последовательности трех неизвестных фрагментов длиной 12 117, 4406 и 1789 н. о. соответственно. Результаты проведенного биоинформационного анализа (количество и расположение открытых рамок считывания (ОРС) и поиск в on-line сервисе BLASTX) позволили заключить, что полученные последовательности принадлежат ранее не описанному вирусу, геном которого обладает гомологией (30-40%) с вирусами рода Nairovirus (сем. Bunyaviridae). Таким образом, определена практически полная последовательность генома BURV, полностью включая кодирующие области генома и большую часть 3’- и 5’- нетранслируемых регионов. Геном BURV представлен тремя сегментами: L-семент (размер ОРС 11 919 н. о., кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу RdRp); M-сегмент (размер ОРС 4035 н.о., кодирует полипротеин-предшественник оболочеч- ных белков GnGc); S-сегмент (размер ОРС 1482 н.о., кодирует белок нуклеокапсида N). Структура генома BURV, включая количество и размер кодируемых вирусных белков, является канонической для вирусов рода Nairovirus, на основании чего BURV классифицирован как новый представитель данного рода [10]. Рис. 3. Дендрограмма, построенная методом ближайшего соседа на основе выровненных аминокислотных последовательностей белка нуклеокапсида (N) вирусов рода Nairovirus. Вирусы рода Nairovirus объединены в 10 антигенных или филогенетических групп, из которых три (Issyk- Kul, Artashat и Tamdy) впервые описаны нами ранее [9, 11, 12]. Вирусы одной филогенетической (антигенной) группы независимо от географии выделения обладают общими экологическими особенностями, что является подтверждением их эволюционной близости (рис. 1) [10-13]. Так, вирусы группы Hughes (вирусы Faral- lon, Punta Salinas, Raza и Caspiy (CASV)) экологически связаны с морскими птицами и их аргасовыми (Argasidae) клещами рода Ornithodoros (Carios) [10, 14]. Вирусы группы Sakhalin (Sakhalin (SAKHV), Paramushir (PRMV)) в основном связаны с гнездовыми колониями морских птиц и их облигаными паразитами - иксодовы- ми (Ixodidae) клещами Ixodes spp. [15]. Вирусы групп Qalyub (вирусы Qalyub, Chim (CHlMV), Geran (GeRv)), Artashsat (ArTSV) и Thiafora (Erve (ERVEV) ассоциированы с норово-убежищными биоценозами (главным образом грызуны и аргасовые клещи) [16, 17]. Патогенные для человека и животных наировирусы Крымской-Конго геморрагической лихорадки (CCHFV), болезни овец Найроби (Nairobi sheep diseases (NDV)) и Дугбе (Dugbe (DUGV) связаны преимущественно с иксодовыми клещами родов Ixodes, Dermacentor и Hyalomma [10]. Генетическая дивергенция между наировирусами разных филогенетических групп, рассчитанная на основе сравнения полных аминокислотных последовательностей вирусных белков, достигает 60-75%. При этом наиболее консервативным регионом является каталитический центр РНК-зависимой РНК-полимеразы, структура которой является достаточно консервативной для всех вирусов с сегментированным РНК геномом отрицательной полярности, включая вирусы сем. Bunyaviridae. Гомология BURV по частичной аминокислотной последовательности консервативного региона RdRp (мотивы «преА» и «А») достигает 82% с TAMV, тогда как с вирусами других филогенетических групп гомология BURV составляет в среднем 60%. Гомология BURV с патогенными для человека ISKV и CCHFV составляет 55 и 57% соответственно. По нуклеотидным последовательностям уровень гомологии данного участка BURV с TAMV составляет 68% и не превышает 45-50% с наировирусами других филогенетических групп. Результаты филогенетического анализа, проведенного для рода Nairovirus на основе аминокислотной последовательности данного участка RdRp, представлены на рис. 1. На дендрограмме, построенной методом максимального правдоподобия, BURV занимает место на филогенетической ветви группы Тамды (Tamdy), сформированной тремя изолятами TAMV. Уровень гомологии полных аминокислотных последовательностей RdRp BURV и TAMV несколько ниже и составляет 59%. Наибольшее эволюционное расхождение BURV, определяемое по степени генетической дивергенции RdRp (35% гомологии), наблюдали с вирусами CCHFV, DUGV и Хазара (HAZV). M-сегмент BURV, как и у других наировирусов, имеет одну протяженную ОРС, кодирующую полипротеин- предшественник оболочечных гликопротеидов Gn и Gc [10]. Размер полипротеина-предшественника BURV составляет 1344 а.о. Зрелые белки Gn и Gc наировирусов образуются из полипротеина- предшественника в результате сложного процессинга, в котором участвуют клеточные пептидазы [18, 19]. В полипротеине-предшественнике GnGc BURV с использованием on-line сервиса NetNGlyc 1.0 предсказаны 11 потенциальных сайтов гликозилирования, из которых только пять находятся в пределах региона, соответствующего зрелым белкам Gn и Gc. Уровень гомологии полипротеина-предшественника BURV с TAMV составляет 45%. С вирусами других филогенетических групп данное значение не превышает 27%. Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе сравнения полноразмерного полипротеина- предшественника, демонстрируют положение BURV на ветви TAMV, что согласуется с результатами, полученными для RdRp (рис. 2). S-сегмент наировирусов кодирует единственный белок нуклеокапсида (N) [10, 20]. Размер белка N BURV составляет 493 а.о., что соответствует среднему размеру данного белка у других наировирусов (480-500 а.о.). Уровень гомологии полной аминокислотной последовательности белка N BURV с TAMV достигает 44%. С другими наировирусами уровень гомологии BURV составляет 30-32%. Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе выровненных последовательностей белка нуклеокапсида буньявирусов животных, представлен на рис. 3. Значение гомологии белка нуклеокапсида BURV с TAMV является наименьшим из всех вирусных белков, однако филогенетическое положение BURV на ветви Tamdy сохраняется. Шесть штаммов BURV изолированы из собранных со скота клещей Haem. punctata (5 штаммов) и Haem. concinna (1 штамм) в 1971, 1973-1975 гг. Виру- софорность клещей составляла 2,2-2,6% [21]. Таким образом, BURV приурочен к пастбищным биоценозам с участием в циркуляции клещей Haem. punctata и Haem. concinna. Филогенетически BURV наиболее близок к TAMV, который экологически также связан с иксодовыми клещами пастбищных и пустынных биоценозов. Учитывая филогенетическую близость BURV к TAMV и их общие экологические особенности, BURV классифицировали как новый вирус группы Tamdy в составе рода Nairovirus. Зондирование территорий Средней Азии проводили в рамках программы по биобезопасности и изучению биоразнообразия в разных экосистемах Северной Евразии, а также для пополнения базы данных ГКВ РФ [6, 22-25].

References

Supplementary files