Genetic Characterization of viruses from the antigenic complex Tyuleniy (Flaviviridae, Flavivirus): Tyuleniy virus (TYUV) isolated from ectoparasites of colonial seabirds - Ixodes (Ceratixodes) uriae White, 1852, ticks collected in the high latitudes of Northern Eurasia - and Kama virus (KAMV) isolated from the Ixodes lividus Roch, 1844, collected in the digging colonies of the middle part of Russian Plane

Full Text

Прототипный штамм LEIV-6C (депонент в Государственной коллекции вирусов № ГКВ-526; авторы Львов Д.К., Громашевский В.Л.) вируса Тюлений (TYUV -Tyuleniy virus) был изолирован при зондировании территории Дальнего Востока из клещей Ixodes (Ceratixodes) uriae White, 1852, собранных в августе 1969 г. на острове Тюлений в Охотском море (48°29' с.ш., 144°38' в.д.), в гнездовье чистиковых (Alcidae Leach, 1820) птиц [1-5]. На основании данных электронной микроскопии вирус был отнесен к сем. Flaviviridae, а в результате серологических исследований - к роду Flavivirus, антигенному комплексу Тюлений [2, 5]. К этому же антигенному комплексу относится и вирус Мибан (MEAV - Meaban virus), который изолирован из клещей Ornithodoros (Alectorobius) maritimus Vermeil, Marguet, 1967, собранных в июле 1981 г. в гнездовьях серебристых чаек (Larus argentatus Pontoppidan, 1763) в заливе Морбиан французской провинции Бретань (47°31' с.ш., 02°56' з.д.) [6, 7]; Саумарец-риф (SREV - Saumarez Reef virus), изолированных из клещей O. capensis, которые были собраны в августе 1974 г. в гнездовье крачек (Sterna fuscata Linnaeus, 1766) на коралловом острове Саумарец-Риф в австралийской провинции Квинсленд (22°00' ю.ш., 153°30' в.д.) [8, 9]; Гаджетс-Галли (GGyV - Gadget’s Gully virus), изолированный из клещей I. uriae, которые были собраны в декабре 1976 г. в гнездовье пингвинов на островах Маккуори (Австралия) в южной части Тихого океана между Новой Зеландией и Антарктидой (54°30' ю.ш., 159°00' в.д.) [10]. Однако позднее MEAV и SREV были включены в группу передаваемых клещами вирусов морских птиц (STBVG - seabird tick-borne virus group), а GGYV - в группу передаваемых клещами вирусов млекопитающих (MTBVG - mammalian tick-borne virus group) [11-13]. Вирус Кама (KAMV - Kama virus) был изолирован из клещей I. lividus Roch, 1844 - облигатных паразитов ласточек-береговушек (Riparia riparia Linnaeus, 1758), собранных в августе 1989 г. в Центральной части Русской равнины, на островах Волжско-Камского плеса Куйбышевского водохранилища (Республика Татарстан) (55°20' с.ш., 49°40' в.д.) [14]. Штаммы TYUV изолированы из клещей I. uriae в бассейнах Охотского, Берингова и Баренцева морей, причем зараженность иксодид этим вирусом в тихоокеанской части ареала в 4,5 раза выше, чем в атлантической (табл. 1) [15-22]. В настоящей работе мы провели полногеномное сек-венирование геномов TYUV и KAMV. На основании результатов молекулярно-генетического и филогенетиче ского анализа мы показали, что KAMV является новым вирусом в составе комплекса TYUV, принадлежащего экологической STBVG, род Flavivirus, сем. Flaviviridae. Материалы и методы Прототипные штаммы вирусов TYUV/LEIV-6G и KAMV/LEIV-Tat20776 были получены из Государственной коллекции вирусов РФ ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России в виде лиофилизи-рованной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4-е сутки) мышей забивали в соответствии с правилами этичного содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНЕ. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 700 мкл лизирующего буфера RLT (QIAGEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе Tys-sueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделили набором “RNeasy mini kit” (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) из 350 мкл буфера в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориметра Qubit (“Invitrogen”, США). Подготовка библиотек и секвенирование. Для депле-ции рибосомальной РНК использовали набор “GenRead rRNA depletion Kit” (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для получения кДНК 50 нг деплециро-ванной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (“Thermo Scintific”, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (“Promega”, США). Инкубировали при 25°С в течение 10 мин, далее при 42°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С в течение 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора “NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с использованием набора “MinElute PCR Purification Kit” (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIA-cube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор “TruSeq DNA Sample Prep Kits v2” (“Illumi-na”, США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза “QIAxcel Advanced System” (QIA-GEN, Германия). Молярность полученных библиотек Таблица 1 Зараженность TYUV клещей I. uriae White, 1852 в гнездовьях чистиковых птиц (Alcidae Leach, 1820) в бассейнах Охотского, Берингова и Баренцева морей Результат обследования клещей Дальний Восток Европа бассейн Охотского моря (Сахалинская область) бассейн Берингова моря бассейн Баренцева моря (Мурманская область) Камчатский край Чукотский автономный округ остров Тюлений (48°29' с.ш., 144°38' в.д.) остров Ионы (56°24' с.ш., 143°23' в.д.) остров Арий Камень (Командорские острова) (55°13' с.ш., 165°48' в.д.) побережье пролива Беринга (64°50' с.ш., 173°10' з.д.) остров Харлов близ Кольского полуострова (68°49' с.ш., 37°19' в.д.) Количество штаммов 9 4 22 0 2 Уровень вирусофорности, % 0,066 0,205 0,116 0 0,022 Итого... обследовано клещей 35 2 количество штаммов 34 569 8994 уровень вирусофорности, % 0,101 0,022 19 Дендрограмма, построенная методом присоединения соседей, на основе сравнения полноразмерных последовательностей генома флавивирусов. определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (2-кратно SsoFast EvaGreen Supermix (“Bio-Rad”, США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомендациям, изложенным в руководстве “Sequencing Library qPCR Quantification Guide” (“Illumina”, США). Секвенирование ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq (“Illumina”, США) с использованием набора “MiSeq Reagent Kits v2 (300PE)” по схеме, описанной ранее [23, 24]. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов проводили, используя программу cLc Genomics Workbench 5.5 (“ClC bio”, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью сервиса BLASTX (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ “Lasergene Core Suite” (“DNAstar”, США). Выравнивание последовательностей осуществляли по алгоритму ClustalW [25]. Генетическую дистанцию определяли по модели p-distance с частичным удалением гэпов. Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили, используя программу MEGA5, по методу ближайшего соседа (модель p-distance) с 1000-кратным бутстреп-тестированием [26]. Результаты и обсуждение Геномы TYUV и KAMV секвенировали в составе индексированной ДНК-библиотеки. Полученные данные индексировали и триммировали для удаления последовательностей, принадлежащих адаптерам, с помощью программы CLC Genomics Workbench 5.5. Обработан ные таким образом последовательности (риды) были собраны de novo с установленными по умолчанию параметрами. В результате обработки в составе полученных контигов обнаружили протяженные последовательности длиной 10 688 н.о. для KAMV и 10 269 н.о. для TYUV Полученные последовательности соответствовали практически полноразмерным геномам изучаемых вирусов (GenBank ID: kF815939, KF815940). Размер и структура генома KAMV и TYUV являются характерной для вирусов рода Flavivirus (Flaviviridae). Геном флавивирусов представлен одноцепочечной РНК позитивной полярности, которая имеет одну открытую рамку считывания (ОРС), кодирующую полипротеин -предшественник структурных и неструктурных белков. Длина ОРС у TYUV и KAMV имеет схожий размер - 3422 и 3419 а.о. соответственно. Длина ОРС у других вирусов ST-BVG также составляет около 3420 а.о. Интересно отметить, что у флавивирусов MTBVG полипротеин-предшественник имеет чуть меньший размер и включает в среднем 3415 а.о. Генетическая дистанция, рассчитанная на основе полноразмерных последовательностей генома флави-вирусов, которые передаются клещами (“клещевые флавивирусы”), представлена в табл. 2. Генетически флавивирусы являются достаточно гетерогенной группой. Уровень дивергенции между клещевыми флавивирусами и передающимися комарами (“москитные флавивирусы”) составляет в среднем уровне. Критерием разделения клещевых вирусов на отдельные серогруппы в соответствии с их антигенными свойствами можно считать, вероятно, уровень дивергенции от 15 до 35%. Генетическая дистанция между STBVG и MTBVG составляет в среднем 42% на нуклеотидном и аминокислотном уровне (см. табл. 2). При этом данное значение характерно для всех вирусов STBVG. Внутри STBVG все вирусы между собой имеют практически равный уровень гомологии, который не превышает 70% по нуклеотидным и 85% по аминокислотным последовательностям. Штамм TYUV / LEIV-61C, секвенированный в настоящей работе, имеет 86% гомологии по нуклеотидам и около 97% на аминокислотном уровне со штаммом TYUV/USA, изолированным на Тихоокеанском побережье США. Такой высокий уровень гомологии говорит о постоянном обмене вирусами между восточным и западным побережьями Тихого океана. Одной из основных задач настоящей работы является установление таксономического положения впервые секвенированного вируса KAMV. На нуклеотидном уровне KAMV имеет практически одинаковый уровень гомологии (70%) с вирусами, входящими в STBVG (MEAV, SREV, TYUV). На аминокислотном уровне KAMV обладает гомологией 74% с вирусами TYUV и SREV и 78% с MEAV соответственно. Таким образом, мы можем заключить, что KAMV является новым самостоятельным видом рода Flavivirus (Flaviviri- 20 Таблица 2 Генетическая дистанция (p-distance), рассчитанная на основе выровненных полноразмерных последовательностей генома «клещевых» флавивирусов Вирус № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Kama 1 0,31 0,31 0,30 0,31 0,42 0,41 0,41 0,42 0,41 0,41 0,41 0,41 0,42 0,42 0,42 0,41 0,42 0,42 Tyleniy/ LEIV-6C 2 0,26 0,14 0,31 0,31 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41 0,42 0,41 0,41 0,41 0,41 Tyuleniy (США) 3 0,26 0,03 0,32 0,31 0,41 0,41 0,42 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41 0,42 0,41 0,42 0,41 0,42 Meaban (Франция) 4 0,22 0,26 0,26 0,31 0,41 0,41 0,41 0,42 0,41 0,41 0,41 0,41 0,42 0,42 0,42 0,41 0,42 0,42 Saumarez Reef (Австралия) 5 0,26 0,26 0,26 0,26 0,41 0,42 0,41 0,42 0,42 0,41 0,41 0,41 0,42 0,42 0,41 0,41 0,42 0,42 Alkhumra 6 0,42 0,42 0,43 0,43 0,43 0,08 0,40 0,31 0,29 0,29 0,29 0,29 0,34 0,32 0,29 0,29 0,34 0,30 Kyasanur forest disease 7 0,42 0,42 0,43 0,43 0,43 0,03 0,40 0,31 0,29 0,29 0,29 0,29 0,33 0,31 0,29 0,29 0,33 0,29 Kadam (Уганда) 8 0,43 0,42 0,43 0,42 0,43 0,40 0,40 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41 0,41 Powassan 9 0,43 0,43 0,44 0,43 0,44 0,24 0,23 0,41 0,31 0,31 0,31 0,31 0,34 0,15 0,31 0,31 0,33 0,31 Tickborne encephalitis 10 0,42 0,42 0,43 0,42 0,43 0,21 0,20 0,41 0,23 0,18 0,15 0,15 0,34 0,31 0,20 0,18 0,33 0,18 Greek goat encephalitis 11 0,42 0,42 0,43 0,42 0,43 0,21 0,21 0,41 0,24 0,08 0,17 0,17 0,34 0,32 0,20 0,16 0,33 0,16 Tickborne encephalitis / EK328 12 0,42 0,42 0,43 0,42 0,43 0,20 0,20 0,41 0,23 0,05 0,07 0,04 0,34 0,31 0,20 0,17 0,32 0,17 Tickborne encephalitis / Est 13 0,42 0,42 0,43 0,42 0,43 0,21 0,20 0,41 0,23 0,05 0,07 0,01 0,33 0,31 0,19 0,17 0,32 0,17 Karshi 14 0,44 0,44 0,44 0,44 0,44 0,29 0,29 0,42 0,29 0,28 0,29 0,28 0,28 0,34 0,34 0,34 0,35 0,34 Deer tick 15 0,43 0,43 0,44 0,43 0,44 0,24 0,24 0,42 0,05 0,24 0,25 0,24 0,24 0,29 0,32 0,31 0,33 0,31 Omsk 16 0,43 0,43 0,43 0,42 0,43 0,21 0,21 0,41 0,24 0,10 0,11 0,09 0,09 0,28 0,25 0,21 0,33 0,21 Spanish sheep encephalitis 17 0,42 0,42 0,43 0,42 0,43 0,21 0,20 0,41 0,24 0,08 0,07 0,07 0,07 0,29 0,24 0,11 0,32 0,10 Gadgets Gully 18 0,43 0,43 0,43 0,44 0,43 0,28 0,28 0,41 0,27 0,28 0,28 0,28 0,28 0,30 0,28 0,28 0,28 0,33 Louping ill 19 0,43 0,43 0,43 0,43 0,43 0,21 0,21 0,41 0,24 0,08 0,08 0,08 0,08 0,29 0,25 0,11 0,05 0,29 Примечание. Правая верхняя часть - данные для нуклеотидных последовательностей, левая нижняя - данные для аминокислотных последовательностей. Серым фоном выделены вирусы, которые передаются клещами морских птиц (STBVG). № п/п - последовательность. dae), входящим в STBVG. Результаты филогенетического анализа, проведенного на основе полноразмерных геномов флавивирусов, представлены на рисунке, где видно, что KAMV вместе с MEAV, SREV и TYUV образует филогенетическую ветвь, отдельную от остальных клещевых вирусов MTBVG. Внутри STBVG KAMV также формирует отдельную ветвь, соответствующую самостоятельному виду в составе данной группы. Экология TYUV изучена в восточной и западной частях ареала. При серологическом обследовании около 2500 птиц с помощью непрямой РСК на Дальнем Востоке положительные результаты наиболее часто были получены для толстоклювых (Uria lomvia Linnaeus, 1758) и тонкоклювых (U. aalge Pontopiddan, 1763) кайр и топорков (Fratercula cirrhata Pallas, 1769), реже - для берингийских бакланов (Phalacrocorax pelagicus Pallas, 1811), краснолицых бакланов (Ph. urile Gmelin, 1789), серокрылых чаек (Larus glaucescens Naumann, 1840), обыкновенных моевок (Rissa tridactyla Linnaeus, 1758), глупышей (Fulmarus glacialis Linnaeus, 1761), куликов (Scolopacidae Vigors, 1825) [16-20, 27-29]. Серологические данные указывают на основное значение в поддержании природного очага среди птиц кайр U. aalge, U. lomvia, топорков и в меньшей степени - бакланов, чаек и глупышей. Находки антител (АТ) у куликов - круглоносого плавунчика (Pholaropus lobatus Linnaeus, 1758) и турухтана (Philomachus pugnax Linnaeus, 1758) - свидетельствуют о возможности заноса клещей I. uriae и вируса в Южное полушарие, тогда как чистиковые птицы в Северном и пингвины в Южном полушариях, вероятно, реализуют перенос клещей и вируса в циркумполярных направлениях [28-31]. Учитывая ежегодные миграции в Южное полушарие, полагаем, что TYUV может заноситься в этом направлении до ареала I. uriae в колониях пингвинов. У 10% взрослых и 90% молодых морских котиков (Callorhinus ursinus Linnaeus, 1758) на Командорских островах обнаружены АТ к TYUV, что свидетельствует об активном вовлечении этих животных в циркуляцию вируса. Находки АТ у коров и коренного населения Командорских островов [15, 16] указывают на участие ко 21 маров (вероятнее всего, Aedes communis, Ae. punctor и Ae. excrucians) в циркуляции TYUV в летний период с трансмиссивной передачей. TYUV изолирован на ЮгоВосточном побережье Чукотки (63° с.ш., 180° в.д.) от бе-рингийского (американского длиннохвостого) суслика (Citellus (Urocitellus) parryi Richardson, 1825). Это еще одно свидетельство выплеска вирусной популяции на материк с вовлечением грызунов в циркуляцию вируса. В дальневосточной части ареала, включая биологическую трансмиссию комарами [16], о такой возможности свидетельствуют и положительные результаты серологического обследования коренного населения тундры прибрежных районов Чукотки (8,4%), лесотундры побережий Охотского и Берингова морей (4,2%), тайги на острове Сахалин (7,4%) [16]. Специфические противовирусные АТ (до 9,1%) обнаружены и у коренного населения (саами, коми, ненцы) в тундровом поясе на побережье Кольского полуострова. Положительные результаты также отмечены у КРС (28,1%), круглоносого плавунчика, пуночки (Plectrophenax nivalis Linnaeus, 1758), турухтана, грызунов - полевок-экономок (Microtus oeconomus Pallas, 1776) [16]. Эти находки свидетельствуют о выплеске вирусной популяции из мест гнездовий на материк и в атлантической части ареала. В этом процессе принимают участие комары Ae. communis, Ae. punctor, Ae. excrucians - их зараженность в конце июля - начале августа достигает 0,3% в местах гнездовий морских птиц и 0,1% на побережье. Экспериментальная инфекция TYUV на модели Ae. aegypti показала наличие вируса с 4-х по 31-е сутки после инокуляции. Титры вируса достигали 1,5-2 lg LD50/10 мкл на 4-17-е сутки, 3-3,5 lg LD50/10 мкл на 23-27-е сутки и снижались до 1,5 lg LD50/10 мкл к 31-м суткам. Трансмиссивная передача в процессе кормления вирусофорных комаров на новорожденных мышах установлена с 7-х по 19-е сутки после заражения. В комарах Culex pipiens molestus вирус обнаруживали на 5-21-е сутки (период наблюдения) после заражения в титрах 1-2 lg LD50/10 мкл [17]. При экспериментальном заражении обыкновенных моевок (Rissa tridactyla Linnaeus, 1758), серебристых чаек (Larus argentatus Pontoppidan, 1763) и толстоклювых кайр (Uria lomvia Linnaeus, 1758) развивались клинические признаки поражения ЦНС, иногда с летальным исходом [32]. У человека при посещении мест сбора полевого материала развивалось общелихорадочное заболевание [33]. Зараженность нимф и личинок I. uriae в 2-20 раз меньше по сравнению с таковой имаго. Зараженность имаго самок и самцов (имеют рудиментарный гипостом, не напитываются кровью) одного порядка [16]. Эти данные свидетельствуют о наличии трансстадийной и трансовариальной передачи TYUV (~5%) в процессе метаморфоза I. uriae. Вместе с тем TYUV не был изолирован от I. signatus Birula, 1895. Занос TYUV из Северного в Южное полушарие осуществляется птицами примерно 20 видов, главным образом куликами (например, камнешарками Arenaria interpres Linnaeus, 1758), которые гнездятся на севере Азии, а зимуют в Австралии и Новой Зеландии. Буревестники (Puffinus pacificus Gmelin, 1789) гнездятся в Южном полушарии и совершают ежегодный круиз вдоль побережий Тихого океана вплоть до Северной Евразии и Северной Америки [20, 34]. Генетическая близость TYUV и KAMV пока не имеет четкого объяснения, поскольку в настоящее время не существует экологических связей между популяциями чистиковых птиц севера умеренного пояса и в субаркти-ке с популяциями ласточек-береговушек в центральной части Русской равнины. Изоляция KAMV, антигенно и генетически близкого TYUV, свидетельствует о древних связях флавивирусов с иксодовыми клещами - облигатными паразитами колониальных птиц и птиц норово-убежищных биоценозов - не только на прибрежной океанической, но и на материковой частях ареала [15, 20, 29, 34-36]. MEAV и SREV, генетически близкие TYUV, в эволюционном плане, вероятно, являются промежуточными звеньями между передаваемыми клещами вирусами морских птиц и позднее сформировавшимися передаваемыми клещами вирусами млекопитающих [11, 12]. Основной переносчик TYUV в субарктике - I. ur-iae, адаптированный к морским птицам, в условиях субтропиков-тропиков замещается аргасовыми клещами комплекса Ornithodoros capensis и в ряде случаев Argas loculosum [19]. Северная граница ареала клещей рода Argas ограничена изотермой июля 15-20°С, а рода Ornithodoros - 20-25°С в Европе и 25-30°С в Азии [21, 22, 29, 37]. Переносчик KAMV I. lividus имеет транспалеаркти-ческое распространение - от Британских островов на западе до Японских островов на востоке, а с севера на юг - от 62° с.ш. до 43° с.ш. Этот вид клещей отличается экстразональной приуроченностью и обитает в гнездах ласточек-береговушек (Riparia riparia Linnaeus, 1758) в обрывах мягкого грунта по берегам рек и озер в поясах тайги, лиственных лесов, лесостепи и степи. I. lividus яв-ляется типичным гнездово-норовым паразитом и строго соответствует жизненному циклу хозяина: после прилета птиц в мае в гнездах на них нападают личинки; в июне нимфы питаются на птенцах; самки имаго (самцы не питаются) тоже питаются на птенцах и в начале августа откладывают яйца, из которых в конце августа появляются личинки [38]. Зондирование территорий высоких широт и Русской равнины проводили в рамках Программы по биобезопасности и изучению биоразнообразия в экосистемах Северной Евразии [21, 22, 29, 39].

References

Supplementary files