Evaluation of the anti-neuraminidase antibodies in clinical trials of the live Influenza vaccine of the A(H5N2) subtype

Full Text

В связи с широким обсуждением вопроса о критериях оценки иммуногенности живой гриппозной вакцины (ЖГВ) особенно при регистрации новых вакцинных препаратов весьма актуальными являются исследования, касающиеся расширения спектра применяемых для этих целей иммунологических и серологических методик, что неоднократно отмечалось на совещаниях ВОЗ [1]. Одним из таких направлений являются оценка уровня АТ (АТ) к минорному поверхностному гликопротеину вируса гриппа нейраминидазе (NA) после инфекции и вакцинации и изучение защитного действия этих АТ. Как известно, антиней-раминидазные АТ не уступают антигемагглютинирующим по значению в защите людей от гриппозной инфекции, являясь эффективными в ограничении распространения вируса в организме, снижении тяжести переносимого заболевания или предупреждении его развития [2, 3, 4]. Однако отсутствие стандартных методик определения содержания иммуноглобулинов указанной специфичности, а также недостаток экспериментальных и клинических данных затрудняют количественный подход к оценке их защитной эффективности, а следовательно, и разработку критериев иммуногенности гриппозных вакцин. Ранее мы уже изучали формирование сывороточных АТ к NA штамма А/Калифорния/07/09(ШШ) у лиц, привитых моновалентной пандемической ЖГВ [5]. Для этой цели использовали разработанную на основе авторского диагностического реассортантного штамма модификацию твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности (РИНА), способствующую повышению специфичности и чувствительности методики, обладающую необходимыми предпосылками для внедрения в широкую практику. В текущем исследовании с помощью твердофазной РИНА изучали формирование АТ к NA вакцинного штамма А/17/утка/ Потсдам/86/92(Ш№) в сыворотках крови у волонтеров, принимавших участие в клинических испытаниях ЖГВ, разработанной для профилактики гриппа подтипа Н5 [6], а также охарактеризовали уровень АТ к NA подтипа N2 у них до прививки. Материалы и методы Исследуемые сыворотки крови получены при клиническом изучении серий моновалентной ЖГВ на основе вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) производства ФГУП НПО «Микроген», которое провели в соответствии с протоколом исследования J№ ВГЖ-00/004/2006, согласованным с директором ГИСК им. Л.А. Тарасеви-ча. Вакцинный штамм А/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) представлял собой 7:1 реассортант, унаследовавший ген гемагглютинина (HA) от апатогенного птичьего вируса А/утка/Потсдам/1402-6/86(H5N2) и остальные гены, кодирующие внутренние, неструктурные белки и NA, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Ш№) [7]. Изучение препарата, осуществлявшееся на клинической базе Военного госпиталя № 1137, включало два этапа. Первый этап проводили на 18 добровольцах, которые получили двукратную прививку ЖГВ А(Ш№) в дозе 6,9 lg ЭИД50/0,5 мл. Во время второго этапа изучения 41 доброволец был двукратно привит ЖГВ А(И5№) в дозе 8,3 lg ЭИД50/0,5, при этом в исследование включили группу плацебо (п = 7). Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) проводили с вакцинным штаммом в 96-луночных панелях для серологических реакций с использованием 0,75% взвеси эритроцитов человека по описанным методикам [8]. Для удаления термолабильных ингибиторов сыворотки прогревали при 56-58 С в течение 30 мин. Для удаления термостабильных ингибиторов гемагглютинации исследуемые сыворотки обрабатывали экстрактом NA холерных вибрионов (Denka Seiken Co., LTD). Титры антигемагглютинирующих АТ выражали как величину, обратную наибольшему разведению сыворотки, при котором наблюдали торможение гемагглютинации. Реакция микронейтрализации (РН). РН с вакцинным вирусом A(H5N2) проводили в клеточной культуре MDCK по ранее опубликованной методике [8]. Титр сыворотки определяли как величину, обратную наивысшему разведению образца, дающему при длине волны 630 нм оптическую плотность (ОП), которая превышает пороговое значение, равное полусумме ОП для клеточного и вирусного контроля. За достоверную сероконверсию принят 4-и более кратный прирост титра нейтрализующих АТ. Твердофазную РИНА проводили по протоколу, основанному на опубликованной ранее методике C. Lambre и соавт. [9]. Для повышения специфичности методики выявления АТ к NA вакцинного вируса использовали диагностический реассортантный штамм RN2/57-human A(H7N2), подготовленный на основе вируса гриппа лошади А/лошадь/Прага/1/56(H7N7), содержащий NA от холодоадаптированного донора аттенуации А/ Ленинград/134/17/57(Ш№). При выборе рабочей дозы вируса исследовали зависимость выхода продукта сиалидазной реакции, осуществляемой NA диагностического реассортанта при оптимальном pH буферного раствора, от концентрации вируса, выраженной в гемаг-глютинирующих единицах (АЕ). Таким образом, определили следующие условия постановки твердофазной РИНА: доза вируса 128 АЕ/50 мкл; время протекания реакции 1 ч. Титр сывороточных антинейраминидазных АТ определяли как величину, обратную разведению образца, дающему 50% ингибирование активности NA. Сероконвер-сией считали увеличение титра АТ в 2 раза и более [10]. Рис. 1. Распределение титров сывороточных АТ к NA штамма Л/Ленинград/134/17/57(И2К2) у 66 волонтеров 18-60 лет до прививки ЖГВ A(H5N2) (2006-2007). Данные твердофазной РИНА с диагностическим реассортантным штаммом A(H7N2). По оси абсцисс - уровень АТ (в титрах) к NA подтипа N2 в сыворотках крови у волонтеров; по оси ординат - доля (в %) лиц с различным уровнем антинейраминидазных АТ Статистическая обработка результатов. Для представления полученных данных использовали следующие показатели описательной статистики: среднегеометрический титр (СГТ), медиану (Me) и квартили (Q1; Q3). Статистическую значимость различий оценивали с помощью статистического пакета «Statistica» (версия 6,0) при использовании критерия Манна-Уитни, критерия знаковых рангов Уилкоксона или двустороннего варианта точного критерия Фишера. Мерой силы статистической взаимосвязи при анализе номинальных данных служил критерий V Крамера. Проверяемые критериями нулевые гипотезы отвергали при p < 0,05. После ревакцинации Результаты Данные о формировании антинейраминидазных АТ после двукратной иммунизации ЖГВ на основе штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) на каждой стадии клинических испытаний были получены с помощью твердофазной РИНА с диагностическим реассортантом RN2/57-human A(H7N2) после того, как была подтверждена специфичность методики. Так, после двукратной вакцинации штаммом А/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) в дозе 6,9 lg ЭИД50/0,5 мл у исходно серонегативных волонтеров наблюдали статистически значимый прирост СГТ антигемагглютинирующих АТ к вирусу A(H5N2) (р<0,03; п=18). В то же время ни в одном из образцов, полученных после иммунизации ЖГВ подтипа A(H5N2), титр антигемагглютинирующих АТ к штамму А/лошадь/Прага/1/56(H7N7) не превысил порога чувствительности метода (данные не показаны), что свидетельствовало об антигенной отдаленности HA вируса А/ лошадь/Прага/1/56(H7N7) от шифтового варианта вируса гриппа А подтипа Н5 и обосновывало объективность результатов твердофазной РИНА даже в присутствии в исследуемых сыворотках крови АТ к главному поверхностному антигену вакцинного штамма. У обследованных в 2006-2007 гг. волонтеров в возрасте от 18 до 60 лет еще до прививки моновалентной ЖГВ подтипа A(H5N2) отметили уровень АТ к NA штамма А/ЛенинграД/134/17/57(H2N2) (рис. 1). Так, у 33,3% обследованных (95% доверительный интервал (ДИ) 23,2-45,3%) титр антинейраминидазных АТ по данным твердофазной РИНА с диагностическим реассортантом RN2/57-human A(H7N2) превышал значение 1:20. СГТ АТ для указанной группы из 22 волонтеров составил 1:158. Распределение лиц с высоким титром АТ к N2 по группам добровольцев, иммунизированных моновалентной ЖГВ в первой и второй фазах клинических испыта- 9 8 7g> 6Н 5 4 3- |~д~| До вакцинации Рис. 2. Формирование антинейраминидазных АТ у волонтеров 18-60 лет, двукратно привитых моновалентной ЖГВ A(H5N2), в зависимости от исходного уровня АТ к NA вакцинного штамма. а - серонегативные волонтеры (п = 26), б - серопозитивные (п = 15). Данные твердофазной РИНА с диагностическим реассортантом A(H7N2). По оси ординат - титры АТ (в log2) к NA вакцинного штамма A/17/утка/ Потсдам/86/92(H5N2). На диаграмме размаха отмечены медиана, верхняя и нижняя квартили, максимальное и минимальное значения. * - p = 0,002; ** - p = 0,13. ний, не было равномерным: 4 (22,2%) из 18 и 15 (36,6%) из 41 соответственно. Располагая точной информацией о дате рождения 18 участвовавших в первой фазе клинических испытаний добровольцев, мы провели анализ влияния возрастного фактора на допрививочный уровень антинейраминидазных АТ указанной специфичности. Согласно критерию Манна-Уитни средний титр АТ к N2 штамма А/Ленинград/134/17/57(H2N2) среди лиц, родившихся в 1957-1962 гг. (Me = 1:169; п = 4), статистически значимо выше аналогичного показателя у обследованных 1963-1985 гг. рождения (Me = 1:5, п = 14): выборочная статистика критерия и достигнутый уровень значимости составили U = 0; Z = 3,2645 и p = 0,001 соответственно. На первом этапе клинических испытаний, направленном на изучение безвредности и ареактогенности вакцины, не включавшем группу для препарата плацебо, ЖГВ вводили интраназально в дозе 6,9 lg ЭИД50/0,5 мл (см. таблицу). Согласно непараметрическому критерию Уил-коксона двукратная прививка с интервалом в 21 день не только эффективно стимулировала выработку нейтрализующих АТ к штамму А/l7/утка/Потсдам/86/92(H5N2) (T = 0; Z = 3,2958; p = 0,001), но и привела к статистически значимому увеличению титров антинейраминидаз-ных АТ к гомологичному антигену (T = 6; Z = 2,4006; p = 0,016). Второй этап клинических испытаний проводили по аналогичному прививочному плану с увеличением дозы вируса до 8,3 lg ЭИД50/0,5 мл и участием группы плацебо (см. табл. 1). Согласно РН и твердофазной РИНА исходный иммунологический статус у вакцинированных добровольцев и волонтеров, получивших препарат плацебо, не различался (критерий Манна-Уитни, p > 0,05). Спустя 3 нед после второй прививки титр нейтрализующих АТ к штамму А(Ш№) в вакцинной группе был статистически значимо выше соответствующего показателя на момент начала клинических испытаний (критерий Уилкоксона: T = 0; Z = 4,5407; р < 0,0001). Последнее утверждение справедливо и для титров АТ к N2 вакцинного штамма (критерий Уилкоксона: T = 49; Z = 3,5068; р = 0,0005). У лиц, получивших препарат плацебо, не Формирование сывороточных АТ к поверхностным гликопротеинам штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5П2) у волонтеров 18-60 лет, двукратно привитых моновалентной ЖГВ «Орвакс». По данным РН и твердофазной РИНА с диагностическим реассортантом A(H7N2) Нейтрализующие АТ к штамму А/17/утка/ Потсдам^те^^) АТ к NA штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) Препарат п титр до вакцинации Me (Q1;Q3) log2 титр после ревакцинации Me (Q1;Q3) log2 количество (%) 4-кратного прироста титров и более титр до вакцинации Me (Q1;Q3) log2 титр после ревакцинации Me (Q1;Q3) log2 количество (%) 2-кратного прироста титров и более Вакцина: 6,9 lg ЭИД50/0,5 мл 8,3 lg ЭИД50/0,5 мл Плацебо 18 2,3' (2,3; 2,3) 4,3' (3,3; 4,3) 9 (50,0) 2,32 (2,3; 3,4) 3,32 (2,3; 6,7) 6 (33,3) 41 2,33 (2,3; 2,3) 3,33 (2,3; 4,3) 13 (31,7) 2,84 (2,3; 6,2) 4,14 (2,3; 6,3) 8 (19,5) 7 2,35 (2,3; 3,3) 2,35 (2,3; 3,3) 0 (0) 3,36 (2,3; 7,1) 2,96 (2,3; 6,6) 0 (0) 1 -p = 0,001 (тест Уилкоксона: T = 0; Z = 3,2958); 2 -p = 0,016 (тест Уилкоксона: T = 6; Z = 2,4006); 3 -р < 0,0001 (тест = 4,5407); 4 - р = 0,0005 (тест Уилкоксона: T = 49; Z = 3,5068); 5 - р = 0,18 (тест Уилкоксона: T = 0; Z = 1,3416); 6 - р = 0,07 : 0; Z = 1,8257). Примечание Уилкоксона: T = 0; Z (тест Уилкоксона: T = отметили изменений соответствующих серологических показателей. Совпадение результатов двух тестов (РН и твердофазная РИНА) в плане выявления или невыявления серокон-версий в одних и тех же парах сывороток крови вакцинированных добровольцев составило 73,2%, при этом у 19,5% обследованных достоверный прирост уровня сывороточных АТ выявляли только в РН, а 7,3% привитых лиц демонстрировали иммунный ответ исключительно к NA вакцинного штамма. Достигнутый уровень значимости (p = 0,084; п = 41) при применении двустороннего варианта точного критерия Фишера, несмотря на его близость критическому значению, не позволил отвергнуть нулевую гипотезу об отсутствии статистической взаимосвязи между сероконверсиями к двум поверхностным гликопротеинам вируса. Однако при расширенном статистическом анализе все же выявили статистическую взаимосвязь средней силы между достоверными приростами титров сывороточных нейтрализующих и антинейраминидазных АТ (критерий V Крамера = 0,33; p = 0,04); вероятность обнаружения сероконверсий антинейраминидазных АТ оказалась статистически значимо (в 3,59 (95% ДИ: 1,01-12,8) раза) выше у лиц с достоверным приростом уровня нейтрализующих АТ, чем у тех, кто его не имел. Отметим, что статистическая взаимосвязь между сероконверсиями антигемагглютинирующих и антинейраминидазных АТ к вакцинному штамму отсутствовала (р = 1; п = 41; данные не показаны). Далее привитых добровольцев, участвовавших во второй стадии клинических испытаний моновакцины A(H5N2), разделили на подгруппы на основании допри-вивочного титра АТ к NA вакцинного штамма: с титром, превышающим значение 1:20 (п = 15), и с низким уровнем антинейраминидазных АТ (п = 26). Формирование АТ к NA вируса гриппа в ответ на двукратное интрана-зальное введение ЖГВ А(И5№) в зависимости от исходного иммунологического статуса прививаемых представлено на рис. 2. Статистически значимое увеличение титра сывороточных антинейраминидазных АТ через 3 нед после ревакцинации наблюдали у исходно серонегативных лиц (выборочная статистика критерия Уил-коксона и достигнутый уровень значимости составили T = 1; Z = 3,1099; p = 0,002), но не у волонтеров, имеющих фон АТ к NА штамма А/Ленинград/134/17/57(Ш№) в титрах, значения которых варьировали от 1:30 до 1:420 (T = 33; Z = 1,5335; p = 0,13). Достоверный прирост уровня антинейраминидазных АТ в ответ на двукратную прививку выявили у 23,1% серонегативных и 13,3% серопозитивных лиц, хотя точный критерий Фишера не подтвердил статистической взаимосвязи между частотой сероконверсий и исходным иммунологическим статусом у волонтеров согласно твердофазной РИНА с реассортантом RN2/57-human A(H7N2) (p = 0,69). Расхождение суждений, выносимых о наличии обратной зависимости интенсивности АТ ообразования от исходного уровня иммуноглобулинов, специфичных к NA, на основании критериев Уилкоксона и Фишера, объясняется огрублением данных при переходе от шкалы отношений (титр АТ) к менее мощной номинальной шкале (отсутствие/ наличие сероконверсии). Таким образом, результаты проведенных клинических испытаний показали, что двукратная прививка моновалентной ЖГВ подтипа A(H5N2) активно стимулировала выработку АТ не только к HA, но и к NA вакцинного штамма. Имела место обратная зависимость интенсивности антителобразования к NA аттенуированного вируса от исходного уровня иммуноглобулинов указанной специфичности. Обнаружили статистическую взаимосвязь между сероконверсиями, выявленными в твердофазной РИНА и РН, т.е. антинейраминидазных и нейтрализующих АТ. Обсуждение ВОЗ продолжает рекомендовать разработку самого широкого спектра противопандемических мер, включающих и разработку вакцин против различных антигенных вариантов высокопатогенных вирусов гриппа А(ШШ) [11], циркулирующих среди диких и домашних птиц и вызывающих периодические вспышки заболевания у людей с высокой смертностью - до 60%. Текущее исследование было посвящено всесторонней оценке им-муногенности прототипа пандемической ЖГВ подтипа H5 на основе штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) в клинических испытаниях. Двукратная прививка различными дозами моновалентной ЖГВ подтипа A(H5N2) не только активно стимулировала выработку сывороточных нейтрализующих АТ, но и привела к статистически значимому увеличению титров АТ к NA вакцинного штамма с 19,5-33,3% сероконвер-сий. Различия в частоте достоверного прироста уровня антинейраминидазных АТ для двух этапов клинических испытаний отражали различия в проценте сероконверсий нейтрализующих АТ. Отчасти их можно объяснить неоднородностью иммунологического фона групп вакцинированных волонтеров по данным твердофазной РИНА с образцами сывороток крови, взятыми до прививки, а также обратной зависимостью интенсивности АТ ообразования к NA вакцинного штамма от исходного уровня иммуноглобулинов указанной специфичности, проявившейся при отсутствии праймирования населения вирусами H5. Показанная зависимость выраженности иммунного ответа к минорному поверхностному гликопротеину вируса гриппа от специфики иммунологического фона в прививаемой группе лиц согласовывается с данными других исследователей [12] и должна учитываться при разработке тактики вакцинации. Ранее в наших исследованиях было показано отсутствие взаимосвязи между приростом уровня антигемагглюти-нирующих АТ и приростом содержания АТ к NA N1, выявляемыми с помощью твердофазной РИНА [5]. В текущем исследовании выявили статистическую взаимосвязь средней силы между сероконверсиями нейтрализующих и антинейраминидазных АТ; вероятность обнаружения се-роконверсий в твердофазной РИНА оказалась несколько выше у лиц с достоверным приростом титров нейтрализующих АТ, чем у тех, кто его не имел. Этот факт находит объяснение в более широком спектре иммуноглобулинов (куда входят и антинейраминидазные АТ), способных наряду со штаммоспецифическими АТ к главному поверхностному антигену вируса внести вклад в наблюдаемый эффект нейтрализации репродукции инфекционного агента в культуре клеток. Тем не менее сочетанное применение РН и твердофазной РИНА более полно характеризует иммунологические изменения в организме привитых. Следует отметить, что аминокислотная последовательность N2 штамма A/Ленинград/134/57(H2N2), выделенного вскоре после внедрения вирусов подтипа A(H2N2) в человеческую популяцию, на 95% была гомологична NA вирусов гриппа птиц А(H5N2) и на 16-17% отличалась по первичной структуре от NA эпидемических изолятов подтипа A(H3N2), циркулировавших в 2009-2011 гг. Несмотря на то что NA аттенуированного вируса A(H5N2) унаследована от холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(н2N2), 1/3 участвовавших в клинических испытаниях волонтеров в возрасте 18-60 лет исходно имели высокие титры антинейраминидазных АТ к вакцинному штамму. Не обладая детальной информацией о возрасте волонтеров, участвовавших во второй фазе клинических испытаний, мы не можем с уверенностью утверждать, какой именно фактор: возможность контакта со штаммами подтипа A(H2N2) в период их циркуляции до 1968 г. или множественность инфекций пришедшими им на смену вирусами гриппа A(H3N2), играл ключевую роль в формировании АТ указанной специфичности. Тем не менее наблюдаемый иммунологический фон может послужить защитой от гриппозной инфекции при возможном возврате в циркуляцию вирусов гриппа подтипа А(Ш№), АТ а к основному антигену которых - HA - у большинства населения отсутствуют. Защитная эффективность антинейраминидазных АТ в условиях смены подтипа HA уже была показана ранее в исследованиях A. Monto и соавт. [4]. Таким образом, в текущем исследовании разработана и апробирована методика оценки уровня сывороточных АТ к NA подтипа N2 вируса гриппа. Реассортантный штамм RN2/57-human A(H7N2), не обладая актуальной N2, тем не менее может быть полезен для более полной оценки праймирующего эффекта аттенуированных штаммов, разрабатываемых против потенциально пандемического гриппа. Показана необходимость учитывать содержание сывороточных антинейраминидазных АТ при разработке тактики вакцинации и оценке эффективности прививочной кампании с точки зрения формирования полноценного и сбалансированного иммунного ответа.

References

Supplementary files