Genetic Characterization of the Rabies Virus Field isolates Detected in Russian Federation within the Period 2008-2011

Abstract

Sixty-three gene N fragments of rabies virus field isolates detected within the period 2008-2011 in different regions of Russian Federation were sequenced. The comparison with previously tested isolates and strains has shown that newly isolated isolates can be placed into five previously described phylogenetic groups: Arctic group, Central Russian group, Eurasian group, Northern European group, and Caucasian group. The Arctic group isolates detected in Komi republic were identical to previously described rabies virus strain from Yakutia. This is the first reliable case of detecting Arctic group rabies virus in European part of Russia.

Full Text

Введение В большинстве регионов России эпизоотическая ситуация по бешенству остается напряженной. На протяжении последних нескольких лет увеличилось число случаев заболевания среди диких животных, домашних плотоядных и сельскохозяйственных животных. Так, в 2010 г. были зарегистрированы 3923 вспышки заболевания [2]. Несмотря на это, к настоящему времени полная картина генетических особенностей отечественных изолятов вируса бешенства отсутствует. Ранее российские изоляты из некоторых регионов были охарактеризованы по гену N И.В. Кузьминым [8, 9] и А.Е. Метлиным [12]. В данной работе анализируются фрагменты гена N63 российских изо-лятов вируса бешенства из разных регионов страны и сравниваются с ранее выявленными на территории Российской Федерации изолятами и штаммами. Материалы и методы В работе использован патологический материал (головной мозг) от животных с подозрением на бешенство, поступающий на исследование в лабораторию бешенства Федерального центра охраны здоровья животных (ФГБУ ВНИИЗЖ, г. Владимир) из региональных лабораторий Российской Федерации. Для сравнительного анализа использовали нуклеотидные последовательности гена N штаммов вируса бешенства из базы данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Характеристика всех штаммов и изолятов вируса бешенства, применявшихся в работе, дана в таблице. Выделение РНК, синтез кДНК и ПЦР-фрагмента гена N осуществляли, как описано ранее [11]. Полученные ампликоны секвенировали с применением праймеров, которые использовались в ПЦР, и набора BigDye Terminator Cycle Sequencing kit (“Applied Biosystems”, США) на капиллярном ДНК-секвенаторе ABI Prism 3100 (“Applied Biosystems”, США). Анализ и выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с использованием пакета программ BioEdit version 7.0.5.2. Филогенетический анализ выполняли с помощью алгоритма neighbor-joining (NJ), встроенного в программу MEGA 3.1 [7]. Для оценки достоверности топологии филогенетического древа был проведен bootstrap-анализ с привлечением 1000 псевдореплик. Результаты и обсуждение При секвенировании ампликонов, полученных в ПЦР, были определены 63 нуклеотидных последовательности фрагмента гена N изолятов вируса бешенства длиной 334 нуклеотида (положение в гене N: 582-915). На рис. 1 представлено древо, отражающее филогенетические отношения штаммов и изолятов вируса бешенства, выделенных в разное время на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья. Анализ древа позволил отнести все исследован- Контактная информация: Чупин Сергей Александрович, канд. биол. наук; e-mail: chupinsergei@yahoo.com. 44 Характеристика изолятов и штаммов вируса бешенства, использованных в работе Изолят/ штамм Регион Хозяин Источник данных Номер доступа в GenBank 48/2005 Республика Башкирия Кошка [11] DQ462433 40/2005 То же Рысь [11] DQ462431 51/2005 '' " Собака [11] DQ462434 41/2005 '' " Корова [11] DQ462432 1132/2009 Белгородская область Лиса Данное исследование JQ434351 1133/2009 То же " То же JQ434352 1139/2009 II II " " " JQ434353 RV1589 II II Кошка [8] AY352456 33/2002 II II Собака [11] AY705419 23/2002 II II Лиса [11] AY705417 41/2002 II II Свинья [11] AY705420 355/2010 Брянская область Волк Данное исследование JQ434337 364/2010 То же Лиса То же JQ434338 365/2010 '' " " " " JQ434339 369/2010 " ,, Собака " " JQ434340 RV262 Лиса [8] AY352457 33/2005 " [11] DQ462429 83/2011 Республика Бурятия Корова Данное исследование JQ434307 125/2009 Владимирская область Лиса То же JQ434312 612/2009 То же " II II JQ434343 613/2009 Собака II II JQ434344 696/2009 Лиса II II JQ434345 211/2010 " ,, Корова II II JQ434315 244/2010 " II II JQ434334 2070f Волгоградская область Лиса [8] AY352484 2072f То же " [8] AY352485 899/2009 Воронежская область " Данное исследование JQ434348 1/2002 То же " [11] AY705407 552/2010 Калинин градская область Данное исследование JQ434341 1410/2008 Республика Коми Северный олень То же JQ434358 1411/2008 То же То же П JQ434359 1350/2008 Краснодарский край Собака П JQ434354 1352/2008 То же " П JQ434355 1353/2008 II II " П JQ434356 1356/2008 II II " П JQ434357 1305f II II Лиса [8] AY352461 10/2005 II II " [11] DQ462422 18/2005 II II Собака [11] DQ462424 RVHK Красноярский край Человек [8] AY352462 Изолят/ штамм Регион Хозяин Источник данных Номер доступа в GenBank 24/2009 Ленинградская область Енотовидная собака Данное исследование JQ434303 25/2009 То же То же То же JQ434305 595/2009 Московская область Лиса II II JQ434342 705/2009 То же " II II JQ434346 821/2009 " " Енотовидная собака II II JQ434347 1552/2008 Нижегородская область Коза II II JQ434360 1564/2008 То же Лиса II II JQ434361 104/2009 II II " II II JQ434308 110/2009 II II " II II JQ434309 111/2009 II II Собака II II JQ434310 217/2009 II II Лиса II II JQ434318 218/2009 II II " II II JQ434319 219/2009 II II " II II JQ434320 220/2009 II II " II II JQ434321 221/2009 II II " II II JQ434322 222/2009 II II " II II JQ434323 223/2009 II II " II II JQ434324 224/2009 II II " II II JQ434325 225/2009 II II " II II JQ434326 226/2009 II II " II II JQ434327 227/2009 II II " II II JQ434328 228/2009 II II " II II JQ434329 229/2009 II II " II II JQ434330 230/2009 II II " II II JQ434331 231/2009 II II " II II JQ434332 232/2009 II II " II II JQ434333 339/2009 II II Собака II II JQ434335 343/2009 II II " II II JQ434336 985/2009 II II Лиса II II JQ434349 990/2009 II II " II II JQ434350 8/2010 II II Кошка II II JQ434300 213/2010 II II Собака II II JQ434316 20/2002 II II Лиса [11] AY702677 623/2003 II II Собака [11] AY705425 184/2009 Новгородская область Енотовидная собака Данное исследование JQ434314 647/2003 Новосибирская область Лиса [11] AY705423 RVHN То же Человек [8] AY353865 RV257 Омская область Лиса [8] AY352464 3665f То же [8] AY352466 RV260 " " " [8] AY352465 3683c " " Корсак [8] AY352468 3678c " " " [8] AY352468 RV1590 Оренбургская Человек [8] AY353874 область 45 Продолжение таблицы Изолят/ штамм Регион Хозяин Источник данных Номер доступа в GenBank 99 То же Кошка [8] AY352473 18/2002 Пензенская область Лиса [11] AY705412 RV245 Псковская область Человек [8] AY352475 RV1596 То же Лиса [8] AY352474 3/2002 " " Енотовидная собака [11] AY705418 188/2002 Рязанская область Корова [11] EF095203 634/2008 Саратовская область " Данное исследование JQ4342299 213/2011 Тверская область Рысь То же JQ434317 96/2002 То же Лиса [11] AY705431 85/2002 " " Енотовидная собака [11] AY705427 RV241 Тульская область Человек [8] AY352477 RV234 То же Собака [8] AY352476 RV299 " " Лиса [8] AY352479 23/2010 Республика Тыва " Данное исследование JQ434302 24/2010 То же Волк То же JQ434304 26/2010 " " Корова " " JQ434306 686cow " " " [8] AY352482 3561d " " Собака [8] AY352481 857r Хабаровский край Енотовидная собака [8] AY352458 304c Читинская область Корсак [8] AY352459 SG21 Республика Якутия Песец [9] EF611828 3510w То же Волк [8] AY352486 SG23 " Песец [9] EF611833 9215HON Венгрия Человек [6] U43025 RV308 Грузия " [8] AY352497 A4795 США, Аляска Собака [8] AY352498 A0906 То же Песец [8] EF611856 1904/2003 Финляндия Лошадь [11] AY705415 113/1988 " Енотовидная собака [11] AY705409 9342EST Эстония То же [6] U43432 9142EST " " " [6] U22476 9339EST " " " [6] U42707 EST/1990 " Лиса [11] AY705429 124/1989 " " [11] AY705411 ные изоляты к 5 генетическим группам. Сравнение с ранее изученными штаммами вируса бешенства показало, что все исследованные изоляты относятся к какой-либо из ранее выделенных групп. И.В. Кузьмин и соавт. [8], изучая изоляты вируса бешенства, выде ленные на территории бывшего СССР, разделили их на несколько групп: A, B, C, D, UG. В другой работе [12] группы российских изолятов описаны как Евразийская, Северная Европейская, Центральная Российская, Кавказская. В обоих исследованиях топология древ совпадает. В данной работе мы будем придерживаться классификации, предложенной А.Е. Метлиным и соавт. [12] как более наглядной, поскольку она отражает географические особенности распространения различных генетических линий вируса бешенства. По результатам филогенетического анализа 15 изо-лятов (из Брянской, Воронежской, Белгородской, Нижегородской, Саратовской областей, Республики Тыва, Республики Бурятия и Краснодарского края) были отнесены к Евразийской группе. Уровень различий между изолятами внутри группы составляет 0%-3,9%. Вновь выявленные изоляты отличаются от ранее изученных не более чем на 1,8%. Обращает на себя внимание тот факт, что в пределах этой группы некоторые изоляты, выделенные в географически удаленных друг от друга регионах, имеют значительное сходство. Например, изоляты 213/2010, 18/2002 и 1634/2008, выделенные в Нижегородской, Пензенской и Саратовской областях соответственно, идентичны друг другу на данном участке генома. К вирусам Центральной группы отнесено 36 изоля-тов из Владимирской, Нижегородской, Московской и Тверской областей. Вновь выделенные изоляты отличаются от ранее изученных не более чем на 2,7%. Филогенетически вирусы Центральной группы близки к европейским штаммам вируса бешенства. Так, изолят RV262 из Брянска имеет 97,3% гомологию со штаммом 9215HON, выделенным в Венгрии. При анализе предсказанной аминокислотной последовательности было установлено, что изоляты Центральной группы обладают характерной особенностью нуклеопротеина - наличием в позиции 217 остатка валина, в то время как все представители остальных филогенетических групп из России имеют в этой позиции остаток изолейцина. Четыре вновь выявленных изолята были отнесены к Северо-Европейской группе. Они отличаются от ранее выделенных вирусов той же группы на 1,5-2,4%. Изоляты из Ленинградской и Новгородской областей идентичны друг другу, а изолят из Калининградской области отличается от них на 0,9%. Как в данной работе, так и в ранее проведенных генетических исследованиях [6, 12] практически все вирусы, выделенные в северо-западных регионах России (Ленинградская, Новгородская, Псковская, Калининградская области), а также в странах Балтии (Эстония, Финляндия), принадлежат к СевероЕвропейской группе. Этот факт противоречит результатам исследований, проведенных с помощью моноклональных антител (МКАТ). Так, М.А. Селимов и соавт. [3] изучали серологические свойства российских штаммов вируса бешенства с помощью МКАТ Р-41. МКАТ Р-41, полученное в результате иммунизации мышей изолятом вируса бешенства от песца из Якутии, селективно реагировало с нуклеокапсидом арктических изолятов этого вируса [13]. Согласно данным работы М.А. Селимова и соавт. [3], все исследованные штаммы, выделенные в Эстонии, Финляндии, Калининградской, Ленинградской и Псковской областях от енотовидных собак и лисиц, реагировали положительно с антителом Р-41. Было выдвинуто пред- 46 Рис. 1. Филогенетическое древо штаммов и изолятов вируса бешенства, построенное на основании нуклеотидных последовательностей фрагмента гена N по алгоритму NJ. К названиям штаммов и изолятов добавлен регион происхождения. Знаком ♦ маркированы изоляты, впервые исследованные в данной работе. Цифрами в узлах древа показаны значения "bootstrap"-анализа; представлены значения, превышающие 70. положение о том, что арктические вирусы были транслоцированы на эту территорию, а затем адаптировались к хозяевам новых видов. Аналогичные результаты с использованием МКАТ Р-41 были получены А.Е. Метлиным и соавт. [10]. По всей видимости, если учесть, что вирусы бешенства из балтийских регионов генетически отличаются от арктических изолятов, МКАТ Р-41 не обладает исключительной специфичностью для вирусов Арктической группы. Возможно, это объясняется аминокислотной заменой аспарагина на глицин в позиции 115 гена N, которой обладают изоляты из обеих рассматриваемых групп по сравнению с вирусами из других филогенетических групп. Замена на аминокислотный остаток глицина могла облегчить позитивную реакцию с МКАТ Р-41 [5]. Из оленеводческого хозяйства Республики Коми поступило на анализ три образца, полученных от северных оленей. Образцы были положительны на бешенство в РИФ и ОТ-ПЦР. Два из них (1410/2008 и 1411/2008) были отсеквенированы по гену N. Сравнительный анализ показал, что данные изоляты идентичны штамму SG23 вируса бешенства, выделенному в Якутии от песца в 1988 г., и характеризуются высоким уровнем гомологии (99,4-99,7%) с другими изолятами, выделенными в Якутии и на Аляске (см. рис. 1), которые, согласно работе И.В. Кузьмина и соавт. [9], относятся к филогенетической группе Арктическая, подгруппе Арктическая-2. Представляет интерес тот факт, что за 20 лет данная линия вируса на исследуемом участке генома не претерпела изменений. Для более подробного анализа изолята 1410/2008 была определена полная последовательность гена N. Сравнение полных последовательностей гена N изоля-та 1410/2008 и SG23 показало, что они отличаются четырьмя нуклеотидами, а по предсказанной аминокислотной последовательности идентичны. Если предположить, что с учетом времени выделения штамм SG23 является предком изо-лята 1410/2008, скорость фиксации замен составляет 1,4 • 10-4 замены на сайт в год. Аналогичное значение для скорости эволюции вирусов бешенства, относящихся к Арктической группе (1,2 • 10-4 замены на сайт в год), было получено И.В. Кузьминым и соавт. [9]. Выделение изолятов 1410/2008 и 1411/2008 является первым достоверным случаем обнаружения вирусов бешенства Арктической группы на территории европейской части России. Ранее было отмечено, что очаги арктического бешенства приурочены к тундровому ландшафту - ареалу естественного распространения песца [3]. Учитывая значительное генетическое сходство изоля- 47 Рис. 2. Карта распространения изолятов и штаммов вируса бешенства, относящихся к различным генетическим группам, по регионам России. Буквами обозначены генетические группы: А - Арктическая, Е - Евразийская, К - Кавказская, С - Северо-Европейская, Ц - Центральная. тов из Республики Коми и Республики Якутия, можно предположить, что выраженная склонность песца к миграции [4] способствовала распространению вируса бешенства данной генетической линии из Сибири в европейскую часть страны. В 2008 г. 3 изолята были выявлены в материале, поступившем из Краснодарского края (Сочи, Абинск). Анализ показал, что они относятся к Кавказской группе. Данные изоляты идентичны выделенному ранее изоляту 18/2005 из Краснодарского края и штамму RV308 из Грузии. Характерно, что практически все эти изоляты выделены от собаки (за исключением штамма RV308, выделенного от человека), в то время как другие изоляты из Краснодара - 1305f, 10/2005 - выделены от лисы и относятся к Евразийской группе. Наибольшее количество изолятов (29) было выделено в Нижегородской области. Таким образом, для Нижегородской области на данный момент имеется наиболее репрезентативная выборка по сравнению с другими регионами страны. Это позволяет более подробно рассмотреть особенности распространения различных генетических вариантов вируса бешенства на определенной территории. В 2009 г. поступили 23 образца положительного на вирус бешенства материала, собранного в разных районах Нижегородской области, расположенных южнее р. Волги, что дает возможность сделать своего рода временной срез популяции вируса бешенства на этой территории. Согласно филогенетическому анализу, эти изоляты относятся к Центральной группе и их можно разделить на 2 линии: первая линия представлена изолятами 111/2009, 220/2009, 339/2009, 104/2009, 229/2009, 222/2009, 228/2009, 223/2009, 231/2009, к этой же линии относится изолят 8/2010, выделенный в 2010 г.; вторая линия представлена изолятами 221/2009, 226/2009, 217/2009, 218/2009, 990/2009, 110/2009, 230/2009, 232/2009, 225/2009, 343/2009, 224/2009, 227/2009, 985/2009, 219/2009, к этой же линии относится изолят 1564/2008, выделенный в 2008 г. Изоляты, относящиеся к первой линии, были выделены в Арзамасском, Кстовском, Дзержинском, Павловском, Навашинском, Богородском районах, а также в Нижнем Новгороде. Все эти районы расположены в западной части Нижегородской области южнее р. Волги. Изоляты, относящиеся ко второй линии, были выделены в Большемурашкинском, Спасском, Лысков-ском, Большеболдинском, Лукояновском, Воротынском, Пильнинском районах, которые расположены в восточной части области южнее р. Волги. Полученные данные позволяют предположить, что вирусы каждой из двух генетических линий занимают свой ареал, причем ареалы этих линий граничат, но не пересекаются. Следует отметить, что в 2002 и 2003 гг. в Городецком районе Нижегородской области были выделены 2 изолята (20/2002 и 623/2003), которые по генетической структуре существенно отличаются от вышеописанных. Согласно филогенетическому анализу, эти изоляты относятся к Евразийской группе и проявляют наибольшее сходство (98,2 и 97,9%) со штаммом RVHN, выделенным в Новосибирской области. Поскольку данные о других изолятах, выделенных в Нижегородской области севернее р. Волги, отсутствуют, остается неясным, являются ли эти 2 изолята представителями местной популяции вируса бешенства или же они были занесены из других регионов страны. Другой изолят из Нижегородской области (1552/2008) был выделен в Большеболдинском районе в 2008 г. По генетической структуре он значительно (учитывая вариабельность группы) отличается от представителей вышеописанных линий (на 1,2 и 0,9%). Идентичные по генетической структуре изоляты были выделены в Московской и Тверской обла-