Astroviral Infection in Russian Federation

Abstract

The astroviral infections are considered among the most common pathogens of gastroenteritis in children. The incidence, molecular epidemiology and clinical manifestations of the astrovirus infection in children hospitalized with acute gastroenteritis, in various areas of the Russian Federation from 2004 to 2010 was determined.

Full Text

Введение Семейство Astroviridae представлено мелкими (28-30 нм) вирионами, лишенными липидной оболочки и содержащими одноцепочечную РНК позитивной полярности. Спектр естественных хозяев, от которых изолировались представители Astroviridae, довольно широк и включает различные виды птиц (куры, индейки, голуби) и млекопитающих (коровы, свиньи, овцы, куньи, кошки, собаки, мыши и крысы, летучие мыши, ластоногие, дельфины и касатки). В настоящее время в составе семейства выделяют 2 рода - Avastrovirus и Mamastrovirus [12]. Астровирусы человека (HAstV) являются классическими представителями Mamastrovirus, вызывающими многочисленные острые диарейные заболевания у детей первых лет жизни. До 2008 г. HAstV считались единственными возможными возбудителями астровирусной инфекции у человека. Однако в 2008 г. от пациентов с острой диареей были изолированы 2 новые группы астровирусов (VA/HMO и MLB), не относящихся к классическим HAstV (non-HAstV) [3-7, 10]. Случаи выявления у человека астровирусов, отличных от HAstV заставляют более внимательно изучать роль астровирусов животных в качестве естественного банка генетической информации для рекомбинационной изменчивости HAstV. Временная и географическая нестабильность популяции HAstV отражает процессы смены доминирующих типов возбудителей. Данные процессы на территории РФ важны для понимания закономерностей циркуляции астровирусов в Евразии в целом. Организация исследования В исследование были включены дети в возрасте до 14 лет, госпитализированные в стационары Москвы, Санкт-Петербурга, Нижнего Новгорода, Ма хачкалы, Тюмени, Челябинска, Ижевска и Хабаровска с острыми кишечными инфекциями в период с октября 2008 г. по ноябрь 2010 г. Обязательным условием включения детей в исследуемую группу было подписание родителями (родственниками) протокола информированного согласия на участие в исследовании. У части пациентов проводился анализ клинической симптоматики заболевания. Образцы фекалий собирались в первый день госпитализации и сохранялись в фосфатно-солевом буфере, содержавшем 20% глицерола, при температуре от -15 до -20°С не более 30 дней. Исследование образцов проводилось в лаборатории молекулярной диагностики и эпидемиологии острых кишечных инфекций ОМДиЭ ФБУН "ЦНИИ эпидемиологии" Роспотребнадзора (Москва). Лабораторная диагностика Детекция HAstV проводилась с использованием набора реагентов "АмплиСенс® Рибопреп", "Ампли-Сенс® Реверта-L Kit", “АмплиСенс® ОКИ-скрин-FL" (ФБУН "ЦНИИ эпидемиологии" Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией производителя. Для выявления астровирусов млекопитающих (mammalian astroviruses) использовалась методика амплификации участка ORF1b (507 п. о.) с применением busted ПЦР с разделением реакционных смесей в одной пробирке. Использовались AstV-специфичные прямой и обратный олигонуклеотиды в концентрации 360 нмоль/л (AsFOu1 - G(G/C)ICAATGTGGITGG(T/A) C, AsFOu2 - GCCCAAGTTGGTTGGAC и AsROu - C(T/C)CAGG(C/T)TTIACCCACAT (1-й раунд), AsFIn1 - G(G/C)ICAATGTGGITGG(T/A)C(A/C)CC, AsFIn2 - GCCCAAGTTGGTTGGACCCC и AsRIn - C(T/C)CAGG(C/T)TTIACCCACATICCAA (2-й раунд)). Условия амплификации на приборах с актив- Контактная информация: Подколзин Александр Тихонович, канд. мед. наук; e-mail: apodkolzin@pcr.ru 32 ным регулированием: при 95°C - 15 мин; 15 циклов при 95°C - 15 с, 54°C - 15 с, 72°C - 20 с (1-й раунд); и 30 циклов при 95°C - 15 с, 60°C - 15 с, 72°C - 20 с (2-й раунд). Филогенетический анализ Амплификацию и прямое секвенирование участка гена капсида HAstV выполняли с использованием олигонуклеотидов Mon244, Mon245, описанных ранее [13]. Для филогенетического анализа non-HAstV использовали амплификацию участка ORF1b-ORF2, олигонуклеотиды AsFIn1, AsFIn2 и As4300R - tGgTC-CICCCCTCCAAA (807 п. о.); As4300F - TGGAG-GGGIGGACCAAA и As4950R - TTGGTGTCTGTTI-ACCACCA (650 п. о.). Условия амплификации на приборах с активным регулированием: при 95°C - 15 мин; 42 цикла при 95°C - 15 с, 60°C - 15 с, 72°C - 20 с. В исследование были включены нуклеотидные последовательности 110 изолятов астровирусов, исследованных авторами (51 изолят - при выполнении данной работы, и 59 исследованных авторами ранее), а также другие нуклеотидные последовательности изолятов HАstV, выделенные на территории РФ и представленные в базе нуклеотидных последовательностей GenBank. Филогенетический анализ проводился с применением следующего программного обеспечения: модуля AlignX пакета Vector NTI (AlignX modules Vector NTI software) и MEGA (версия 4.0) [16]. Информация о нуклеотидных последовательностях изолятов астровирусов, исследованных в работе доступна в международном банке генетических последовательностей GenBank (JX083239-JX083289). Результаты В период 2004-2010 гг. HAstV на территории РФ в основном были представлены генотипами HAstV 1d (33,2%), 1b (19,9%), 1a (15,6%), 2 (12,9%) и 4 (11,7%). Другие генотипы были представлены единичными изолятами: HAstV генотипа 3 - 5 изо лятов, HAstV 5 - 4 изолята, HAstV 6 - 1 изолят и HAstV 8 - 6 изолятов. HAstV генотипа 7 не выявлялись (рис. 1). Для выявления возможных территориальных особенностей в распространении различных генотипов HAstV была проведена оценка их распределения в городах европейской части РФ (Москва, Санкт-Петербург, Нижний Новгород, Тула) и ЗападноСибирской равнины (Новосибирск, Тюмень, Челябинск) (рис. 2). На этих территориях было выделено 95,2% изолятов HAstV, изучавшихся в работе. Данные о распределении различных генотипов HAstV в 2003-2006, 2007-2008 и 2009-2010 гг. в городах европейской части РФ и Западно-Сибирской равнины представлены в табл. 1. Филогенетический анализ данных изолятов приведен на рис. 1. Синдромальные диагнозы у пациентов с астрови-русной инфекцией имели следующее распределение: острый гастроэнтерит - 28,6%, острый энтерит -22,9%, острый энтероколит (ОЭК) и гастроэнтероколит (ОГЭК) -- по 20,0% и острый гастрит - 8,6%. Данные о выраженности лихорадочной реакции и диареи приведены в табл. 2. Особенности клинической симптоматики у пациентов с астровирусной инфекцией, вызванной различными генотипами HАstV, представлены в табл. 3. Изолят № 17736 (non-HAstV) был выделен от девочки в возрасте 1 год 8 мес, госпитализированной в детский стационар Москвы с острой кишечной инфекцией в сентябре 2010 г., изолят № 18001 (non-HAstV) - от мальчика, госпитализированного в детский стационар Москвы с острой кишечной инфекцией в ноябре 2010 г. (данные анамнеза недоступны). Филогенетический анализ указанных изолятов приведен на рис. 3. В обоих случаях non-HAstV выявлялись у детей без сочетания с другими патогенами. Обсуждение В 2008-2010 гг. частота выявления астровирусов среди госпитализированных детей составляла 2,9%, что несколько выше, чем в других исследованиях, Таблица 1 Выявление различных генотипов HAstV по годам на различных территориях РФ HАstVгенотип Северо-Европейский регион РФ (Москва, Санкт-Петербург, Нижний Новгород, Тула, Ижевск) Города Западно-Сибирской равнины (Новосибирск, Тюмень, Челябинск) Сумма n (%)* 2004-2006 2007-2008 2009-2010 2004-2006 2007-2008 2009-2010 1a 5 2 5 2 6 20 40 (15,6) 1b 12 0 2 17 18 2 51 (19.9) 1c 0 0 0 0 0 0 0 1d 9 7 2 26 18 23 85 (33,2) 2 5 0 1 14 13 0 33 (12,9) 3 0 0 2 3 1 0 6 (2,3) 4 8 2 4 9 4 3 30 (11,7) 5 0 0 4 0 0 0 4 (1,6) 6 0 0 0 0 0 1 1 (0.4) 7 0 0 0 0 0 0 0 8 4 0 0 0 2 0 6 (2,3) Всего ... 43 11 20 71 62 49 256 Примечание. * - в таблицу не включены 13 изолятов HAstV по территориальному признаку: HAstV 1b (4 - Хабаровск 2007-2008, 5 - Махачкала 2004-2006, 2 - Махачкала 2008), HAstV 1d (1 - Хабаровск 2007) и HAstV 4 (1 - Хабаровск 2008). 33 проведенных в Европе [9, 11, 15]. HAstV генотипа 1 доминировали на территории РФ, что ранее было показано для Западной Сибири [1]. В общем распределении генотипов астровирусов на территории европейской части РФ и городов Западно-Сибирской равнины за весь период наблюдений достоверные различия не выявлены. После 2008 г. отмечается снижение доли генотипов 1b и 2 HAstV и увеличение доли HAstV ^-генотипа. Наибольшее число изолятов HAstV 1a-генотипа, сходных с выявленными в России в 2010— 2011 гг., было изолировано в Китае в 2005-2007 гг. (данные не представлены). 34 2010 NNv JF929185 2010 NNvJF929187 2010 Nsc JF491425 2009 Chl 16370 — 2010 Msc 17255 2010 NNv JF929191 2010 Msc 17814 2010 NNvJF929192 — ♦ HAstV-1 a AY324858 I 2010 Izh 17313 2010 NNv JF929186 ■2006 Nsc JF491393 ■2010 Nse JF491412 2009 Nsc HM630273 2009 Nse HM630270 2007 Khb 12351 2008 Mkh 15171 2008 Mkh 15048 1-2007 Khb 12380 2008 Khb 16022 2008 Khb 16040 -2005 Msc 6145 FJ004155 -2008 Chl 15912 — ♦ HAstV-Ib AF348769 — 2004 Nsc(17) 2004 Nsc JF491365 -2010 NNv JF929188 0,001 -2004 Nse JF491367 2009 Nse HM630268 2009 Nse HM630267 2009 Nsc HM630264 2009 Nse HM630260 2009 Nse HM630262 2008 Chl 15841 -2009 Chl 16524 2008 Chl 15813 2008 Chl 14581 2008 Tym 14757 2008 Chl 15928 2010 Msc 17757 2008 Nse GU212651 2009 Nse HM630265 2009 Nse HM630271 2009 Nse HM630272 2010 Nsc(IO) 2007 NNv JF929182 -201 Olzh 17304 -2008 NNv J F929184 2006 Tym 10064 FJ004190 2005 Nsc(9) 2005 Chl 6116 FJ004154 201 OMsc 17738 2008 Chl 15696 ,2007 Nse GQ351329 I-2007 Nsc GQ351331 I-2005 NNv(3) 12006 Mkh(16) ,2008 NscGU223911 12009 Nsc HM630263 2006 Mse 11044 FJ004222 ,2009 Nse HM630269 L-— 2004 Nse J F491370 2006 Chl 10394 FJ004219 2006 Tym 11094 FJ004223 — 2007 Nsc GQ351332 -2007 Nse GQ373007 2007 Nse(S) 2006 Nse JF491392 0,002 Рис. 1. Дендрограмма нуклеотидных последовательностей HastV, изолированных на территории РФ в 2003-2010 гг. (NJ p-distance 341 b. p. (1-341, AY324858). Черным маркером выделены референтные штаммы. A - весь комплекс генотипов HAstV, B - HAstV-1d, C - HAstV-2, D - HAstV-1a, E - HAstV-1b. Сокращенные обозначения городов Chl - Челябинск, Izh - Ижевск, Khb - Хабаровск, Mkh - Махачкала, Msc - Москва, NNv - Нижний Новгород, Nsc - Новосибирск, SPb - Санкт-Петербург, Tul - Тула, Tum - Тюмень. Группы HAstV с гомологичными на исследуемом участке последовательностями: 1 - 2008 Chl 14481, 14561, 14573, 14589, 15678; 2 - 2008 Chl 15900, 15963, 14587; 3 - 2005 NNv FJ004156-FJ004159, FJ004162-FJ004164, FJ004166-FJ004168; 4 - 2005 Tul FJ004173, FJ004177, FJ004178; 5 - 2005 Chl FJ004180, FJ004194, FJ004207; 6 - 2005 Chl FJ004183, FJ004195, FJ004196, FJ004205, FJ004213; 7 - 2007 Nsc GU212650, GQ373009-GQ373012, JF491401, FJ829070, GQ351336, GQ351341, GQ351342; 8 - 2007 Nsc GQ373004, GQ373005, GQ373006_GQ373008, GQ373013, GQ351326, GQ351333-GQ351335, GQ351337-GQ351340; 9 - 2005 Nsc GU212644, JF491384-JF491390; 10 - 2010 Nsc JF491403-JF491405, JF491408-JF491410; 11 - 2008 Nsc GU223908-GU223910, GU223912, GU223913; 12 - 2004 Nsc JF491368-JF491372; 13 - 2005 Nsc JF491377-JF491379, JF491381, JF491383; 14 - 2006 Nsc JF491391, JF491394-JF491398; 15 - 2010 Nsc JF491402, JF491406, JF491407, JF491413-JF491419, JF491421-JF491424, JF491426-JF491429; 16 - 2006 Mkh FJ004186-FJ004189, FJ004210; 17 - 2004 Nsc JF491373-JF491376. Т аблица 2 Выраженность лихорадки и диареи у пациентов с астровирусной инфекцией в распределении по дням болезни (по данным обследования 42 пациентов) Признак Выраженность признака Частота регистрации по дням заболевания, % 1-й 2-й 3-й 4-й 5-й Температура тела,° < 37,0 22,73 27,27 31,82 45,45 50,00 37,0-37,5 36,36 40,91 50,00 45,45 43,18 37,6-38,0 15,91 13,64 9,09 6,82 2,27 38,1-38,5 9,09 9,09 4,55 0,00 0,00 38,6-39,0 11,36 9,09 4,55 2,27 4,55 > 39 4,55 0,00 0,00 0,00 0,00 Частота стула > 10 5,0 2,5 5,0 2,5 0,0 6-10 20,0 20,0 20,0 7,5 5,0 3-5 42,5 35,0 17,5 25,0 25,0 < 3 32,5 37,5 57,5 57,5 50,0 Отсутствие стула 0,0 5,0 0,0 7,5 20,0 Консистенция стула Водянистый 7,3 12,2 4,9 0,0 0,0 Жидкий каловый 73,2 58,5 53,7 41,5 17,1 Кашицеобразный 9,8 12,2 19,5 29,3 41,5 Оформленный 9,8 17,1 22,0 22,0 26,8 Отсутствие стула 0,0 0,0 0,0 7,3 14,6 35 Таблица 3 Особенности клинической симптоматики астровирусной инфекции, вызванной различными генотипами HAstV Число па- Дли Число пациентов с изучаемым признаком Гено тип HAstV циентов с данным генотипом тельность лихорадки, дни Т > 38° T < 38° Т < 37° симпто матика колита эксикоз I/II токсикоз I/II слизь в стуле кровь в стуле боли в жи воте рво та водя нистый стул жидкий кало вый стул Частота стула в день 1b 12 6,8 4 7 1 3 2\2 3\0 5 1 5 7 2 8 3,7 1d 10 5,5 4 4 2 4 0 0 5 2 3 6 1 8 5,8 2 10 3,1 4 4 2 1 0 0 2 0 8 6 2 7 5,0 47 Примечание 6,7 1 6 . Т - температура тела. 0 5 1/0 0/1 4 0 5 1 1 4 8,0 Обращает на себя внимание высокая доля пациентов с симптоматикой колита (40% - сумма синдромальных диагнозов ОЭК и ОГЭК). В сочетании с выраженной лихорадочной реакцией в первые дни болезни (фебрильная температура - 25%) данной особенностью можно объяснить достаточно частое эмпирическое назначение антибактериальной терапии у таких пациентов (данные не представлены). Для большей части пациентов характерен стул жидкой каловой консистенции с преимущественной частотой дефекации 3-5 раз в сутки. Анализ особенностей клинической симптоматики астровирусной инфекции, ассоциированной с различными генотипами астровирусов, затруднен из-за малого количества наблюдений, однако примечательно частое развитие колита (а также высокая кратность стула) при относительно редкой рвоте у пациентов с генотипом 4 астровирусов. Изолят № 17636 относился к группе VA3/HMO B и имел максимальную гомологию (96,03% по нуклеотидному составу) с изолятом из Нигерии (2007) (GQ415661 на участке 1-1333 п. о.). Изолят № 18001 относился к группе MLB 1 и имел максимальную гомологию ( 97,97% по нуклеотидному составу) с изолятом из США (2008) (FJ402983 на участке 3067-4249 п. о.). Филогенетическое положение non-HAstV-изолятов, выявленных в работе, представлено на рис. 3. Non-HAstV являются достаточно редкими клиническими находками. Роль некоторых из этих изолятов в развитии острых диарей ставится авторами под сомнение [8]. Клиническое значение других изолятов, выявляемых при групповой заболеваемости, несомненно [6]. В литературе описаны рекомбинационные события, происходящие между HAstV [18, 19] различных генотипов, а также между HAstV и астровирусами животных [14, 17]. Эти данные позволяют предполагать потенциальное участие астровирусов животных в формировании новых групп астровирусов, потенциально способных адаптироваться к развитию эпидемического процесса среди людей. Несмотря на отсутствие в настоящее время свидетельств активной циркуляции non-HAstV в человеческой популяции, их отдельные находки в клиническом материале, как и факты получения от животных генетически близких к HAstV изолятов [17], заслуживают самого внимательного изучения. Благодарности Авторы выражают глубокую признательность своим коллегам из различных городов России: О.И. Сагаловой, В.Н. Мазепе, Г.Н. Ивановой, З.Г. Тагировой, М.Н. Алексеевой, В.П. Молочному. ■0 HAstV 1 L23513 HAstV 4 AY720891 HAstV 8 AF260508 HAstV 3JF491430 HAstV 6 GQ901902 J - Porcine astrovirus GQ914773 -Astrovirus dogfaeces НМ045005 - Bottlenose dolphin FJ890355 -Astrovirus rabbit JN052023 - MLB 2 JF742759 ~ r· 18001 L MLB 1 FJ402983 _ - Bat astrovirus FJ571068 - Ovine astrovirus NC 002469 - Mink astrovirus GU985458 -SteIIersea FJ890354 r HMO A NC 013443 ' L VA 2 GQ502193 ,· 17636 "I HMO B GQ415661 SG GQ891990 HMO C GQ415662 VA 1 FJ973620 Chicken astrovirus JF414802 Turkeyastrovirus NC 005790 Астровирусы человека (HAstV) MLB группа AstV VA/H MO группа AstV Mamastrovirus Рис. 2. Территориальное распределение изолятов HAstV, проанализированных в работе. Рис. 3. Дендрограмма аминокислотных последовательностей non-HÀstV, изолированных на территории РФ в 2010 г. (выделены черным круглым маркером). (282-509 a. a. L2351, NJ, Poisson correction).