Development of Novel Drugs against Influenza Virus Based on Synthetic and Natural Compounds

Full Text

Несмотря на успехи в области химиотерапии и вак-цинопрофилактики гриппа, он остается трудно контролируемой инфекцией вследствие высокой генетической изменчивости и долговременных осложнений после острой стадии, приводящих к “скрытой”, или вторичной, смертности, вызванной не самим вирусом гриппа, а вирусиндуцированными вторичными процессами [1]. Новые вирусы гриппа птиц H5N1 и свиней H1N1, появившиеся в человеческой популяции в последние годы, являются опасными патогенами человека. Большинство человеческих изолятов вируса устойчивы к действию наиболее распространенного препарата ремантадина и способны эффективно подавлять интер-фероновый ответ организма [2]. Таким образом, ситуация, сложившаяся в последние 3 года в отношении инфицирования человека вирусом гриппа, придает особую актуальность поискам новых эффективных средств профилактики и борьбы с этой инфекцией. Химиопрофилактика и химиотерапия гриппа применяются наряду с вакцинацией для предотвращения и лечения заболевания. В настоящее время для этих целей доступен широкий спектр патогенетических, иммуномодулирующих, общеукрепляющих препаратов вместе со средствами специфической противогриппозной терапии. Несмотря на то что в составе ви-риона и жизненном цикле вируса гриппа есть много уникальных компонентов и стадий, способных служить мишенями для лекарственного вмешательства, лишь два из них используются в клинике в настоящее время. Международно признанными противогриппозными препаратами являются химические соединения двух групп - производные адамантана (амантадин и его аналог в России ремантадин) [3] и ингибиторы вирусной нейраминидазы - озельтамивир (тамифлю) и занамивир (реленза) [4]. В США получено разрешение FDA на использование еще двух ингибиторов нейраминидазы - перамивира (Рапиакта®) внутривенно [5] и ланинамивира (Инавир®) ингаляционно [6]. В России ни перамивир, ни ланинамивир не сертифицированы. К недостаткам лекарств первой группы - производных адамантана - относится узкий спектр действия, поскольку они активны против вирусов гриппа А, но не гриппа В. Нейраминидазные ингибиторы приводят к многочисленным побочным эффектам, таким как аллергические реакции, осложнения со стороны желудочно-кишечного тракта, тошнота [7], а также неврологическим расстройствам [8]. К тому же они имеют высокую стоимость, что ограничивает их применение в большинстве стран мира. В целом современные фармацевтические препараты, удовлетворяющие требованиям доказательной медицины, оптимизированы для селективного взаимодействия с определенной мишенью. Однако для противовирусных соединений точная подгонка под определенную мишень приводит к быстрому появлению резистентных штаммов при недостаточной консервативности выбранного рецептора. Так, устойчивость к адамантановым препаратам достигает 90-100% [2], процент тамифлю-устойчивых штаммов невысок, однако с ноября 2007 по март 2009 г. этот показатель среди вирусов подтипа H1N1 вырос до 100% [9], и если бы эти вирусы не были вытеснены пандемическими штаммами A(H1N1)pdm09, чувствительными к озельтамивиру, это сильно осложнило бы ситуацию со средствами химиотерапии гриппа. По нашим данным, в России в течение последних 5 эпидемических сезонов отмечались те же тенденции (рис. 1). В 2010 г. были опубликованы данные о новом эффективном препарате нуклеозин, направленном против белка NP вируса гриппа [10]. Несмотря на активность этого соединения против вирусов гриппа подтипов H1N1 и H3N2 в культуре клеток и на животных моделях, пандемические штаммы, появившиеся в 2009 г., проявили к нему устойчивость [11]. В тяжелых случаях гриппа в клинической практике применяется рибавирин, эффективный не только против гриппа, но и против других РНК-геномных вирусов. Однако высокая токсичность позволяет рекомендовать его лишь в далеко зашедших случаях инфекции и тем самым ограничивает его применение как средства широкомасштабной борьбы с эпидемиями и пандемиями гриппа. Помимо препаратов прямого противовирусного действия, в России с той же целью используются вещества, обладающие опосредованным или комбинированным механизмом активности. К таким соединениям относится арбидол - вещество, препятствующее слиянию вирусной и клеточной мембран в жизненном цикле вируса и стимулирующее выработку интерферона - основного компонента врожденного иммунитета [12, 13]. Арбидол хорошо зарекомендовал себя в противовирусной терапии, в том числе в педиатрии [14, 15]. Препарат Ингавирин, оказывающий как противовирусное, так и цитопротективное и иммуностимулирующее действие, также с успехом применяется Рис. 1. Динамика чувствительности российских изолятов вируса сезонного гриппа A(H1N1) к озельтамивиру (Тамифлю) в 2004-2009 гг. в клинике и хорошо зарекомендовал себя, в частности, во время пандемии 2009 г. Применение ингави-рина в первые 48 ч болезни приводило к достоверному сокращению периода лихорадки, интоксикации и катаральных симптомов. Ингавирин вызывал эффективную реабилитацию иммунной, интерфероновой и цитокиновой систем, снижал вирусную нагрузку, препятствовал активации бактериальной инфекции и тем самым сокращал сроки болезни [16]. Из индукторов интерферона в России применяются также циклофе-рон, амиксин, ридостин, кагоцел, полудан и другие, а из препаратов интерферонового ряда - гриппферон, герпферон, риальдерон, ингарон, роферон и др. Все эти соединения следует рассматривать как средства профилактики или ранней либо экстренной терапии гриппа, поскольку в поздних стадиях заболевания, при развившейся инфекции и выраженных реактивных процессах их эффективность не проявляется. Факторы патогенеза гриппа включают как вирусспе-цифические, так и реактивные процессы. При тяжелых формах именно последние определяют тяжесть и исход заболевания. К числу таких факторов относятся ДВС-синдром, интоксикация организма, массивное воспаление и интенсивные процессы протеолиза и генерации свободных форм кислорода в его очагах, обусловливающие распад тканей. Поэтому разработка новых эффективных патогенетических препаратов также является важным звеном в комплексной терапии гриппа, особенно его тяжелых форм. Рис. 2. Химические группы соединений, активных против вируса гриппа. Использование растительных метаболитов в создании препаратов в самых разных терапевтических классах является одним из основных путей развития мировой фарминдустрии. Примерно половина всех внедренных в медицинскую практику препаратов за последние 25 лет связаны с природными соединениями. Нами были проведены исследования по поиску противовирусных веществ среди нескольких больших групп химических соединений. Первую группу составили низкомолекулярные синтетические и природные соединения. Вторая группа была представлена низкомолекулярными веществами, непосредственно содержащимися в растительном сырье, как индивидуальными соединениями, так и суммарными растительными экстрактами. В третью группу вошли высокомолекулярные полисахариды различной природы и их производные. Все исследуемые вещества растворяли в минимальном количестве диметилсульфоксида и доводили до необходимого объема средой для клеточных культур. Токсические свойства оценивали при помощи микро-тетразолиевого теста [17] и рассчитывали величину 50 цитотоксической дозы (CtD50). Первичный скрининг противовирусной активности химических соединений проводили в культуре клеток MDCK, инфицированной вирусами гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) или A/California/07/09 (H1N1)pdm09. Титр вируса в контрольных и опытных образцах определяли при помощи реакции гемагглютинации с куриными эритроцитами. На основании данных о снижении титра вируса в присутствии веществ рассчитывали величину 50 эффективной концентрации (ЕС50) и индекс селективности (отношение CTD50 к ЕС50). Среди низкомолекулярных синтетических соединений следует отметить активность веществ следующих химических классов: - азоло-адамантаны (рис. 2, а); - производные бензимидазола (рис. 2, б) и гетероциклические спиросоединения (рис. 2, в); - тритерпены и их производные (рис. 2, г); - монотерпеновые производные (рис. 2, д); - усниновая кислота и ее химические модификации (рис. 2, е) Нами было показано, что эти группы соединений обладают в корне различными потенциалами как противогриппозные средства. Так, среди азолоадаманта-нов были изучены производные ди-, три- и тетразоло-адамантана [18]. За редкими исключениями была обнаружена строгая зависимость противовирусной активности от количества атомов азота в гетероцикле. Примеры соединений этого класса и их противовирусной активности приведены в табл. 1. Видно, что те-тразольные производные адамантанов обладают наиболее высокой противовирусной активностью in vitro (соединения 1-2, 3-4 и 5-6). Наибольшей активностью обладали молекулы, содержащие не более одного тетразольного и одного адамантильного остатка CTD50’ ed50> SI мкг/мл мкг/мл Структура 443 300 1 50 17 3 600 111 6 >1000 123 9 604 10 60 10 30 300 0,18 0,09 2 >500 500 Ремантадин (соединения 7-8). Эти вещества проявили активность против ремантадинчувствительного вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), превышающую активность самого ремантадина (см. табл. 1). В то же время на модели гриппозной пневмонии у мышей они имели умеренный уровень активности или не проявляли ее вообще. Несмотря на более высокую активность этих соединений по сравнению с ремантадином, пассирование вируса в их присутствии приводило к появлению мутации S31N в М2-белке полученного штамма, характерной для ремантадинустойчивых вирусов, что может указывать на сходство механизмов их действия и спектра противовирусной активности. Перспективные соединения были обнаружены среди группы тритерпенов [19]. В целом группа характеризовалась умеренной активностью, и индексы селективности веществ в ней не превышали 10. Практически все химические модификации исходных природных соединений приводили к потере активности. Исключением является активность метилового эфира мацедониковой кислоты при ее отсутствии у самой кислоты (табл. 2). В то же время некоторые из изученных тритерпенов, такие как 3,21-диацетоксиолеана- Примечание. Здесь, в табл. 2 и 3 и на рис. 3: ЕБ^р-эффективная доза; SI-индекс селективности. № соединения 60 12 5 Таблица 1 Закономерности противогрипозной активности азоло-адамантанов 11,13(18)-диен-29-овая кислота, глицерретовая кислота и ее метиловый эфир, при отсутствии активности in vitro демонстрировали протективные свойства in vivo. Это проявлялось в снижении специфической смертности (на 15-40%) и увеличении продолжительности жизни (до 2 сут) по сравнению с контрольными группами. Данный факт говорит о наличии у этих соединений иного механизма активности, не связанного с воздействием на вирусспецифическую мишень, а реализуемого в целостном организме. В группе монотерпеновых производных также были выявлены соединения с высоким противовирусным потенциалом, хотя в целом группа характеризовалась умеренной активностью [20]. Было показано, что соединение (1Я^,6Я)-6-гидрокси-2-метил-5-(1-метилэтенил)циклогекс-2-енил никотинат (рис.3), получаемое из доступного монотерпеноида (-)-вер-бенона с использованием недорогих реагентов, имеет высокие показатели вирусингибирующего действия. Примечательно, что на этой группе химических веществ была продемонстрирована решающая роль абсолютной конфигурации, поскольку переход к соединению, являющемуся оптическим антиподом указанного мононикотината, привел к практически полной потере антивирусной активности. Таким образом, полученные результаты подтверждают перспективность поиска противовирусных средств нового типа среди производных монотерпеноидов и делают необходимыми дальнейшие исследования механизмов их противовирусных свойств. Как группы с высокой активностью были идентифицированы производные бензимидазола и разнородная группа гетероциклических соединений (табл. 3). За редким исключением представители этих групп характеризуются низкими значениями эффективных доз и высоким индексом селективности. Среди доступных соединений этих классов проведен первый этап анализа взаимоотношений структура-активность, сформулированы условия активности, и в настоящее время проводится процедура патентования этих классов химических веществ как противогриппозных средств. Исследования 2010-2011 гг. были посвящены также разработке противогриппозных соединений на основе усниновой кислоты - вторичного метаболита лишайников (см. рис. 1). Ранее были обнаружены Таблица 2 Противовирусная активность тритерпеновых соединений Соединение CTD50, мкг/мл Показатели активности in vitro против вируса гриппа А В ED50 SI ED50 SI Меристотроповая кислота 320 15 21 30 11 Метиловый эфир меристотроповой кислоты 34 8 4 н/т Мацедониковая кислота 137 71 2 н/т Метиловый эфир мацедониковой кислоты 320 30 11 30 11 Примечание. н/т - не титровали. о CTD50=535 мкг/мл ED50=32 мкг/мл Sl=17,0 Рис. 3. (Ш^,6К)-6-гидрокси-2-метил-5-(1-метилэтенил) циклогекс-2-енил никотинат, активный против вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1)pdm09. антибактериальные, инсектицидные и фунгицидные свойства усниновой кислоты, а также ее активность в отношении ДНК-геномных вирусов [21-23]. Исследования активности производных усниновой кислоты против вируса гриппа показали эффективность многих подобных соединений как ингибиторов репродукции этого вируса, при этом проявляемая активность сильно зависела от абсолютной конфигурации полученных соединений. В паре исходных субстратов на репродукцию вируса гриппа наиболее активно влияет (-)-усниновая кислота, однако при химической модификации молекулы, как правило, происходит обращение биологической активности. Если (-)-усниновая кислота проявляет большую противовирусную активность, чем ее (+)-энантиомер, среди пар энантиомерных производных существенно большей ингибирующей активностью по отношению к вирусу гриппа обладают (+)-энантиомеры. В некоторых случаях активность обоих энантиомеров была сравнима. Анализируя зависимость структура-активность, было отмечено, что пиразольные производные усниновой кислоты малотоксичны, но и малоактивны по отношению к вирусу. Вирусингибирующее действие резко возрастает при восстановлении их карбонильной группы (С1 = 0) до гидроксильной. а б Рис. 4. Производные усниновой кислоты, активные против пандемического вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1)pdm09. При этом, однако, существенно повышается цитотоксичность, что приводит к выравниванию индексов селективности соединений. На общем фоне можно выделить продукт взаимодействия (-)-усниновой кислоты и глицина (рис. 4, а), индекс селективности которого составляет 32 за счет невысокой цитотоксичности и выраженной вирусингибирующей способности. Наиболее интересные результаты показали окисленные производные усниновой кислоты, полученные воздействием на усниновую кислоту органических надкислот. Окисленное производное (+)-усниновой кислоты (рис. 4, б) проявило высокую ингибирующую активность при низкой цитотоксичности, его индекс селективности составил 38. а -продукт взаимодействия (-)-усниновой кислоты и глицина; б - окисленное производное (+)-усниновой кислоты. а б Рис. 5. Структура цитизина (а) и резвератрола (б). Помимо перечисленных групп, была изучена противовирусная активность производных природного алкалоида цитизина (рис. 5, а) и производные резвератрола (рис. 5, б). В целом обе группы были охарактеризованы как умеренно или слабоактивные, поскольку ни одно из соединений не имело индекса селективности выше 10. Однако, учитывая природный источ- Таблица 3 Активность гетероциклических соединений против вируса гриппа A/California/07/09(H1N1)pdm09 Соединение CTD50, мкг/мл ED50, мкг/мл SI Производные бензимидазола 626 6,7 0,6 11 627 75,5 2,7 28 628 459 20 23 630 75 0,9 83 631 15 1,7 9 633 29 3,6 8 634 5,5 0,7 8 635 132 22 11 643 118,6 11,1 11 644 1221 103,8 12 645 28 17 2 646 15,6 2,2 7 Гетероциклические спиросоединения 654 415 26 16 655 169 15 11,3 656 286 25 11,4 657 37 1,9 19,2 658 62 30 2 Примечание. щие SI = 10 и более. Серым тоном выделены соединения, имеюник этих веществ, можно ожидать, что их противовирусное действие не будет проявляться в гомогенной клеточной культуре, а лишь на уровне организма, как это происходит в случае других препаратов опосредованного или патогенетического действия. 45-1 40 35 30 25 20 15 10 5- 40-1 35 30 25 20 15 10 5 0- 0-10 11-30 31-50 51 Площадь поражения, % -100 0-10 11-30 31-50 Площадь поражения, °Л 51-100 Контроль вируса Интактные ДКВ Рис. 6. Интенсивность антиоксидантных процессов в ткани легких белых мышей, инфицированных вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), в условиях применения дигидрокверцетина. а - 4-е сутки, б - 7-е сутки после инфицирования. Следующая группа соединений - низкомолекулярные вещества, непосредственно содержащиеся в растительном сырье, не имели прямой противовирусной активности, поэтому не рассматриваются как потенциальные этиотропные средства. Тем не менее их про-тективная активность, показанная на модели летальной гриппозной инфекции, оказалась весьма высокой. Эта группа средств была представлена флавоноидом дигидрокверцетином (ДКВ), содержащимся в коре и древесине лиственницы, а также экстрактами и чистыми соединениями на основе ДКВ, обладающими антиоксидантной активностью. Независимо от этиологии инфекции (вирусы гриппа A(H1N1), A(H5N2) и В) эффект этих препаратов заключался в снижении смертности животных (до 80%) и увеличении продолжительности жизни (на 1-5 сут) в зависимости от дозы препарата, вируса и режима лечения. В отдельной серии экспериментов оценивали сравнительную антиоксидантную активность изучаемых соединений. Два соединения (экстракт косточек винограда - AOK-G-DE и экстракт коры китайской сосны - АОК-Р) оказались более сильными антиоксидантами, чем сам ДКВ (табл. 4). По-видимому, именно это свойство в числе прочих обеспечивает высокую про-тективную активность этих препаратов при летальной гриппозной инфекции у мышей. Для изучения механизма активности этой группы соединений была исследована динамика окислительных и антиоксидантных процессов в ткани легких животных при гриппе. Интересно отметить, что низкая степень тяжести гриппозной пневмонии и небольшие по объему поражения легочной ткани были связаны с повышением уровня антиоксидантных процессов в легких, тогда как обширные поражения ассоциировались со снижением этих реакций (рис. 6). Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о том, что протективный механизм ДКВ и родственных препаратов связан с повышением антиоксидантной активности (АОА) в легочной ткани и снижением уровня свободнорадикальных процессов. Использование ДКВ повышало уровень АОА во всех группах опыта. При этом, однако, степень воздействия ДКВ зависела от тяжести поражения. Наибольший уровень АОА отмечался при малой площади очагов пневмонии. С возрастанием тяжести поражения усиление АОА было выражено меньше (см. рис. 6). Наконец, в рамках исследования третьей группы соединений - растительных полисахаридов и их производных было изучено вирулицидное действие серии арабиногалактанов (АГ), содержащихся в коре и древесине лиственницы. Среди 16 исследованных полисахаридных экстрактов были идентифицированы 10, обладающие способностью снижать инфекционную активность вируса гриппа при предварительной инкубации. Из 10 изученных полисахаридов и их комплексов с металлами оптимальные показатели были обнаружены для комплексов АГ с серебром. Для оценки их противовирусных свойств было проведено тестирование их действия на репликацию вируса гриппа в культуре клеток MDCK в зависимости от концентрации. Результаты показали, что изученный препарат проявляет выраженную дозозависимую противовирусную активность в отношении вируса гриппа, снижая уровень его репликации более чем на 5 порядков. Таблица 4 Антиоксидантные свойства природных соединений и их производных Продукт Снижение OD535 с 0,01% продукта, кратность AOK-G-DE 10 АОК-Р 7,0 ДКВ 5,0 AOK-G-SE 4,0 ДКВ-Zn 3,2 Комплекс продуктов восстановления ДКВ 3,2 Фракция спирофлавоноидов коры лиственницы 2,7 ДКВ-Са 2,5 Пикнолар 2,4 Таким образом, комплексы АГ с серебром можно рекомендовать для разработки на их основе высокоэффективных противовирусных средств для местного применения. Суммируя полученные результаты, следует сказать, что потенциал для разработки новых этиотропных и патогенетических средств для профилактики и терапии гриппа далеко не исчерпан. Изучение новых природных и синтетических химических соединений самых различных групп позволяет идентифицировать вещества, направленные на новые вирусные мишени, расширяя спектр средств для борьбы с этой инфекцией. Суммируя полученные результаты, следует сказать, что потенциал для разработки новых этиотропных и патогенетических средств для профилактики и терапии гриппа далеко не исчерпан. Изучение новых природных и синтетических химических соединений самых различных групп позволяет идентифицировать вещества, направленные на новые вирусные мишени, расширяя спектр средств для борьбы с этой инфекцией.

References

Supplementary files