Molecular genetic characteristics of tick-borne encephalitis virus in the Crimea

Abstract

The nucleotide sequences of the envelope (E) protein gene of three tick-borne encephalitis virus (TBEV) strains 80, 85, and 290 isolated from Ixodes ricinus ticks in the Crimea in 1989-1990 were determined. A comparative analysis of the genetic structure of the strains showed their identity. A phylogenetic analysis of these strains with 34 other TBEV strains could assign them to the European genotype and showed their maximum (97.24%) identity to the Pan strain that occupies a separate position among the sequenced TBEV strains. The findings indicate that the TBEV European genotype strains circulated together with the TBEV Far Eastern genotype ones in the Crimea in 1980-1990

Full Text

Прогресс в изучении проблемы клещевого энцефалита (КЭ) в значительной мере обусловлен использованием молекулярно-генетических методов. Разработаны различные подходы к генотипированию вируса клещевого энцефалита (ВКЭ): секвенирование участка Е-гена длиной 211 пар нуклеотидов (п. н.) с маркерной аминокислотой в 206-й позиции, уникальной для конкретного генотипа; анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов; ОТ-ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флюоресцентной детекцией с гено-типспецифическими зондами [7, 9]. Исследования с использованием этих методов позволили определить полноразмерные последовательности геномов ВКЭ, установить широкую генетическую вариабельность ВКЭ. Это дало возможность провести ревизию таксономии вирусов, в том числе флавивирусов [20]. Современная генетическая классификация основана на видовых признаках, объективно определенных по степени гомологии гена белка оболочки Е с полноразмерным геномом ВКЭ. С учетом различий в геноме выделяют 3 генотипа ВКЭ - дальневосточный (генотип 1), европейский, или западный, (генотип 2) и сибирский (генотип 3) [10, 13, 19]. Данные исследований стали базисом для создания диагностических, лечебно-профилактических препаратов; важным инструментом при организации эпидемиологического надзора за КЭ, в том числе с использованием ГИС-технологий [8, 11, 12]. Экологоэпидемиологические исследования с учетом генотипов ВКЭ позволили провести картографирование более 30 тыс. природных очагов КЭ в Северном полушарии от Европы до Японии. Каждый из генотипов вируса, как правило, доминирует на определенной территории, где в то же время могут циркулировать штаммы, относящиеся к иным генотипам [2, 4, 10, 14, 16, 17]. В настоящее время данные о генетических особенностях популяции ВКЭ в Украине ограничены изучением двух штаммов. Штамм Семекс, изолированный в Волынской области, был отнесен к сибирскому генотипу [1], а изолированный в Крыму штамм Crimea - к дальневосточному [13]. Широкий спектр клинической манифестации КЭ на эндемичных территориях позволяет предположить наличие всех генотипов ВКЭ или микстинфицирования [3]. Целью настоящей работы было изучение молекулярной структуры гена белка оболочки Е трех штаммов ВКЭ, изолированных от иксодовых клещей в Крыму в 1989-1990 гг. Материалы и методы Штаммы ВКЭ были изолированы путем интраце-ребрального заражения новорожденных белых мышей (НБМ) суспензиями пулов иксодовых клещей по стандартной методике [6]. Характеристика изолированных штаммов представлена в табл. 1. Штаммы поддерживали путем интрацеребрального заражения НБМ и хранили в замороженном виде на уровне 7-9 пассажей. Выделение тотальной РНК осуществляли с помощью набора реагентов TRIzol® Plus RNA Purification Kit (“Invitrogen”, США). Синтез кДНК проводили со случайными праймерами с помощью набора High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (“Applied Biosystems”, США). Амплификацию трех перекрывающихся фрагментов гена белка оболочки Е осуществляли в реакционной смеси Platinum PCR Supwer Mix (“Invitrogen”, США) с оригинальными праймерами (табл. 2). Очищенные на колонках NucleoSpin Extract II (“Macherey-Nagel”, ФРГ) продукты ПЦР ампли-фицировали в реакционной смеси с терминаторами BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (“Applied Biosystems”,США) с оригинальными праймерами (см. табл. 2) и перед капиллярным электрофорезом очища- Таблица 1 Характеристика изолированных в крыму штаммов ВкЭ Вид, количество и фаза развития клещей, способ сбора Штамм Место и дата сбора Ixodes ricinus, 27 имаго, на флаг Симферопольский район, с. Краснолесье, 07.04.89 Бахчисарайский район, буковый лес, 18.04.89 Белогорский район, с. Горлинка, 29.05.90 80 85 290 Ixodes ricinus, 34 имаго + 205 нимф, на флаг Hyalomma marginatum marginatum, 100 имаго, на флаг ли на колонках NucleoSEQ (“Macherey-Nagel”, ФРГ). Исследования на всех этапах выполняли в соответствии с инструкциями производителей реагентов. Таблица 2 Олигонуклеотидные праймеры для амплификации и секвенирования фрагментов гена белка оболочки Е ВкЭ Праймер Направление праймера Последовательность праймера (5'-3') Позиция праймера в геноме ВКЭ* Размер ампликона, п. н. 904F1 Прямое ACC CTG GAG AGT GTG GTG AC 904-923 633 1536R1 Обратное GAC CCT GCA CAA CAA AGA CA 1517-1536 1361F2 Прямое ATG TGT ACG ACG CCA ACA AA 1361-1380 626 1986R2 Обратное ACA GGG CTT TGT TCC AGA GA 1867-1986 1847F3 Прямое TGG GAC TGG AAA AAC TGA AGA 1847-1867 688 2534R3 Обратное ACC TCT CTC CAC ACG ACC AG 2515-2534 Примечание. * - позиция в полногеномной последовательности ВКЭ (GenBank: NC 001672.1). Нуклеотидные последовательности продуктов ПЦР определяли на автоматическом анализаторе Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (“Applied Biosystems”, США). Выравнивание и сборку консенсусных последовательностей гена белка оболочки Е проводили с помощью программного обеспечения BioEdit version 7.0.5.3 [15]. Филогенетические взаимоотношения изучаемых штаммов с известными геномными последовательностями 34 штаммов ВКЭ - 235 (EF113081.1), Salem (FJ572210.1),AS33 (GQ266392.1), TBE 4387 (X76607.1), 166 (EF113079.1), Ljub. I (AF091012.1), 263 (U27491.1), 282 (EF113087.1), Kem I (AF091011.1), Absettarov (AF091005.1), N256 (AF091014.1), A52 (X60286.1) Scharl (AF091017.1), TG Frauenfeld (HM468157.1), Iso 40 (AF091009.1), T1401 (EU872053.1), Neudoerfl (U27495.1),KrM93(EU276109.1),ZZ9(AF091020.1),Als. I (AF091007.1), K23 (AF091010.1), HYPR (X75286.1), T1401 (EU872053.1), Stara Ves (AF091018.1), Toro-2003 (DQ401140.2), Pan (AF091015.1), Zausaev (AF527415.1), Vasilchenko (M97659.2), Semeks (AF224665.1), 886-84 (EF469662.1), 178-79 (EF469661.1), Sofjin (X07755.1), Oshima 5-10 (AB001026.1), Crimea (AF091008.1), вирусов шотландского энцефаломиелита овец (ШЭО) (Louping ill virus SB 526 (M94957.1) и омской геморрагической лихорадки (ОГЛ) (OHFV (X66694.1) оценивали с помощью программы Mega 5.0. Последовательности выравнивали с помощью программы Clustal W и затем анализировали методом присоединения соседей (neighbor-joining method - NJ, p-distance). Статистическую оценку филогенетического древа проводили посредством бутстрэп-анализа с созданием 1000 случайных выборок. Результаты В результате секвенирования были получены нуклеотидные последовательности гена белка оболочки Е штаммов ВКЭ 80, 85 и 290, изолированных из иксодовых клещей в Крыму в 1989-1990 гг. Анализ нуклеотидных последовательностей показал 100% идентичность гена Е у всех трех изучаемых штаммов. При сравнительном выравнивании полученных нуклеотидных последовательностей с последовательностями ранее изученных штаммов ВКЭ отмечен более высокий уровень идентичности штаммов, выделенных в Крыму, со штаммами европейского генотипа - от 93,95% (штамм TG Frauenfeld) до 97,24% (штамм Pan) - при варьировании совпадения нуклеотидных последовательностей с сибирским и дальневосточным генотипами от 84,81% (штамм Crimea) до 85,67% (штамм 88684). Принадлежность штаммов 80, 85 и 290 к европейскому генотипу была также подтверждена данными филогенетического анализа (см. рисунок) и наличием сигнатурных аминокислот 47(A), 88(G), 115(A), 178(E), 206(V), 267(A), 277(E), 317(A), 426(A), 431(S), 433(1) и 437(V), характерных для штаммов европейского генотипа ВКЭ [13]. Выравнивание и анализ аминокислотных последовательностей белка оболочки Е позволили выявить две уникальные для штаммов 80, 85 и 290 аминокислотные замены: аспарагин (N) в позиции 67 и аргинин (R) в позиции 266. Также были обнаружены две редко встречающиеся у штаммов европейского генотипа аминокислотные замены: валин (V) в позиции 306 и аргинин (R) в позиции 407. 27 7 Обсуждение Существование природных очагов КЭ в Крыму известно с середины 50-х годов прошлого века. В последние годы заболеваемость КЭ на полуострове носит спорадический характер и, согласно данным официальной статистики, составляет 0,05-1,5 на 100 тыс. населения. В 2009 г. в Крыму было зарегистрировано 9 случаев КЭ (0,02 на 100 тыс. населения). 10 34 40 Заболевания клинически манифестируют преимущественно в виде лихорадки, реже в форме менингита или энцефалита. Основным переносчиком ВКЭ в Крыму, как и в большинстве других регионов Европы, является иксодовый клещ Ixodes ricinus, обитающий в горно-лесной части полуострова. t 66 91 Изучение молекулярно-генетических особенностей крымской популяции ВКЭ, несомненно, имеет как научное, так и прикладное значение. В результате проведенного нами секвениро-вания и сравнительного анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей гена белка оболочки Е штаммов ВКЭ 80, 94 59 68 86 85 и 290 была установлена 100% идентичность данного фрагмента генома у всех трех изучаемых штаммов. Изоляция ВКЭ из клещей разных видов (I. ricinus и H. marginatum marginatum), собранных в трех граничащих друг с другом административных районах (Бахчисарайский, Симферопольский и Белогорский), территории которых включают горно-лесную часть полуострова на северном склоне Главной гряды Крымских гор, может свидетельствовать о существовании стойкого природного очага генетически однородной популяции вируса. 58 87 49 89 h 4 0,005 Филогенетическое древо (NJ, p-distance), иллюстрирующее генетическое родство 34 про-тотипных штаммов и крымских изолятов ВКЭ (штаммы 80, 85 и 290). Вирусы шотландского энцефаломиелита овец (Louping ill virus) и омской геморрагической лихорадки (OHFV) использованы в качестве внешней группы. Шкала показывает количество нуклеотидных замен на 1 сайт. Штаммы, секвенированные в данной работе, обозначены звездочкой. На основе филогенетического анализа с ранее охарактеризованными штаммами ВКЭ штаммы 80, 85 и 290 были отнесены к европейскому (западному) гено- AS33 I.ricinus Germany 2005 TBE 4387 Bank vol Slovakia 1982 Salem Macaca Germany Ljub. I human Slovenia 1993 235 Czech Republic 2006 166 l.hexagonus Czech Republic 2006 -Schari human Austria 1956 56 263 I.ricinus Czechoslovakia 1987 ~I— 282 Czech Republic 2006 -Kem I I.ricinus Hungary 1952 N256 I.ricinus Belarus 1968 A52 I.ricinus Finland 1959 Absettarov human Russia 1951 Iso 40 I.ricinus Switzerland 1975 T1401 I.ricinus Germany -TG Frauenfeld I.ricinus Switzerland 2009 T1354 I.ricinus Germany -HYPR human Czechoslovakia 1953 -ZZ9 I.ricinus Austria 1985 -Als. I I.ricinus France 1975 - K23 I.ricinus Germany 1975 Neudoerfl I.ricinus Austria 1971 — KrM 93 Apodemus agrarius South Korea 2006 -Stara Ves Croatia 54 40 L Toro-2003 I.ricinus Sweden 2003 — Pan human Russia 1957 80 I.ricinus Crimea 1989* 85 I.ricinus Crimea 1989* 290 I.ricinus Crimea 1990* 99 -Louping ill virus SB 526 Vasilchenko human Russia 1969 -Zausaev human Russia 1985 -Semeks I.ricinus Ukraine 1988 -OHFV -886-84 Clethrionomys rufocanus Russia 1984 - 178-79 I.persulcatus Russia 1979 -Sofjin human Russia 1937 -Oshima-5-Ю human Japan 1993 78 L Crimea I.ricinus Ukraine 1987 типу вируса. Обращает на себя внимание тот факт, что крымские штаммы оказались наиболее родственны штамму Pan, занимающему обособленное филогенетическое положение среди штаммов ВКЭ с расшифрованным геномом [13]. Анализ аминокислотных последовательностей показал наличие 4 аминокислотных замен - 67(N), 266(R), 306(V) и 407(R) - в доменах II и III эктодомена и трансмембранном сегменте. Уникальные аминокислоты 67(N) и 266(R) расположены в домене II (аминокислотные остатки 52-136 и 190-284), выступающем над поверхностью вириона и предположительно участвующем в слиянии с клеточной мембраной. У остальных анализируемых штаммов независимо от генотипа в 67-й позиции находилась аспарагиновая кислота (D), а в 266-й позиции - лизин (К). Аминокислотная замена 306(V), отличающая штаммы 80, 85 и 290 от большинства анализируемых штаммов ВКЭ, расположена в домене III (аминокислотные остатки 303-395), который предположительно считается участком связывания с клеточным рецептором [18]. Валин (V) в позиции 306 также обнаружен у штаммов Pan и ZZ9 европейского генотипа, штаммов сибирского генотипа и двух из четырех штаммов дальневосточного генотипа (Oshima 5-10 и 178-79) [13]. У остальных анализируемых штаммов в 306-й позиции находился метионин (М). В трансмембранном сегменте за пределами эктодомена (аминокислотные остатки 1-395) у штаммов 80, 85 и 290 обнаружена аминокислотная замена 407(R), характерная для штаммов сибирского и дальневосточного генотипов, но редко встречающаяся у штаммов европейского генотипа, у которых, за исключением штаммов Pan и Stara Ves, в 407-й позиции находится лизин (K). Аналогичная аминокислотная замена также присутствует у относящегося к дальневосточному генотипу штамма Crimea, выделенного из клещей I. ricinus в Крыму в 1987 г. [13]. Происхождение штамма Crimea, близкородственного японскому штамму Oshima 5-10 [13], требует более глубокого изучения. Можно предположить, что предок штамма Crimea мог быть завезен в Крым в 1957 г. с отловленными в Приморском крае дикими кабанами [5]. Следствием присутствия в Крыму 2 генотипов ВКЭ (европейского и дальневосточного) может быть разнообразие клинических проявлений заболевания у людей от легких лихорадочных форм до тяжелых осложненных энцефалитов с высокой летальностью. Таким образом, нами впервые было показано существование в Крыму европейского генотипа ВКЭ. Анализ первичной структуры гена белка Е штаммов ВКЭ 80, 85 и 290 свидетельствует о гомогенности штаммов европейского генотипа. Вместе с тем обнаружение в Крыму 2 генотипов вируса указывает на широкую генетическую вариабельность популяции ВКЭ на полуострове, что необходимо учитывать при диагностике КЭ, проведении профилактических и противоэпидемических мероприятий в регионе.