Characterization of Cold-adapted Influenza Strain A/HongKong/1/68/162/35 as a Potential Donor of Attenuation and High Reproduction

Full Text

В настоящее время для производства живых (ЖГВ) и инактивированных (ИГВ) вакцин против гриппа используют реассортанты эпидемических вирусов и вирусов - доноров генов, кодирующих внутренние белки. Штаммы вируса гриппа А для ИГВ (производственные штаммы) с начала 70-х годов прошлого века получают на основе высокорепродуктивного безопасного для человека вируса A/PR/8/34. Для ЖГВ в качестве донора используют аттенуированные вирусы гриппа A(h2n2): в России - А/Ленинград/134/17/57 (А/Лен/17), в США - A/Ann Arbor/б/бОса (А/АА/ 6/60са), разработанные соответственно научными коллективами во главе с Г. И. Александровой [1] и H. F. Maassab [12, 14] . Полученные доноры аттенуации обладают меньшей репродуктивной способностью, чем вирус A/PR/8/34, но передают вакцинным штаммам необходимые для ЖГВ свойства, такие как аттенуацию к человеку, холодоадаптированность (са) - способность активно размножаться при температуре 25-27oC и термочувствительность (ts) - слабую репродуктивную активность при повышенных температурах (39-40oC). Эти свойства определяют способность вакцинного штамма к репродукции в носоглотке привитого человека и инициацию иммунного ответа при невозможности размножаться в нижних дыхательных путях. Очевидно, получение штаммов для ИГВ и ЖГВ на разных донорах и проверка их соответствия стандартам требуют двойных затрат времени и ресурсов. Предпринимались попытки создать вирус, совмещающий свойства высокой репродуктивности и аттену-ированности к человеку, например вирус A/PR/8/59/1 [9], но в практике этот донор применения не нашел. H. Jin и соавт. [11] путем внесения в геном вируса A/ PR/8/34 мутаций, отвечающих за ts-фенотип у донора аттенуации Л/АА/6/60са, получили высокорепродуктивный, температурочувствительный вирус. По мнению авторов, этот вирус будет более безопасным при создании реассортантов с высокопатогенными пандемическими вирусами. Создание штамма вируса гриппа, обладающего высокой репродуктивностью и генетическими маркерами аттенуации к человеку - са и ts, было задачей данного исследования. Материалы и методы Вирусы. В работе использовали вирус гриппа А/Гонконг/1/68 (H3N2) - А/ГК/1/68, выделенный на куриных эмбрионах от больного человека в 1968 г. в Гонконге и переданный в НИИ гриппа из Всемирного центра по гриппу (Лондон) в 1969 г. Аттенуацию штамма А/ГК/1/68 проводили путем пассирования исходной популяции возбудителя на 10-11-дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) при 32o и 26oC при заражающей дозе 103-104 ЭИД50/0,2 мл. Инфекционную активность вирусов определяли тестированием в РКЭ, рассчитывали с помощью метода Рида и Менча и выражали в lg ЭИД50/0,2 мл [15]. Холодоадаптированность (ХА) вирусов оценивали по результатам их сравнительного титрования в РКЭ при оптимальной и пониженной температурах. Штаммы считали холодоадаптированными, если разница инфекционных показателей при указанных температурах RCT (reproductive capacity at different temperatures) была не более 3 lg ЭИД50. Температурочувствительным считали штамм, разница в инфекционной активности которого при оптимальной и повышенной (39oC) температурах составляла более 5 lg ЭИД50. Лабораторные животные. Использовали беспородных белых мышей в возрасте 16-18 нед и морских свинок в возрасте 5-6 мес, полученных из питомника лабораторных животных “Рапполово” (Россия, Ленинградская обл.). Животных выдерживали в карантине в течение 21 дня. При исследованиях руководствовались “Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных” (1977). Безвредность штамма A/ГК/са оценивали на мышах и морских свинках. Первую группу мышей под легкой анестезией инфицировали интраназально аллантоисной жидкостью, содержащей вирус в дозе 6,5 lg ЭИД50/05 мл. Второй группе мышей вирус вводили в той же дозе внутрибрюшинно. Морским свинкам вирус вводили подкожно в дозе 9 lg ЭИД50/05 мл. Наблюдение за животными проводили в течение 14 дней после заражения. Ежедневно определяли массу тела и клинические признаки заболевания, включая состояние кожного покрова в месте введения вируса. Репродукцию вируса в легких и носовых ходах мышей определяли на 3-и сутки после инокуляции по показателям титрования 10% суспензии органов в куриных эмбрионах и выражали в lg ЭИД50/мл. Специфичность вируса определяли в реакции торможения гемагглютинации по общепринятой методике [5] со специфическими иммунными крысиными сыворотками, используя 4 АЕ антигена и 1% взвесь эритроцитов кур. Использовали сыворотки к вирусам гриппа A субтипов H1N1, H2N2, H3N2, гриппа В, а также к вирусам Сендай и болезни Ньюкасла (NDV). Исследование трансмиссивности штамма A/ГК/ са. Морских свинок инфицировали без наркоза, вводя в оба носовых хода по 200 мкл вируса в дозе 6,5 lg ЭИД50/0,4 мл. Через 20 ч к зараженным животным подсаживали по 2 интактные свинки. Назальные смывы получали до и на 2, 5, 8 и 12-е сутки после заражения/контакта путем пропускания 1,0 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) через носовые ходы животного. Репродукцию вируса оценивали по результатам титрования назальных смывов. Секвенирование. С целью выявления мутаций, возникших в процессе аттенуации штамма, 6 “внутренних” генов (РВ2, РВ1, pA, Np, М и NS) итогового штамма A/Гонконг/1/68/162/35 (А/ГК/са) и двух промежуточных вариантов (А/ГК/7 и А/ГК/162) были секвенированы и сопоставлены с последовательностями соответствующих генов дикого вируса А/ ГК/1/68, взятыми из базы данных GenBank (номера пос-ледовательностей AF348170, AF348172, AF348174, AF348180, AF348188, AF348198). Вирусную РНК из аллантоисной жидкости выделяли с использованием коммерческого набора РИБО-сорб (ФГУ ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Сегменты генома амплифицировали методом ОТ-ПЦР с использованием специально подобранных пар праймеров, набора PEBEPTA-L для обратной транскрипции и комплекта реагентов для ПЦР производства ФГУ ЦНИИ эпидемиологии. Очистку ПЦР-продуктов осуществляли методом горизонтального электрофореза в 1,7% агарозном геле с последующим выделением ДНК с помощью коммерческого набора QIA Quick Gel Extraction Kit (“Qiagen”, США). Реакцию секвенирующей ПЦР ставили с использованием коммерческого набора ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Kit (“Applied Biosystems”, США). Анализ продуктов реакции секвенирования, очищенных от остаточных терминаторов, проводили с помощью системы ABI pRiSM 3100-Avant Genetic Analyzer (“Applied Biosystems”, CШA). Сборку нуклеотидных последовательностей, их обработку и выравнивание осуществляли в программном пакете Vector NTI 10 Advance (“Invitrogen”, США). Результаты и обсуждение В 1969-1970 гг. в НИИ гриппа в процессе подготовки ЖГВ на волонтерах были изучены реактогенные и иммуногенные свойства вируса А/ГК/1/68, прошедшего несколько пассажей в РКЭ. Экспериментальные серии препаратов из вариантов штамма А/ГК/1/68 готовили и контролировали в соответствии с МРТУ-42 на ЖГВ. Концентрация активного вируса, вводившегося волонтерам, составляла 106,0-7,4 ЭИД/0,2 мл. Было показано, что варианты вируса A/ГК/1/68, прошедшие свыше 15 пассажей в РКЭ, были безвредными для людей и по показателям реактогенности отвечали требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам [3]. Полученный штамм A/^A^^ использовали в качестве ЖГВ, но его разработку в качестве донора аттенуации не проводили. В начале 2000-х годов работа с вирусом была возобновлена с целью создания единого донора для ре-ассортантов, используемых в производстве вакцин обоих типов (ЖГВ и ИГВ). Дальнейшую аттенуацию пассажного варианта A/ГК/1/68/25 проводили путем пассирования в РКЭ с инкубацией последних при 32-33oC в течение 48 ч. Дополнительно выполнено 137 пассажей. Затем штамм A/ГК/1/68/162 был подвергнут холодовой адаптации путем 35 последовательных пассажей в РКЭ при температуре инкубации 26oC. Всего в целях аттенуации штамма было проведено 162 пассажа при оптимальной температуре и 35 пассажей - при пониженной. Таблица 1 Биологические свойства пассажных вариантов вируса гриппа А/Гонконг/1/68 Штамм Инфекционная активность, lg ЭИД50/0,2 мл, при RCT26 RCT39 Гемагглютинирующая активность, ГАЕ 26oC 32oC 39oC А/Гонконг/1/68/15 2,5 7,25 5,0 4,75 2,25 1:64 А/Гонконг/1/68/150 2,5 8,5 н/и н/и н/и 1:512 А/Гонконг/1/68/162/10 3,0 8,5 н/и н/и н/и 1:512-1:1024 А/Гонконг/1/68/162/35 8,5 9,0 1,0 0,5 8,0 1:1024-1:2048 П р и м е ч а н и е . н/и - не исследовали. Таблица 2 Мутации в генах штамма А/Гонконг/1/68/162/35 (ГКса) и соответствующие аминокислотные замены по отношению к исходному вирусу А/Гонконг/1/68 (ГК/1/68) и пассажным вариантам А/Гонконг/1/68/7 (ГК7) и А/Гонконг/1/68/162 (ГК162) Ген Нуклеотид ГК/1/68 ГК/7 ГК/162 ГКса АК ГК/1/68 ГК7 ГК162 ГКса РВ2 375 G G T T 120 Glu Glu Asp Asp 1093 T T С С 360 Tyr Tyr His His !! 1765 A G G G 584 Ile Val Val Val PB1 1145 С C A A 374 Ala Ala Glu Glu !! 1417 A A A G 465 Arg Arg Arg Gly !! 1903 С C T T 627 Pro Pro Ser Ser !! PA 1347 G G G A 441 Met Met Met Ile 2042 A G G G 673 Lys Arg Arg Arg NP 304 G G A A 102 Gly Gly Arg Arg 875 A A A G 292 Glu Glu Glu Gly !! М 613 G G A A M1:205 Val Val Ile Ile 691 G G A A Ml:231 Asp Asp Asn Asn ! 785 A A C С 787 C T T T M2:33 Ile Ile Leu Leu NS 264 C G G G NS1:81 Ile Met Met Met 676 A A G G NS1:219 Lys Lys Glu Glu !! П р и м е ч ан и е .ГК/1/68 - штамм A/Гонконг/1/68(H3N2), нуклеотидные последовательности генов которого взяты из базы данных GenBank (номера последовательностей АF348170, AF348172, AF348174, AF348180, AF348188, AF348198). Нуклеотидные последовательности штаммов ГК7, ГК162 и ГКса определены по данным секвенирования. Нумерация нуклеотидных и аминокислотных замен дана относительно штамма ГКса. !! - аминокислотные замены сопровождаются сменой заряда/полярности/гидрофильности аминокислоты; АК -аминокислота. В процессе аттенуации были изучены репродуктивная и гемагглютинирующая активность, чувствительность к ингибиторам сывороток животных, антиген-ные свойства пассажных вариантов в перекрестной РТГА. Варианты вируса А/ГК/1/68, полученные на разных этапах аттенуации, активно размножались в РКЭ, где они накапливались до 108,5-109,5 ЭИД50/0,2 мл, взаимодействовали с термостабильными у-инги-биторами сывороток различных лабораторных животных до титра 1:80-1:320. Чувствительность вируса к сывороточным ингибиторам была неизменна. В РТГА вирус реагировал со штаммспецифической крысиной сывороткой А/ ГК/1/68 до титра 1:160 и не реагировал с типоспецифическими сыворотками к вирусам гриппа A/H1N1, A/H2N2, современным штаммам A/H3N2, В и сыворотками к вирусам Сендай и NDV. Вирус А/ГК/са был безвреден при парентеральном введении. В течение периода наблюдения все животные были живы и не имели признаков заболевания. Максимальная потеря массы тела у мышей при вну-трибрюшинном введении составила 2,6%, при интра-назальном - 3,2%. Максимальная потеря массы тела морских свинок составила 4,1%. В месте введения не обнаружено признаков некроза или абсцесса. К концу срока наблюдения у всех животных масса тела превысила исходную. При интраназальном введении репродукция штамма А/ГК/са в дыхательных путях мышей при заражающей дозе 6 lg ЭИД50/0,2 мл составила в носовых ходах 5,5 lg ЭИД50/мл, в легких - 2,75 lg ЭИД50/мл. Интраназальное введение вируса A/ГК/са морским свинкам не вызывало признаки заболевания. Вирус репродуцировался в носовых ходах животных, и на 2-е сутки после введения выделялся из назальных смывов в титрах 3,2-5,45 lg ЭИД50/мл. У контактных морских свинок вирус не выделялся, за исключением единственного эпизода выделения на 2-е сутки после контакта в титре 0,5 lg ЭИД50/мл, что не позволяет достоверно судить о продуктивной вторичной инфекции. По мере увеличения количества пассажей инфекционная и гемагглютинирующая активность вируса возрастала как при оптимальной, так и при пониженной температуре (табл. 1). Инфекционная активность вируса по сравнению с исходным штаммом выросла почти на 2 lg ЭИД/мл при 32oC и на 6 lg ЭИД50/мл при 26oC (RCT26 = 0,5). При 39oC инфекционная активность уменьшилась на 4 порядка (RCT39 = 8,0). Штамм приобрел ca; ts-фенотип. Гемагглютинирую-щая активность вируса выросла в 20-40 раз. При секвенировании генов вируса А/ГК/са по сравнению с исходным эпидемическим вирусом выявлен ряд мутаций во всех генах, кодирующих внутренние и неструктурные белки (табл. 2). Часть мутаций привела к аминокислотным заменам: по 2 замены в белках PA, РВ1, NP, Ml, NSI, 3 замены в белке РВ2 и 1 замена в белке М2. Основное количество мутаций произошло при пассировании при оптимальной температуре. На этапе пассирования при пониженной температуре появились мутации в генах и соответствующих белках РА(М4411) и NP(E292G). После 10-кратного пассирования вируса А/ГК/са в РКЭ было проведено повторное секвенирование генов внутренних белков. Показано, что все отмеченные мутации сохранились. Разработанный штамм A/ГК/са по своей репродуктивной (минимум 9 lg ЭИД/0,2 мл) и гемагглюти-нирующей активности (1:1024-1:2048) не уступает используемому донору высокой репродуктивности A/ PR/8/34. По отношению к донору аттенуации A/Лен/П [1] репродуктивность штамма А/ГК/са была выше на 1,5-2 lg. Реассортанты, полученные на доноре А/ГК/са с генетически удаленными вирусами гриппа A (H5N1, H3N2, H3N8), наследовали эти свойства [6], представляющие ценность при производстве вакцин, так как они позволяют увеличить выход антигена. Способность штамма А/ГК/са репродуцироваться при пониженных температурах была более выражена по сравнению с донором А/Лен/17 [1], а также с донором А/АА/6/60са [12] (8,5 lg против 6,5 и 6,8 lg ЭИД50 соответственно), что предполагает лучшую приживаемость вакцинных штаммов в верхних дыхательных путях. Уровень репродукции А/ГК/са в верхних дыхательных путях мышей был на 2,75 lg ЭИД50 выше, чем в легких, тогда как для донора А/Лен/17 эти показатели были сравнимы [8]. Кардинальный признак аттенуации вируса к человеку - термочувствительность - был сопоставим для штамма А/ГК/са и существующих доноров. Показано, что термочувствительность ХА-доноров аттенуации определяется генами полимеразного комплекса. Так, для донора А/Лен/17 решающее значение в аттенуации имели мутации в генах PB2 и PB1, приведшие к заменам в соответствующих белках [4, 13]. Анализ генома реассортантов с донором А/ АА/6/60са показал, что ts-фенотип обеспечивается мутациями в генах PB1, PB2 и NP [12]. В штамме А/ Краснодар/101/59/35 ts-мутации обнаружены в генах PB1, PA, NP [2]. Очевидно, полигенный контроль ts-фенотипа является залогом стабильности этого признака [7, 10, 13]. В полученном штамме А/ГК/са мутации имели место во всех генах полимеразного комплекса и гене NP в количестве, превышающем мутации в каждом из существующих доноров аттенуации (табл. 3). Это свидетельствует о глубоком изменении генома исходного эпидемического вируса и предполагает стабильность ts- и са-фенотипа вируса А/ГК/ Таблица 3 Общее количество аминокислотных замен во внутренних и неструктурных белках разработанного штамма А/Гк/са и существующих доноров аттенуации Белок Количество аминокислотных замен А/ГК/са А/Лен/17* А/АА/6/60са* РВ2 3 1(ts) 1(ts) РВ1 3 2(ts) 4(ts) РА 2 2 2 NP 2 0 1(ts) M1 2 1 0 М2 1 1 1 NS1 2 0 1 NS2 0 1 0 РНП-комплекс 10 5 8 Примечание. * - цитируется по [4]. са. Все мутации в генах А/ГК/са были специфичны и отличались по локализации от мутаций в донорах А/ Лен/17 и А/АА/6/60са. Это касалось и М-гена. Вместо предположительно универсальной мутации для ХА-штаммов, приводящей к замене Ala 86 ser в белке М2, в А/ГК/са присутствовала замена Ile 33 Leu. Вклад в фенотип аттенуации штамма А/ГК/са внесли, по всей вероятности, не только изменения в геноме, произошедшие в стадии холодовой адаптации, но и в стадии пассирования при оптимальной температуре. Появление четырех мутаций, в том числе в генах полимеразного комплекса, уже на уровне 7-го пассажа в КЭ (см. табл. 3) и ареактогенность для волонтеров штамма после 15-го пассажа [3] косвенно подтверждают это предположение. Однако точное генное картирование признаков, определяющих ts, са, авирулентность штамма А/ГК/са - кандидата в доноры аттенуации и высокой репродуктивности - еще предстоит исследовать.

References

Supplementary files