Genotypes 4 and 5 of the Tick-Borne Encephalitis Virus: Features of the Genome Structure and Possible Scenario for its Formation

Full Text

Проведенный нами 10 лет назад анализ степени гомологии небольшого участка гена E (160 н. о.) 29 штаммов вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), изолированных в различных частях ареала [4, 5], показал, что штаммы могут быть дифференцированы на 5 генотипов. Наряду с установленными тремя основными генотипами ВКЭ (1, 2 и 3) были выделены 2 существенно отличающиеся от них штамма - 178-79 и 886-84, предположительно представляющие генотипы 4 и 5. Подтверждение существования 5 генотипов ВКЭ в очагах Восточной Сибири было получено при изучении его географической вариабельности в ходе скрининга 273 коллекционных штаммов с помощью молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (МГНК) [2, 3, 8]. Использование панелей генотипспе-цифических зондов позволило в дальнейшем обнаружить 9 новых изолятов вируса генотипа 5, обозначенных нами также как группа 886. Особенностями штаммов вируса генотипов 4 и 5 являются, во-первых, отличие на уровне 12% и более нуклеотидных замен при сравнении структур 160звенного фрагмента гена белка E (позиции 567-727) от представителей других генотипов (критерий, который был принят для выделения генотипов ВКЭ [5]); во-вторых, “мозаичность” генома - содержание на всем его протяжении участков, специфичных для каждого из трех основных генотипов; в-третьих, обнаружение их в очагах, где одновременно циркулируют 3 основных генотипа и изолированы штаммы, вероятно, представляющие собой смеси генотипов. На этом основании мы сочли возможным выдвинуть гипотезу о формировании “мозаичных” геномов в результате рекомбинационных событий, происходящих при совместной репродукции в организме естественных хозяев вирусов, относящихся к разным генотипам [2, 3]. Высокий уровень гомологии расшифрованных фрагментов геномов вирусов из группы 886, наличие собственного ареала, участие во всех звеньях трансмиссивной цепи и изоляция на протяжении длительного времени указывают на их стабильную циркуляцию в природе. Вопрос о происхождении генотипов 4 и 5 представляется весьма важным для понимания эволюции вируса и современных особенностей этиологии, эпидемиологии и клиники клещевого энцефалита. Цель исследования - на основании анализа репрезентативной выборки расшифрованных нуклеотидных последовательностей установить признаки своеобразия штаммов 178-79 и 886-84 как представителей самостоятельных генотипов и рассмотреть возможный сценарий формирования их генетических структур. Материалы и методы В работе использованы 2 набора выровненных нуклеотидных последовательностей штаммов и изоля-тов РНК вируса КЭ и вируса омской геморрагической лихорадки (ОГЛ), а также соответствующие им аминокислотные последовательности. Один элайнмент состоит из нуклеотидных последовательностей гена E длиной 160 н. о. 643 штаммов и изолятов РНК (список предоставляется по запросу), а другой включает кодирующую часть полногеномных нуклеотидных последовательностей 32 штаммов ВКЭ (FJ997899, AB062064, AB062063, DQ989336, AY182009, AY217093, DQ862460, EF469661, U27495, TEU27491, AM600965, U39292, EF469662, DQ486861,AF069066, AF527415, EU816453, EU816454, EU816451, EU816452, EU816455, EU816450, AY169390, FJ906622, FJ402885, FJ402886, FJ968751, FJ572210, GQ228395, GQ266392, DQ401140 [11] и вируса ОГЛ (NC_005062). Построение филогенетических древ, расчет уровней гомологии сравниваемых последовательностей, поиск аминокислотных горячих точек и уникальных замен производили с помощью программы MEGA [10]. Результаты и обсуждение Сопоставление фрагментов гена E длиной 160 н. о. 643 штаммов и изолятов РНК ВКЭ. В исследованиях, проведенных в 2001 г., было показано [4, 5], что при сопоставлении короткого фрагмента гена E (позиции 567-727) можно однозначно генотипировать ВКЭ, т. е. установить принадлежность того или иного штамма или изолята РНК вируса к одному из пяти генотипов. В последовательности из 53 аминокислот, выведенных из данной нуклеотидной последовательности, для дифференциации ВКЭ являются значимыми позиции E-206, E-232 и E-234. Аминокислотные основания в двух последних позициях входят в состав 14 Таблица 1 Исключительные замены в позиции 206 белка E ВЕЭ Штамм Замена Гено- Год, место и ис- Инв. № тип точник изоляции Lithuania-262 V ^ A 2 2001, Литва, кровь человека AJ414703 SZ Freienbach1 V ^ A 2 2009, Швейцария, I. ricinus HM468153 SZ Freienbach2 V ^ A 2 2009, Швейцария, I. ricinus HM468154 ZH RuetiZH V ^ A 2 2009, Швейцария, I. ricinus HM468191 Pregolya-1 L ^ P 3 1986, Калининград, D. pictus AF224664 пентапептида EGAQN (230-234), который был описан ранее как консервативный для всех штаммов ВКЭ [12, 13]. В позиции E-232 у штамма 178-79 аланин (A) замещен на валин (V). В позиции E-234 штаммы генотипа 1 и все штаммы генотипа 2, кроме двух - Ljubl и OW-Alpnach, а также штаммы 178-79 и 886-84 имеют аспарагин (N), большая часть изученных штаммов генотипа 3 - гистидин (H), а остальные - глутамин (Q) или тирозин (Y). У штаммов генотипа 2 - Ljubl (AF091012), изолированного из крови человека в 1993 г., и OW-Alpnach (HM468146), изолированного от клеща I. ricinus в 2009 г., - аспарагин (N) замещен на треонин (T). Как известно, в позиции 206 находятся специфические для каждого из 3 основных генотипов аминокислоты [1, 9]: серин (S) характерен для генотипа 1; валин (V) - для генотипа 2; лейцин (L) - для генотипа 3. Поэтому многие исследователи при секвенировании небольшого фрагмента генома ВКЭ отдают предпочтение той области гена E, которая перекрывает триплет, соответствующий аминокислоте № 206. Известно также, что единственный представитель генотипа 4 штамм 178-79, как и штаммы генотипа 1, имеет в данной позиции S, а штаммы генотипа 5, как и штаммы генотипа 3, - L. Среди депонированных на сегодня во всемирной базе данных 643 расшифрованных нуклеотидных последовательностей ВКЭ, перекрывающих триплет, кодирующий аминокислоту в позиции 206 белка E (включая фрагменты генома штаммов из группы 886 (EU878281, EU878282, EU878283, HM133639)), известно 5 исключений. Они представлены в табл. 1. Как видно из этой таблица, нетипичные аминокислоты обнаружены у представителей генотипов 2 и 3, причем у наиболее консервативного генотипа 2 в разные годы - в Прибалтике и Центральной Европе. Стоит отметить при этом, что замена V на аланин (A) остается специфической для генотипа 2. Л. С. Карань и соавт. [6] упоминают еще о двух исключениях для дальневосточного генотипа: по одному штамму из Курганской и Омской областей с заменой S на про-лин (P) (S ^ P). Отметим также, что замена у штамма Pregolya-1 сопряжена с заменой T на A (T ^ A) в позиции E-205, что, возможно, компенсирует изменение физико-химических свойств аминокислоты в позиции E-206. Сравнение кодирующей части полногеномных структур и короткого фрагмента гена E 32 штаммов ВКЭ. На рисунке сравниваются полногеномные структуры штаммов ВКЭ и сопоставляются короткие фрагменты гена E (160 н. о.) этих вирусов. По гомологии нуклеотидного состава при сравнении двух элайнментов отмечается общая закономерность и некоторые различия. Закономерность выражается в том, что штаммы 178-79 и 886-84 не входят ни в одну из групп, соответствующих 3 основным генотипам. Различия проявляются в следующем. Анализ первого элайнмента показывает, что генетические структуры штаммов 178-79 и 886-84 в большей степени гомологичны генетической структуре штаммов генотипа 1 (11,2 и 12,6% различий соответственно) и более близки между собой (уровень различий составля- 100 100 100 100 I генотип 1 — 178-79 886-84 I генотип 3 Щгенотип 2 -OHF Различия по кодирующей области генома (10242 н.о.) Генотип 1 Генотип 2 Генотип 3 178-79 Генотип 1 4,2 Генотип 2 16,5 2,6 Генотип 3 14,2 15,5 6,2 178-79 11,2 16,1 14,4 886-84 12,6 15,5 13,8 11,8 0,02 60 46 Различия по фрагменту гена Е (160 н.о. в позициях 567-727) 31 |генотип 1 - 178/79 886-84 97 I генотип 3 I генотип 2 OHF Генотип 1 Генотип 2 Генотип 3 178-79 Генотип 1 5,7 Генотип 2 16,6 2,5 Генотип 3 15,1 14,6 5,5 178-79 14,2 18,5 16,9 886-84 13,7 14,1 12,0 14,4 0,02 Филогенетические схемы (NJ, Kimura-2-parameter) и уровни различий между 32 штаммами ВКЭ по кодирующей части генома (а) и 160-членному фрагменту гена E (б). В сером поле указаны уровни замен внутри генотипов. 15 Таблица 2 Аминокислотные позиции, пригодные для генотипирования вкэ Ген Номера позиций (номера позиций по всему полипротеину) C E NS1 3, 108 206 (486), 317 (597) 54 (830), 141 (917), 285 (1061) NS2A 100 (1228), 127 (1255), 174 (1302), 175 (1303), 225 (1353) NS+ 126 (1615), 258 (1747), 376 (1865) NS4B 21 (2280), 28 (2287) NS5 18 (2529), 297 (2808), 671 (3182), 832 (3343) ет 11,8%), чем к генотипам 3 и 2. В то же время при анализе второго элайнмента видим, что штамм 88684 теснее всего связан с представителями генотипа 3 (12% - минимальный уровень отличий), и при этом он более близок к штаммам генотипа 1 (13,7% различий), чем к штамму 178-79 (14,4%). О рассмотренной закономерности мы уже сообщали [2, 3, 8] как о признаке, указывающем на своеобразие штаммов 178-79 и 886-84. Анализ полипротеиновых структур штаммов ВКЭ, относящихся к 3 основным генотипам, в плане поиска генотипических маркеров позволил выявить 22 горячие точки (включая позицию E-206), пригодные для генотипирования (табл. 2). При сравнении кодирующей части полногеномных структур оказалось, что расположение гено-типспецифических нуклеотидных последовательностей не всегда совпадает с местоположением аминокислотных горячих точек и генотипические различия часто проявляются на уровне мутаций в положении 3 кодона. Это становится очевидным, например, при сопоставлении структур генотип-специфических зондов, разработанных нами для панели, дифференцирующей штаммы ВКЭ [2], и комплементарных им участков генома, кодирующих соответствующие аминокислоты. Так, среди 36 специфических для генотипов 1, 2 и 3 зондов 10 зондов соответствуют участкам генома, на которых различия между генотипами заключаются в наличии различающихся нуклеотидных оснований в положении 3 кодона и не проявляются на уровне аминокислот (M-1, M-2, E-1, E-2, E-3, E-3’, NS1-1, NS2B-3, NS3-2, NS4B-1). При сопоставлении последовательностей полипротеинов 32 штаммов ВКЭ в каждом из 10 белков наряду с позициями, позволяющими дифференцировать одновременно 3 основных генотипа, мы отбирали и те позиции, в которых имеются замены, характерные только для одного или одновременно для 2 или 3 из 5 генотипов (данные не показаны). Установлено, что чередование аминокислот, уникальных как для каждого из 5 генотипов, так и характерных одновременно для 2 или 3 из 5 генотипов наблюдается на всем протяжении исследованных полипротеинов. Среди отобранных по всему полипротеину позиций наряду с сайтами, расположенными отдельно, встречаются и следующие непосредственно друг за другом. По сочетаниям аминокислотных остатков в позициях 108-109 (белок C) или в позициях 1254-1255 (белок NS2A) можно различить одновременно 3 основных генотипа и штаммы 178-79 и 886-84, т. е. дифференцировать все 5 генотипов. В последовательностях полипротеинов штаммов 178-79 и 886-84 чередование уникальных аминокислот сочетается с чередованием аминокислот, характерных для 3 основных генотипов. Также выявлены 3 аминокислотных остатка, являющихся общими исключительно для них двоих: изолейцин (I) в позиции 109 (на конце белка C), лизин (K) в позиции 2074 (белок NS3) и аспарагиновая кислота (D) в позиции 2515 (начало белка NS5). Эти аминокислотные замены можно рассматривать как относительно равномерно расположенные. В табл. 3 показаны аминокислотные замены в позициях, которые были отобраны как пригодные для дифференциации 3 основных генотипов ВКЭ, т. е. как уникальные для каждого из них. Здесь же видим сочетания аминокислот для штаммов 178-79 и 88684, относящихся к генотипам 4 и 5. Оказалось, что в отношении генотипов 1, 2 и 3 аминокислоты в 8 позициях (C-108, E-317, NS1-141, NS3-126, NS3-258, NS4B-21, NS5-297 и NS5-832) не всегда оказываются надежными генотипспецифическими маркерами. Вероятно, при увеличении выборки сопоставляемых полипротеинов в числе «не совсем надежных» для генотипирования позиций могли бы оказаться и другие из остальных 14. Однако не подлежит сомнению тот факт, что определенное сочетание аминокислот с незначительными вариациями в этих 22 позициях является надежным генотипспецифическим признаком. К тому же на примере горячей точки E-206 можно констатировать (см. выше), что аминокислоты и в отдельно взятой позиции могут служить в качестве достаточно стабильного признака. При этом E206A и E206L для всех известных штаммов генотипов 2 и 3 соответственно являются действительно уникальными генотипспецифическими заменами (см. табл. 1). В табл. 4 сравниваются доли замен, уникальных для каждого из 3 основных генотипов и штаммов 178-79 и 886-84. Наибольшее количество уникальных гено-типспецифических замен, а именно 87, выявлено у группы штаммов генотипа 2 (особенно высокая доля замен по генам C (7,1%) и NS2A (5,2%)). Такая закономерность наблюдается по всем генам, кроме NS4A, и, вероятно, ее можно рассматривать как свидетельство в пользу версии о более древнем происхождении генотипа 2. При этом исследованные штаммы генотипа 2 по сравнению с представителями генотипов 1 и 3 имеют наиболее высокие показатели гомологии как нуклеотидного, так и аминокислотного состава, т. е. самый низкий уровень различий. Наименьшее количество уникальных замен (21) обнаружено у штамма 178-79. Заметим, что замены, отобранные как уникальные для генотипов 4 и 5, только условно можно считать таковыми, поскольку эти генотипы представлены одиночными штаммами, и, следовательно, некоторые мутации могут быть штаммоспецифическими, т. е. случайными заменами, не характерными для данного генотипа. Можно заключить, что штамм 178-79 относится к генотипу 4, который по сравнению с остальными известными генотипами характеризуется наименьшим количеством уникальных аминокислотных замен и по уровню гомологии нуклеотидной и аминокислотной 16 Аминокислотные замены в позициях, пригодных для дифференциации трех основных генотипов ВКЭ 17 Примечание. Номера позиций аминокислот, оказавшихся не во всех случаях строго консервативными для каждого из трех основных генотипов, вьщелены курсивом. Каждый оттенок серого цвета в ячейке указывает на соответствие штамма или аминокислотного остатка одному из пяти генотипов ВКЭ. Черный цвет ячейки означает, что аминокислота характерна только для вируса ОГЛ. Таблица 4 количество и доля уникальных для каждого генотипа аминокислотных замен Белок (количество а. о.) Генотип 1 2 3 4 (штамм 178-79) 5 (штамм 886-84) C(112) 2 (1,8%) 8 (7,1%) 3 (2,7%) .2_(_1_8%] 2X1,8%) M (168) 0X0,0%).. 5 (3,0%) 1 (0,6%) 2 (1,2%) 2 (1,2%) E (496) 1 (0,2%) 12 (2,4%) 1 (0,2%) 3 (0,6%) 2 (0,4%) NS1 (352) 2_(р.,60%)_ 10 (2,8%) 2 (0,6%) 2X0,6%! 3 (0,9%) NS2A (230) 6 (2,6%) 12 (5,2%) 6 (2,6%) 1X0:4%) 6 (2,6%) NS2B (131) 0 (0,0%) 5 (3,8%) 2 (1,5%) 0_(0,0%} 1 (0,8%) NS3 (621) 2X0,3%). 15 (2,4%) 6 (1,0%) 4 (0,6%) 2 (0,3%) NS4A (149) ШЛ0/»). 1 (0,7%) 1 (0,7%) 1X0,7%) 1Х0,7%1 NS4B (252) 3 (1,2%) 9 (3,6%) 2 (0,8%) 1 (0,4%) 0X0,0%) NS5 (903) 8 (0,9%) 13 (1,4%) 6 (0,7%) .5X0,6%) 9 (1,0%) Всего (3414) 25 (0,7%) 94 (2,5%) 30 (0,9%) 21 (0,6%) 28 (0,8%) Примечание. Максимальные значения по каждому гену и всему полипротеину отмечены сплошной линией, минимальные - пунктиром; максимальные значения по каждому генотипу отмечены серым полем, минимальные - курсивом. последовательности близко примыкает к генотипу 1; представители группы 886 относятся к генотипу 5, который в меньшей степени, чем генотип 4, примыкает к генотипу 1 и имеет больше общего с генотипами 2 и 3, чем штамм 178-79, но теснее всего связан с последним. Приведенные факты дают представление о геномах 2 рассматриваемых штаммов как о 2 вариантах «переплетений» из последовательностей, характерных для 3 основных генотипов. Как сформировались такие генетические структуры? Для рассмотрения возможного пути их образования учтем следующие обстоятельства. • В ходе эволюции ВКЭ наибольшее распространение получили отдельные его варианты - генотипы 1, 2 и 3. Каждый из них развивался самостоятельно, чему, по-видимому, способствовали достаточно длительные периоды географической изоляции. Об этом, например, свидетельствует тот факт, что каждый из 3 основных генотипов обладает собственным ареалом. В настоящее время эти ареалы перекрываются. • Генотип 4 обнаружен в единственном очаге на территории Восточной Сибири. По уровню гомологии нуклеотидной и аминокислотной последовательности он более близок к генотипу 1, чем к генотипам 2 и 3. • Генотип 5 обладает меньшим сходством с генотипом 1 по сравнению с генотипом 4 и имеет больше общего с генотипами 2 и 3, чем с генотипом 4, но теснее всего связан с последним. Он имеет собственный ареал, охватывающий юг Восточной Сибири и Северную Монголию (один изолят недавно обнаружен в Монголии [7]). • Представители генотипов 4 и 5 обнаружены в очагах, где одновременно присутствуют все известные генотипы ВКЭ и зафиксированы политиповые штаммы, т. е. штаммы, представляющие собой смеси генотипов. • Структуры каждого из 3 основных генотипов, как и у штаммов генотипов 4 и 5, представляют собой последовательности, состоящие из чередований участ ков, одни из которых являются уникальными для каждого из генотипов, другие - общими для всех трех, а третьи - общими для 2 из 3. Однако частота чередований таких участков у штаммов 178-79 и 886-84 выражена в большей степени, чем у представителей 3 основных генотипов. Филогенетические схемы показывают, что нуклеотидные последовательности генотипов 4 и 5 - это промежуточные варианты между генотипами 2 и 3, с одной стороны, и генотипом 1 - с другой. Согласно этим схемам, штаммы 886-84 и 178-79, возможно, являются предшественниками штаммов генотипа 1, который в таком случае следует рассматривать как самый «молодой» из известных генотипов ВКЭ. Если это так, то можно ли трактовать наличие в геноме генотипа 1 относительно равномерно расположенных участков, характерных только для генотипа 2 или только для генотипа 3, исключительно как конвергентное сходство? Логичнее предположить, что имеющая место «мозаичность» геномов является прежде всего результатом множественных рекомбинаций, и эти рекомбинации являются причиной, из-за которой сложно разобраться в родственных взаимоотношениях генотипов ВКЭ. В этом случае можно представить следующий ход событий. На территории Восточной Сибири в силу неизвестных естественных причин имелись очаги, в значительной мере изолированные от других природных очагов на протяжении по крайней мере того периода времени, который длился с момента появления предковых форм штаммов 178-79 и 886-84. При этом изоляция, по-видимому, носила односторонний характер - в такие «наполовину» изолированные очаги заносились варианты вируса генотипов 1, 2 и 3 без возможности выноса и имелись «подходящие» условия для одновременной репродукции вирусных частиц разных генетических линий в одной клетке. Последнее обстоятельство способствовало образованию рекомбинантов. Вмешательство человека (скорее всего лесозаготовительная деятельность в 50-60-е годы прошлого столетия) нарушило сложившуюся схему циркуляции вируса. Можно допустить, что множественная рекомбинация независимо от ее частоты вносит существенный вклад в видообразование ВКЭ. Отсюда становится понятной и возможная причина противоречивости классификационных схем переносимых клещами флавивирусов млекопитающих. Вероятно, рекомбинанты проходят очень жесткий многоуровневый отбор, первым этапом которого является соответствие четко определенной вторичной структуре геномной молекулы. На это указывает достаточно частое выявление наличия для каждого из генотипов строго определенного нуклеотидного основания в позиции 3 кодона. Таким образом, результаты проведенного анализа полногеномных и полипротеиновых структур штаммов ВКЭ, депонированных в GenBank, указывают на существование как минимум 5 генотипов вируса. Показано, что геномы штаммов генотипов 4 и 5 можно рассматривать как представителей 2 вариантов тесных “переплетений” из последовательностей, характерных для генотипов 1, 2 и 3. 18 Эволюционная история ВКЭ не ясна, сложны филогенетические взаимоотношения между генотипами: если генотип 1 самый “молодой”, а генотип 2 наиболее древний, то почему в ряде позиций они имеют общие аминокислоты, не характерные для остальных генотипов. Почему при этом последовательности генотипа 2 более консервативны (стабильны), а у генотипа 1 имеются общие замены с вирусами комплекса КЭ? Вероятнее всего, ярко выраженная “мозаичность” в строении геномов генотипов 4 и 5, как и обозначенные противоречия, есть следствие рекомбинационных событий. ЛИТЕРАТУРА 1. Демина Т. В. Характеристика генетической вариабельности штаммов вируса клещевого энцефалита на основе анализа гомологии участков вирусного генома: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Иркутск, 1999.

References

Supplementary files