Том 68, № 3 (2023)
ОБЗОРЫ
Экзосомы в жизненном цикле вирусов и патогенезе вирусных инфекций
Аннотация
Экзосомы – внеклеточные везикулы эндосомального происхождения c двухслойной мембраной, диаметром 30–160 нм. Экзосомы высвобождаются из клеток разного происхождения и определяются в различных биологических жидкостях организма. Они содержат клеточные нуклеиновые кислоты, белки, липиды, метаболиты и могут передавать содержимое клеткам-реципиентам. В биогенезе экзосом участвуют клеточные белки семейства Rab ГТФаз и системы ESCRT, которые регулируют почкование, транспорт везикул, сортировку молекул, слияние мембран, образование мультивезикулярных телец и секрецию экзосом. Из клеток, инфицированных вирусами, высвобождаются экзосомы, которые содержат геномные вирусные ДНК и РНК, а также мРНК, микроРНК, другие виды РНК, белки и вирионы. Экзосомы способны переносить вирусные компоненты в неинфицированные клетки различных органов и тканей. В настоящем обзоре проанализировано влияние экзосом на жизненный цикл широко распространённых вирусов, вызывающих серьёзные заболевания человека: вирус иммунодефицита человека 1-го типа, вирус гепатита В, вирус гепатита С, SARS-CoV-2. Вирусы способны проникать в клетки путём эндоцитоза, используют молекулярные и клеточные пути с участием белков Rab и ESCRT для высвобождения экзосом и распространения вирусных инфекций. Показано, что экзосомы могут оказывать разнонаправленные действия на патогенез вирусных инфекций, подавляя или способствуя развитию вызываемых ими заболеваний. Экзосомы потенциально могут использоваться в неинвазивной диагностике как биомаркеры стадии инфекции, а экзосомы, нагруженные биомолекулами и лекарственными препаратами, – как терапевтические средства. Генетически модифицированные экзосомы – перспективные кандидаты для новых противовирусных вакцин.
181-197
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Предиктивная роль эритроцитов в оценке исходов COVID-19
Аннотация
Введение. Поиск доступных и точных предикторов исхода COVID-19 имеет крайне важное значение, так как позволяет эффективно корригировать тактику лечения пациента.
Цель работы – на основе динамики показателей красной крови разработать простые и точные критерии, предсказывающие исход COVID-19.
Материалы и методы. Наблюдения проведены у 125 пациентов с тяжёлым и крайне тяжёлым течением COVID-19, у которых на 1, 5, 7, 10, 14 и 21-й день пребывания в стационаре в динамике определялись показатели, характеризующие состояние красной крови. Для расчёта пороговых значений выживаемости и летальности, имеющих предиктивную ценность, проводился ROC-анализ.
Результаты. Общее число эритроцитов и уровень гемоглобина у тяжелобольных и крайне тяжелобольных не выходили за пределы допустимых норм, хотя в группе умерших на всём протяжении исследования проявляли тенденцию к уменьшению. В 1-й и 21-й день количество MacroR у умерших по сравнению с выжившими было сниженным. Установлено, что по показателю RDW-CV с большой долей вероятности на относительно ранних сроках можно судить об исходе заболевания COVID-19. Дополнительным критерием исхода COVID-19 может служить показатель RDW-SD.
Заключение. Показатели RDW-CV и RDW-SD при тяжёлом течении COVID-19 могут быть использованы как эффективные предикторы исхода заболевания.
198-204
Формирование и сохранение специфического Т-клеточного иммунитета после перенесённой COVID-19-инфекции или вакцинации против неё
Аннотация
Цель работы – оценка показателей специфического Т-клеточного иммунитета в отношении SARS-CoV-2 при первичном и вторичном ответе на антигены вируса скрининговым методом.
Материалы и методы. Пациенты, перенёсшие COVID-19 в лёгкой и среднетяжёлой форме, были обследованы через 1–1,5 месяца после заболевания и через 6–10 месяцев (перед вакцинацией и после неё). Здоровые добровольцы обследованы перед вакцинацией «Гам-КОВИД-Вак», 2–6 раз в ходе неё, а также через 6–8 месяцев (перед ревакцинацией и после неё). Уровень антител класса IgG и IgM к SARS-CoV-2 оценивали методом ИФА на тест-системах фирмы «Вектор-Бест» (Россия). Антигенную (АГ) активацию Т-клеток во фракции мононуклеаров, выделенных из крови обследуемых, оценивали по повышению продукции IFN-γ после АГ-стимуляции этих клеток в лунках готовых планшетов из ИФА-наборов, предназначенных для обнаружения антител против SARS-CoV-2. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Excel и Statistica 10.0.
Результаты. После вакцинации здоровых людей у 88,5% выявлены АГ-специфические Т-клетки, причём у половины появление в крови Т-клеток, распознающих антиген, опережало появление антител к нему. Через 6–8 месяцев снижается как уровень АГ-активации, так и число проб, в которых она регистрируется. При ревакцинации уровень АГ-активации Т-клеток памяти in vitro повышается, и они до полугода выявляются у 76,9–100,0% привитых. Напротив, после COVID-19 у 86,7% людей на момент вакцинации в крови сохранялись АГ-специфические Т-клетки с высокой активностью. После вакцинации переболевших значимо увеличились показатели активности Т-клеток, распознающих RBD-домен S-белка SARS-CoV-2, и доля людей, в крови которых эти клетки выявлялись.
Заключение. Показано, что Т-клеточный иммунитет против антигенов вируса SARS-CoV-2 сохраняется не менее 6 месяцев после заболевания. У привитых ранее не болевших COVID-19 людей такая длительность сохранения АГ-специфических Т-клеток в циркулирующей крови достигается только после ревакцинации.
205-214
Интраназальная вакцина против COVID-19 на основе рекомбинантного варианта вируса Сендай (Paramyxoviridae: Respirovirus) штамма Москва
Аннотация
Введение. Одним из наиболее удобных, безопасных и эффективных способов профилактики респираторных инфекций, включая COVID-19, является интраназальная вакцинация с использованием живых векторных вакцин на основе непатогенных или слабопатогенных для человека вирусов. Вирус Сендай как нельзя лучше подходит для этих целей, поскольку он является респираторным вирусом и способен, не вызывая заболевания, ограниченно реплицироваться в клетках бронхиального эпителия человека.
Цель работы – конструирование и изучение вакцинных свойств рекомбинантного варианта вируса Сендай штамма Москва, экспрессирующего секретируемый рецептор-связывающий домен S-белка SARS-CoV-2 штамма дельта (RBDdelta), при однократной интраназальной иммунизации.
Материалы и методы. Рекомбинанный вариант вируса Сендай штамма Москва, несущий встройку трансгена RBDdelta между генами Р и М, сконструирован методами обратной генетики и синтетической биологии. Экспрессию трансгена RBDdelta оценивали методом вестерн-блоттинга. Иммуногенность и протективность вакцины исследовали на двух моделях: сирийских хомяках и мышах линии BALB/c. Иммуногенность оценивали методами ИФА и в реакции вируснейтрализации. Протективность оценивали по уровню снижения репликации вируса SARS-CoV-2 в тканях носовой полости и лёгких методом количественной ОТ-ПЦР-РВ у вакцинированных животных, а также гистологическим анализом лёгких.
Результаты. На основе штамма Москва вируса Сендай сконструирован рекомбинантный вариант Sen-RBDdelta(M), экспрессирующий секретируемую форму RBDdelta, которая иммунологически идентична природному RBD S-белка SARS-CoV-2. Однократное интраназальное введение Sen-RBDdelta(M) сирийским хомякам и мышам линии BALB/c значимо – в 15 и 107 раз соответственно – снижает репликативную активность SARS-CoV-2 в лёгких животных, предотвращая развитие пневмонии. На мышиной модели также показана эффективная индукция вируснейтрализующих антител против дельта-штамма SARS-CoV-2.
Заключение. Рекомбинантный вариант вируса Сендай штамма Москва Sen-RBDdelta(M) является перспективным вакцинным конструктом в отношении инфекции SARS-CoV-2 и обладает протективными свойствами уже при однократном интраназальном введении.
215-227
Частота встречаемости мутаций лекарственной устойчивости и ускользания от иммунного ответа в геноме вируса гепатита В, выявленного у беременных в Гвинейской Республике
Аннотация
Введение. Несмотря на все усилия по ограничению передачи вируса гепатита В (ВГВ) от матери ребёнку, понимание течения хронического гепатита В (ХГВ) у беременных женщин всё ещё ограниченно. Одним из регионов с крайне высокой распространённостью ХГВ является Африка: здесь суммарное количество больных составляет приблизительно 75 млн человек. Кроме того, серьёзным фактором, способным повлиять как на лечение, так и на вакцинную профилактику, могут являться мутации вируса. Таким образом, изучение генетической гетерогенности ВГВ является значимым.
Цель работы – оценить распространённость мутаций лекарственной устойчивости и мутаций ускользания от иммунного ответа ВГВ у беременных женщин в Гвинейской Республике.
Материалы и методы. Исследованы образцы плазмы крови, полученные от 480 беременных женщин из разных регионов Гвинейской Республики с лабораторно подтверждённым ВГВ. Нуклеотидные последовательности для определения генотипов и выявления мутаций получали с использованием nested-ПЦР с последующим секвенированием по Сэнгеру на базе перекрывающихся пар праймеров, совместно фланкирующих полный геном вируса.
Результаты и обсуждение. В обследованной группе чаще всего обнаруживали вирус генотипа Е (92,92%) по сравнению с субгенотипами А1 (1,67%), А3 (1,46%), D1 (0,63%), D2 (1,04%) и D3 (2,29%). Среди обследованных ВГВ-инфицированных беременных было выявлено 188 человек (39,17%) с неопределяемым HBsAg. Мутации лекарственной устойчивости вируса были выявлены у 33 человек, что составило 6,88%. Обнаружены следующие мутации: S78T (27,27%), L80I (24,24%), S202I (15,15%), M204I/V (42,42%). Показано также наличие полиморфных вариантов, не описанных как фармакорезистентные, в положениях, связанных с развитием лекарственной устойчивости к тенофовиру, ламивудину, телбивудину и энтекавиру (L80F, S202I, M204R). При анализе MHR и региона детерминанты α мутации выявлены у 318 (66,25%) беременных. Из них у 172 человек, что составило 54,09%, обнаружены множественные мутации. Определено наличие замен в 13 позициях, ассоциированных с HBsAg-негативным ХГВ и (или) потенциально влияющих на антигенность HBsAg.
Заключение. Выявленная среди терапевтически наивных беременных женщин широкая распространённость мутаций иммунного бегства и лекарственной устойчивости, способных приводить к ложноотрицательным результатам скрининга на HBsAg, безуспешной профилактике и вирусологической неэффективности терапии ВГВ-инфекции, представляет собой серьёзную проблему.
228-241
В ПОМОЩЬ ВИРУСОЛОГУ
Ускоренный метод иммуноферментного анализа для выявления ортопоксвирусов
Аннотация
Введение. Массовая вакцинация против натуральной оспы была прекращена в 1980 г. вследствие успешной ликвидации заболевания. В то же время возможность применения вируса натуральной оспы в военных или террористических целях, а также заболевания, вызываемые вирусом оспы обезьян в африканском регионе, а в последнее время и в неэндемичных районах других континентов, остаются угрозой для невакцинированного населения. В случаях возникновения этих заболеваний большое значение имеет быстрая диагностика, поскольку от неё зависит скорость и в конечном счёте эффективность лечебных и карантинных мероприятий.
Цель – создание набора реагентов для иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющего быстро и с высокой чувствительностью выявлять ортопоксвирусы (ОПВ) в клинических образцах.
Материалы и методы. Методом одностадийного ИФА оценивали эффективность выявления вирусов в криолизатах образцов культуры клеток CV-1, инфицированных вирусами осповакцины, оспы коров, оспы кроликов и эктромелии, а также в клинических образцах инфицированных кроликов и мышей.
Результаты. Показано, что ускоренный вариант ИФА позволяет обнаруживать ОПВ в неочищенных вирусных образцах в диапазоне 5,0 × 102–5,0 × 103 БОЕ/мл, а в клинических пробах – при вирусной нагрузке, превышающей 5 × 103 БОЕ/мл.
Заключение. Анализ включает минимальное число операций и может быть выполнен в течение 45 мин, что позволяет использовать его в условиях повышенного уровня биобезопасности. Ускоренный ИФА изготовлен с использованием поликлональных антител, что значительно упрощает производство диагностической системы и снижает его стоимость.
242-251
Математическая модель для оценки уровня перекрёстного иммунитета между штаммами вируса гриппа подтипа H3N2
Аннотация
Введение. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) регулярно обновляет рекомендации по вакцинам против гриппа с целью достижения их максимального соответствия очередным циркулирующим штаммам. Тем не менее на протяжении нескольких сезонов эффективность вакцины против гриппа А, а именно её компоненты H3N2, определялась как низкая.
Цель исследования – разработка математической модели перекрёстного иммунитета на основании имеющегося массива опубликованных ВОЗ данных реакции торможения гемагглютинации (РТГА).
Материалы и методы. В настоящей работе представлена математическая модель, основанная на нахождении с помощью регрессионного анализа зависимости титров РТГА от замен в антигенных сайтах последовательностей. Разработанная нами компьютерная программа имеет возможность обрабатывать данные (GISAID, NCBI и др.) и формировать в режиме реального времени базы данных согласно поставленным задачам.
Результаты. На основе наших исследований был вычленен дополнительный антигенный сайт F. Разница в 1,6 раза скорректированного R2 на подмножествах вирусов, выращенных в культуре клеток и культивируемых в куриных эмбрионах, демонстрирует обоснованность нашего решения о разделении первоначального массива данных по пассажным историям. Нами введено понятие степени гомологичности между двумя произвольными штаммами, которая принимает значение функции, зависящей от дистанции Хэмминга, и показано, что результаты регрессии существенно зависят от выбора функции. Проведённый анализ показал, что наиболее значимыми антигенными сайтами являются A, B и E. Полученные результаты прогноза титров РТГА показали достаточно хороший результат, сопоставимый с аналогичными работами наших коллег.
Заключение. Предложенный метод может послужить хорошим инструментом для будущих прогнозов с дальнейшим изучением для подтверждения его устойчивости.
252-264
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Анализ мутаций резистентности среди изолятов вируса гепатита С, циркулирующих в Кыргызстане
Аннотация
Введение. Страны Центральной Азии, включая Кыргызстан, характеризуются высокими показателями распространения и инфицирования вирусом гепатита С (ВГС). Определение генотипической принадлежности и мутаций резистентности к препаратам прямого противовирусного действия (ПППД) среди изолятов ВГС играет важную роль не только при проведении молекулярно-эпидемиологических исследований, но и при выборе тактики назначаемой терапии.
Цель работы – изучение генотипического разнообразия вариантов ВГС, циркулирующих на территории Кыргызстана, и выявление среди них мутаций, ассоциированных с развитием резистентности к ПППД.
Материалы и методы. В работе проанализировано 38 сывороток от ВГС-инфицированных жителей Кыргызстана. Определение нуклеотидных последовательностей анализируемых фрагментов вирусных генов NS3, NS5A и NS5B проводили прямым секвенированием ампликонов по методу Сэнгера. Полученные нуклеотидные последовательности депонированы в международную базу GenBank под номерами ON841497–ON841534 (для фрагмента NS5В), ON841535–ON841566 (для фрагмента NS5А) и ON841567–ON841584 (для фрагмента NS3).
Результаты. Основными субтипами ВГС, циркулирующими на территории Кыргызстана, являются 1b (52,6%; 95% ДИ 37,3–67,5%) и 3а (44,8%; 95% ДИ 30,2–60,2%), в единичном случае обнаружен субтип 1а (2,6%; 95% ДИ 0,5–13,4%). У 37% (95% ДИ 19–59%) изолятов субтипа 1b выявлена мутация С316N в NS5A-гене; у 46% (95% ДИ 23–70%) обнаружена мутация F37L в NS5A-гене; у 45% (95% ДИ 22–72%) обнаружена мутация Y56F в NS3-гене. Мутаций резистентности в регионе NS5B среди изучаемых изолятов ВГС субтипа 3a обнаружено не было; у 22% (95% ДИ 9–45%) изолятов выявлена мутация Y93H в NS5А-гене; среди всех проанализированных последовательностей NS3-гена выявлен набор мутаций Y56F + Q168 + I170. При анализе единичного изолята субтипа 1а мутаций, ассоциированных с развитием резистентности к ПППД, выявлено не было ни в одном из изучаемых генов.
Заключение. Показана достаточно высокая распространённость мутаций, ассоциированных с развитием резистентности или значительным снижением чувствительности к терапии ПППД среди изолятов ВГС, циркулирующих в Кыргызстане. Актуализация данных по генотипическому разнообразию ВГС необходима для своевременного планирования санитарно-эпидемиологических мероприятий.
265-270
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.