Синтез и характеристика вирусоподобных частиц ротавируса А (Reoviridae: Sedoreovirinae: Rotavirus: Rotavirus A) человека

Полный текст

Введение

Ротавирусный гастроэнтерит – высококонтагиозное острое кишечное заболевание, особенно тяжело протекающее у детей младше 5 лет. Возбудителем инфекции является ротавирус (РВ) (род Rotavirus семейства Reoviridae). Ежегодно ротавирусная инфекция (РВИ) приводит к смерти более 200 тыс. детей во всём мире [1]. В России заболеваемость ей в 2019 г. составила 70,26 на 100 тыс. населения (в 2018 г. – 81,3) [2, 3].

Основным и наиболее эффективным методом специфической профилактики РВИ считается вакцинация [1]. Более чем в 100 странах мира для иммунизации детей используются 2 живые ослабленные вакцины: моновалентная Rotarix® («GlaxoSmithKline», Бельгия) и пентавалентная RotaTeq® («Merсk & Co», США). Первый препарат разработан на основе аттенуированного штамма человеческого возбудителя, циркулировавшего в США с 1988 по 1998 г., который был клонирован и ослаблен путём многократных пассажей в культуре [4]. 5-валентная вакцина RotaTeq® создана из штамма РВ крупного рогатого скота (КРС), модифицированного посредством реассортации (смешения генетического материала) с несколькими возбудителями РВИ человека; в результате получена комбинация из 5 вирусных штаммов с полным набором основных антигенов (АГ) человеческого инфекционного агента. С 2012 г. эта вакцина зарегистрирована в Российской Федерации. Помимо этого на международном уровне доступны преквалифицированные ВОЗ моновалентная вакцина Rotavac® («Bharat Biotech», Индия) и 5-валентная RotaSiil® (Serum Institute of India, Индия) [4, 5].

Однако, несмотря на высокую протективную эффективность живых вакцинных препаратов, при их применении возможно возникновение серьёзных осложнений, включая инвагинацию кишечника [6]. Кроме того, всегда сохраняется риск восстановления вирулентности штаммов вакцин вследствие реассортации с вирулентными полевыми штаммами РВ [7]. В связи с этим продолжаются исследования в области поиска и апробации новых подходов к вакцинации, исключающих или ограничивающих использование живого инфекционного агента. Подобные методики предполагают, в частности, применение в качестве АГ рекомбинантных вирусных белков [4] и вирусоподобных частиц (ВпЧ) на их основе [8–10].

Вирион РВ состоит из 6 структурных белков: VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 и VP7. Из них первые 3 формируют внутренний слой оболочки вируса. Белок VP6, на долю которого приходится около 80% всей белковой массы вириона, является основной группоспецифичной антигенной детерминантой РВ. Наибольший интерес в качестве возможных АГ для включения в состав вакцин представляют белки VP4 и VP7, образующие внешнюю часть оболочки, поскольку именно они индуцируют образование вируснейтрализующих антител (АТ) и обусловливают серотипические отличия вируса [1]. На сегодняшний день известно 36 серотипов гликозилированного белка VP7 (G-протеина), из которых 13 обнаружены в человеческих образцах. Наиболее распространены в мире 6 серотипов (G1, G2, G3, G4, G9 и G12) [11]. Для чувствительного к протеиназе белка VP4 (P-протеин) к настоящему времени выявлен 51 P-серотип (16 встречаются в образцах тканей человека) [12]. Всего из клинических образцов выделены 73 G/Р-комбинации, однако варианты генотипов G4[P8], G1[P8], G3[P8], G2[P4], G9[P8] составляют свыше 90% от всех известных [13]. Таким образом, именно они должны использоваться в качестве потенциальных кандидатов при создании эффективной вакцины на основе рекомбинантных белковых элементов.

Рекомбинантные белки РВ VP2, VP4, VP6 и VP7 в различных сочетаниях, полученные с использованием бакуловирусной системы экспрессии, обладают способностью к спонтанной самосборке с образованием ВпЧ. При этом VP2 и VP6 формируют «базовые» структуры, на основе которых возможно образование более сложных 3- и 4-компонентных частиц с участием VP4 и VP7. Конформация рекомбинантных белков в таких структурах близка к нативной, что обусловливает их специфическую иммуногенность, а отсутствие генетического материала исключает инфекционность ВпЧ. Таким образом, подобные частицы могут быть использованы в качестве альтернативных АГ при вакцинации [8, 10]. Цель настоящего исследования – разработать технологию производства ВпЧ на основе белков РВ А VP2, VP6, а также VP4 и VP7 – наиболее представленных на территории Российской Федерации генотипов; дать их молекулярно-генетическую и вирусологическую характеристику.

Материал и методы

Вирус. В работе использовали вирулентный штамм РВ А человека Wa G1P[8], адаптированный к культуре клеток MARC-145, который культивировали и очищали по ранее описанной авторами методике [14, 15].

Генно-инженерные конструкции. Синтетический ген, кодирующий кодон-оптимизированную последовательность гена VP6 актуального эпидемического изолята РВ А человека RVA/Human-wt/ GR/Ath146/2010/G4P[8] (KC890881 в базе данных GenBank), изготовлен по нашему заказу (ЗАО «Евроген», Россия) и клонирован в трансферную плазмиду для бакуловирусной системы экспрессии pFastBacDual (под промотором полиэдрина) из набора Bac-to-Bac («Invitrogen», США). В ту же плазмиду под промотором p10 клонирован ген белка VP2, слитый с зелёным флуоресцентным белком (eGFP): на основе гена VP2 [16] создана конструкция, представляющая собой его делеционный вариант, в котором вместо удалённых первых 276 нуклеотидов на N-конце вставлена последовательность, кодирующая eGFP [17] и соединённая с VP2 нейтральным спейсером Ser-Arg-Gly-Ser (eGFP-Delta92-VP2). Ген eGFP-Delta92-VP2 был синтезирован по нашему заказу (ЗАО «Евроген»).

Кодирующие белки VP4 и VP7 гены также синтезированы по нашему заказу («Synbio Technologies», США) и клонированы в трансферные плазмиды pFastBacHTa для бакуловирусной системы экспрессии Bac-to-Bac («Invitrogen»). Использованы генотипы (P4, P8, G1, G2, G4, G9) актуальных для России эпидемических изолятов: RVA/Hu-wt/RUS/Novosibirsk/ Nov10-N404/P[4]/2010/G2G4P[4]P[8] (KF648975.2 в базе данных GenBank); RVA/Hu-wt/RUS/Novosibirsk/ Nov10-N344/2010/G2G4P[8] (JQ613159.2 в GenBank); Human rotavirus A isolate Nov10-N327 (HQ537514.2 в GenBank); Human rotavirus A isolate Hu/RUS/ Nov10-N539/2010/G2P[4] (JX110838); RVA/Hu-wt/ RUS/Novosibirsk/Nov11-N2735/2011/G4P[8]b (MK060169.1); Hu/RUS/Nov04-H672/2007/G9P[8] (FJ529386.2 в базе данных GenBank). Рекомбинантные бакуловирусы (VP2-GFP/VP6, VP4(P4), VP4(P8), VP7(G1), VP7(G2), VP7(G4), VP7(G9)) получены с помощью системы экспрессии Bac-to-Bac («Invitrogen») по методике производителя с использованием компетентных клеток DH10Bac©.

Получение и очистка вируса и ВпЧ. Трансфекцию перевиваемой линии клеток кукурузной лиственной совки (Spodoptera frugiperda) Sf-21 осуществляли очищенными препаратами бакмидной ДНК (бакRVA) с применением катионного липосомного агента Cellfectin («Invitrogen»); для каждой конструкции использовали по 2 клона (посевная концентрация клеток 5 × 10⁵/мл, 10 мкл бакмиды). После трансфекции проводили ещё 2 пассажа на клетках Sf-21, после чего выполняли коинфекцию перевиваемой клеточной культуры совки (Trichoplusia ni), культивируемой на протяжении 7 сут после заражения.

Культуральную жидкость, содержащую вирус или ВпЧ, подвергали низкоскоростному центрифугированию, освобождая от клеток и клеточного дебриса при 1000 об/мин на протяжении 5 мин и при 6000 об/ мин 20 мин соответственно (4 °С, ротор Sorval® SS34, «Thermo Scientific»). Полученные осветлённые суспензии наслаивали на 6 мл 25 или 35% (w/v) сахарозы, приготовленной на буфере TNС (10 мM Tris-HCl, 140 мM NaCl, 10 мM CaCl₂; рН 7,4), затем центрифугировали в течение 2 ч при 28 000 об/мин (4 °С; центрифуга Оptima XE-100, ротор SW 32Ti, «Beckman Coulter», США). Полученные осадки ресуспендировали в буфере TNС и хранили при той же температуре.

Непрямой иммуноферментный анализ (ИФА). Для оценки иммунохимической активности рекомбинантных белков в лунки иммунологического планшета («Greiner», Германия) вносили 0,1 мл клеточного лизата или очищенного препарата в 0,1 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН = 9,5. Планшет инкубировали 18 ч при 4 °С, после этого удаляли избыток АГ 5-кратной отмывкой ФСБТ (0,01 М фосфатный буфер, 170 мM NaCl, 0,1% твин-20; pH 7,4). Свободные участки пластика блокировали 1% желатином («Gerbu», Германия) в ФСБТ (1 ч при 37 °С), удаляли блокирующий раствор и вносили в лунки 0,1 мл моноклональных антител (МКАТ) к белку VP6 («Ingenasa», Испания) или полигистидиновому фрагменту («Sigma», США) в ФСБТ с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина. Далее повторно инкубировали планшет в течение 1 ч при 37 °С, промывали ФСБТ и добавляли в лунки по 0,1 мл раствора меченных пероксидазой АТ к иммуноглобулину IgG мыши («Sigma»). Через 1 ч инкубации при 37 °С планшет отмывали ФСБТ и вносили в лунки 100 мкл субстратного раствора с тетраметилбензидином (ООО «Хема», Россия), после чего инкубировали 15 мин при комнатной температуре (20–25 °С) и останавливали реакцию добавлением 0,1 мл 1 M H₂SO₄. Интенсивность окраски в лунках определяли на спектрофотометре с вертикальным лучом («Multiskan EX», Thermo, США) при длине волны 450 нм.

Электрофорез. Степень чистоты препаратов оценивали методом электрофореза (ЭФ) белков в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат (лаурилсульфат) натрия (ПААГ-ДСН). Процедуру проводили в пластинах полиакриламидного геля размером 70 × 100 × 0,75 на приборе Mini-PROTEAN II («Bio-Rad», США) в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 В.

Иммуноблоттинг. После электрофоретического разделения белки из геля переносили на мембрану Immobilon-Р («Millipore», США) на приборе TransBlot SD («Bio-Rad») при постоянной силе тока 200 мА
в течение 1 ч при комнатной температуре (20–25 °С). После электропереноса не связавшиеся с белками участки мембраны блокировали 1% желатином («Gerbu») в ФСБТ 1 ч при 37 °С. Далее мембрану отмывали 4 раза ФСБТ и 4 раза – ФСБ (0,01 М фосфатный буфер, 170 мM NaCl; pH 7,4) и инкубировали с МКАТ к белку VP6 («Ingenasa»), АТ к eGFP или полигистидиновому фрагменту («Sigma») на протяжении 1 ч при 37 °С, после чего повторно промывали ФСБТ и инкубировали в таких же условиях. Затем добавляли меченные пероксидазой АТ к иммуноглобулину IgG мыши («Sigma»); мембрану повторно отмывали (по 4 раза последовательно ФСБТ и ФСБ) и окрашивали смесью 3,3’ диаминобензидина и 4-хлоронафтола с 0,01% H₂O₂. Окрашивание останавливали промыванием мембраны в воде.

Определение концентрации белка. Концентрацию белка в растворах определяли с использованием коммерческого набора Micro BCA Protein Assay Kit («Thermo», США).

Электронная микроскопия (ЭМ). 3 мкл препарата с концентрацией 12–30 мг/мл наносили на медную сетку, покрытую углеродной подложкой («Ted Pella») и обработанную в атмосфере тлеющего разряда, инкубировали 30 с при комнатной температуре (20–25 °С). Затем на сетку наносили 1 каплю (50 мкл) 2% раствора ацетата урана, после чего выдерживали 30 с; излишки раствора удаляли с сетки фильтровальной бумагой. Окрашенные сетки хранили в пластиковых контейнерах до использования. Исследование образцов производили в просвечивающем электронном микроскопе JEOL 2100 («JEOL», Япония), снабжённом катодом из гексаборида лантана (LaB₆), при ускоряющем напряжении 200 кВ. Изображения получали с увеличением ×25 000 при помощи ПЗС-камеры Gatan X100 («Gatan», США) с размером матрицы 2000 × 2000 пикселей.

Результаты

Ранее нами изучено генетическое разнообразие РВ А на территории г. Москвы [18] и на основании полученных, а также литературных данных [19] определены наиболее представленные в Центральной части России генотипические варианты с учётом первичной последовательности генов, кодирующих белки VP4 и VP7. Более 90% образцов принадлежали к генотипам G9P[8], G4P[8], G2P[4], G1P[8]. Таким образом, для включения в состав ВпЧ выбраны белки внешнего слоя 6 генотипов (G1, G2, G4, G9, P4, P8), а также VP2 и VP6, необходимые для сборки этих частиц.

В целях создания белковой конструкции VP2/VP6 последовательность соответствующих генов оптимизирована для экспрессии в клетках насекомых, получена синтетическим путём, затем клонирована в соответствующие участки вектора pFastBacDual. Этот вектор, в свою очередь, предназначен для создания рекомбинантного бакуловируса, экспрессирующего одновременно 2 разных клонированных гена. Согласно литературным данным [17] добавление eGFP к VP2 не влияет на способность химерного белка участвовать в формировании ВпЧ; при этом контроль за наращиванием рекомбинантного белка в клеточной культуре значительно облегчается возможностью визуального наблюдения за процессом с помощью флуоресцентного микроскопа в режиме реального времени.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие выбранные генотипы белков VP4 и VP7, также оптимизированы для наработки в клетках насекомых и получены синтетически, затем клонированы в трансферный вектор pFastBacHTa. Особенностью последнего является наличие последовательности полигистидинового фрагмента на участке, кодирующем N-конец белка, с целью возможности очистки продукта методом металлоаффинной хроматографии и детекции с применением специфических антигистидиновых МКАТ. Каждая последовательность клонирована в отдельный трансферный вектор, при помощи которых гены белков РВ А перенесены в бакуловирусный геном. После трансфекции клеток Sf-21 бакмидами, содержащими гены белков VP6 и eGFP-Delta92-VP2, последующий пассаж вируса проводили на клеточной культуре T. ni и наблюдали за появлением флуоресценции, сравнивая заражённые бакуловирусом дикого типа и инфицированные eGFP-Delta92-VP2/ VP6 клетки. Результаты представлены на рис. 1, a–в.

Кинетику накопления базовых ВпЧ eGFP-Delta92- VP2/VP6 оценивали по характеру флуоресценции на инвертированном микроскопе Olympus («Olympus», Япония) и методом непрямого ИФА с МКАТ к полигистидину. В результате установлено, что максимальное накопление АГ наблюдалось на 2-е сут после заражения. Однако в случаях коинфицирования рекомбинантным бакуловирусом со вставкой VP2/VP6 и 1 или 2 другими (VP4, VP7) происходило значительное снижение количества инфицированных клеток, что могло быть связано с межвирусной интерференцией. Снижение дозы рекомбинантных продуктов со вставкой VP4 и VP7 позволило решить эту проблему и добиться необходимого уровня экспрессии генов, кодирующих VP2/VP6 при коинфицировании, сопоставимого с таковым при моноинфекции (рис. 1, г–и).

В результате оптимизированы следующие варианты коинфекции:

1. VP2/VP6;

2. VP2/VP6 + VP4(P4);

3. VP2/VP6 + VP4(P8);

4. VP2/VP6 + VP7(G1);

5. VP2/VP6 + VP7(G2);

6. VP2/VP6 + VP7(G4);

7. VP2/VP6 + VP7(G9);

8. VP2/VP6 + VP4(P8) + VP7(G1).

После очистки центрифугированием полученных сочетаний рекомбинантных продуктов методом ЭМ показано, что во всех исследованных вариантах формируются ВпЧ: из 2 белков VP2/VP6 (рис. 2, a), из 3 – VP2/VP6 + разные генотипы VP4 или VP7 (рис. 2, б–ж) и из всех 4 белков (рис. 2, з). Все частицы по морфологии и размеру соответствовали вириону РВ А (рис. 2, и). Получены как 2-слойные (рис. 2, a), так и 3-слойные ВпЧ (рис 2, б–з).

Белковый состав полученных частиц подтверждали методами ИФА и ЭФ в ПААГ-ДСН с последующим иммуноблоттингом. Блот окрашивали АТ к полигистидиновой метке (детекция VP4, VP6, VP7) и к eGFP (детекция VP2) (рис. 3). Молекулярные массы белков соответствовали приведённым в литературе данным [20]. Генотип белков VP4 и VP7 не оказывал существенного влияния на соотношение разных белковых составляющих в соответствующих вирусоподобных структурах.

Содержание ВпЧ в полученных после очистки субстанциях оценивалось по общей концентрации белка. Поскольку по результатам ЭМ более 90% частиц были собраны правильно и не разрушены, общую концентрацию белка можно принять за концентрацию белка в данных структурах. Количества синтезированных ВпЧ, полученных из 1 л культуральной жидкости (при расчёте на 1 мг белка), представлены в таблице (из 1 л культуральной жидкости получено от 24 до 64 мг частиц).

Количество полученных ВпЧ
Amount of obtained VLP

Обсуждение

Проблема разработки новых вакцинных препаратов против РВИ остаётся актуальной, несмотря на наличие на рынке давно использующихся вакцин RotaTeq® и Rotarix®, преквалифицированных ВОЗ 2 вакцин производства Индии, а также ещё 2 препаратов, зарегистрированных на национальном уровне. Все они являются живыми, и по сравнению с ними потенциальная ВпЧ-вакцина обладает рядом преимуществ. РВ А относится к быстро эволюционирующим вирусам, и использование подобных вакцинных препаратов позволит более гибко и точно адаптироваться к текущей эпидемиологической ситуации, зависящей от региона и сезона. Кроме того, исключается возможность реассортации с вирулентными полевыми штаммами [10]. В настоящей работе получены вирусоподобные структуры, содержащие белки внешнего слоя вириона наиболее представленных на территории России генотипов: G1, G2, G4, G9, P4, P8.

Производство нереплицирующихся ВпЧ – достаточно известная и разработанная технология. На рынке представлены несколько зарегистрированных вакцин на их основе, ещё несколько препаратов находятся на разных стадиях клинических испытаний [21]. Впервые ВпЧ РВ А получены в конце 1980-х гг. [22]. Для этого использовались различные системы экспрессии: бакуловирусная в клетках и личинках насекомых; экспрессия в клетках млекопитающих, растений, дрожжей и бактерий [10]. Показано, что для сборки 1-слойных частиц достаточно только белка VP2 [23]. Совместная экспрессия (коэкспрессия) VP2 и VP6 приводит к сборке 2-слойных частиц, полученных и в настоящем исследовании. Белок VP6 обладает высокой иммуногенностью, благодаря чему 2-слойные структуры могут быть использованы для производства вакцин. Тем не менее для лучшей иммуногенности против конкретных вирусных штаммов ВпЧ должны включать вариабельные белки внешнего слоя VP4 и VP7. 3-слойные частицы могут быть получены как из 3 (VP2/6 + VP4, VP2/6 + VP7), так и из всех 4 белков [8, 10].

В настоящей работе применялась бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых как наиболее изученная и эффективная для производства ротавирусных ВпЧ. Экспрессия в клетках T. ni показала хорошие результаты, сравнимые с таковыми в чаще используемых клеточных культурах Sf9 и H5 [10]. Для сборки «базовых» 2-слойных частиц клетки трансфицировали рекомбинантным бакуловирусом, содержащим оба гена, причём белок VP6, необходимый для сборки в большем количестве [24], клонирован под более сильным полиэдриновым промотором, а белок VP2 – под промотором p10. Белки внешнего слоя клонированы каждый в отдельную бакмиду; помещение VP4 и VP7 в одну конструкцию, подобно тому как было выполнено в некоторых работах [20], не использовали. 3-слойные ВпЧ получены как из 3 белков (коинфекция 2 бакуловирусами), так и из 4 (заражение 3 бакуловирусами). В обеих схемах они обладали правильной морфологией и содержали все необходимые белки. Был выбран вариант с использованием ВпЧ из 3 белков, поскольку в этом случае проще оптимизировать стадию коинфекции и контролировать правильность сборки частиц. При такой технологии вирусоподобные структуры, содержащие белки внешнего слоя 6 различных генотипов, производятся независимо, и очищенные субстанции затем объединяются в финальную композицию в равном соотношении. Смесь 6 различных ВпЧ может быть использована для определения иммуногенности в опыте in vivo, а при положительном его результате – для производства вакцины.

Рассмотренный метод очистки ВпЧ (центрифугирование в растворе сахарозы) часто используется для этой цели; чистоты препарата, полученного этим способом, достаточно для проверки иммуногенности на животных моделях. При необходимости более тщательной очистки данных структур от белков клеток насекомых и других неродственных примесей возможно применение хроматографических методик, разработанных для очистки ВпЧ, в том числе ротавирусных [25]. Основные методы контроля полученных частиц – электронная микроскопия, ИФА, электрофорез в ПААГ-ДСН и иммуноблоттинг – также использованы в большинстве работ [10, 26].

Иммуногенные свойства ротавирусных ВпЧ показаны ранее в ряде исследований при разных способах их введения (внутримышечный, ректальный, назальный, внутрибрюшинный, оральный) как с адъювантами, так и без них. Несмотря на то что ни одна потенциальная ВпЧ-вакцина против РВИ не была тестирована на людях, иммуногенность, эффективность и безопасность этих препаратов продемонстрированы на животных моделях с использованием мышей, кроликов и поросят-гнотобионтов [9, 27–29].

Заключение

В результате выполненной работы получены 7 рекомбинантных бакуловирусов, содержащих оптимизированные для экспрессии в клетках насекомых последовательности генов РВ А VP2, VP6 а также 6 генотипов VP4 и VP7 (G1, G2, G4, G9, P4, P8), наиболее представленных на территории России. Разработана и оптимизирована технология получения 3-слойных ВпЧ, состоящих из 3 белков, в клетках T. ni с последующей очисткой путём центрифугирования в растворе сахарозы. Полученные частицы по размеру и морфологии соответствуют вириону РВ А, по результатам ИФА и иммуноблоттинга содержат все экспрессированные белковые структуры. Комбинация из 6 субстанций ВпЧ, содержащая вариабельные белки внешнего слоя 6 различных генотипов данного вируса, может быть использована для изучения иммуногенности in vivo.

Об авторах

С. А. Черепушкин

ФГБУ Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: cherepushkin1@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1734-5369

Черепушкин Станислав Андреевич - научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики.

123098, Москва

Россия

В. В. Цибезов

ФГБУ Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: tsibezov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2150-5764

Цибезов Валерий Владимирович - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории средств специфической профилактики.

123098, Москва

Россия

А. Г. Южаков

ФГБУ Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: anton_oskol@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0426-9678

Южаков Антон Геннадиевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики.

123098, Москва

Россия

О. Е. Латышев

ФГБУ Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: oleglat80@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1934-9635

Латышев Олег Евгеньевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики.

123098, Москва

Россия

К. П. Алексеев

ФГБУ Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: kalekseev@hotmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9536-3127

Алексеев Константин Петрович - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории прикладной вирусологии и биотехнологии.

123098, Москва Россия

Э. Г. Алтаева

Ветбиохим, ООО

Email: e.altaeva@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7188-1704

Алтаева Эржена Григорьевна - кандидат биологических наук, старший инженер-технолог.

105120, Москва

Россия

К. М. Хаметова

ФГБУ Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: kizkhalum@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8461-600X

Хаметова Кизхалум Маликовна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории средств специфической профилактики.

123098, Москва

Россия

Г. К. Воркунова

ФГБУ Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: chekh-ks@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3130-5029

Южакова Ксения Андреевна - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики.

123098, Москва

Россия

К. А. Южакова

ФГБУ Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: g.k.vorkunova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1346-3744

Воркунова Галина Константиновна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики.

123098, Москва

Россия

Т. В. Гребенникова

ФГБУ Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава России

Email: t_grebennikova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6141-9361

Гребенникова Татьяна Владимировна - доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН, заведующий лабораторией молекулярной диагностики.

123098, Москва

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы