Выявление пестивирусов крупного рогатого скота при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Пестивирусы - причина репродуктивных проблем, болезней желудочно-кишечного и респираторного тракта животных. Для крупного рогатого скота значение имеют три вида: Pestivirus A, B и H. В настоящее время необходимы быстрые и надёжные методы дискриминации данных патогенов.

Цели и задачи исследования: разработка мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для одновременного выявления и дифференциации трёх вирусов в режиме реального времени (РТ-ПЦР).

Материал и методы. Мишенью для амплификации служили нуклеотидные последовательности консервативных участков генов 5´-UTR пестивирусов A, B и H.

Результаты. Реакция показала высокую специфичность, чувствительность, воспроизводимость и выявляла РНК вирусов в концентрации не менее 0,6-1,2 lg ТЦД50/см3. Перекрёстных реакций с другими пестивирусами не наблюдали. РТ-ПЦР подтвердила результаты, полученные ранее в ОТ-ПЦР в режиме гель-электрофореза. При параллельном исследовании 1823 проб биоматериала результаты двух реакций полностью совпали. Pestivirus spр. выявлены в 76 пробах: Pestivirus A присутствовал в 73 пробах, B - в трёх, а H не обнаружен.

Обсуждение. Разработана двухшаговая РТ-ПЦР для одновременного выявления и типирования трёх пестивирусов. Для первой реакции использовали модифицированные панпраймеры S. Vilcek и соавт., а для типирования - праймеры и зонды собственного дизайна, что обеспечило высокую эффективность реакции.

Заключение. На молочных комплексах по содержанию скота создаются условия для циркуляции патогенных вирусов. В такой ситуации необходимы методы экспресс-диагностики, позволяющие в короткие сроки выявить несколько вирусов. Триплексный анализ в режиме реального времени может быть рекомендован в качестве экспресс-метода при массовых эпизоотологических исследованиях, а также для скрининга эмбрио-нальной сыворотки, используемой для культивирования вирусов в медицине и ветеринарии.

Полный текст

Введение

Пестивирусы широко распространены в природе и являются причиной значительного спектра инфекционной патологии, включающей репродуктивные проблемы, болезни желудочно-кишечного и респираторного тракта животных [15].

Согласно современной классификации род Pestivirus принадлежит к семейству Flaviviridae и включает 11 представителей. Для крупного рогатого скота (КРС) основное значение имеют три вида: Pestivirus A, B и H, ранее называвшиеся BVDV-1, -2 и -3 [6].

Все вирусы вызывают сходную патологию у восприимчивых животных и становятся причиной экономически значимых болезней КРС во всём мире, особенно при интенсивном типе ведения животноводства [7][8][9][10][11][12][13][14]. Кроме того, представители данного рода являются контаминантами биологических препаратов (эмбриональной сыворотки, перевиваемых линий культур клеток, вакцин для медицины и ветеринарии, интерферонов, трипсина, биотехнологических препаратов, эмбрионов, стволовых клеток, спермы быков-производителей и др.) [15][16].

Все пестивирусы имеют сходное строение, их геном представлен однонитевой положительно заряженной РНК размером 12,3 тыс. нуклеотидов. Она имеет одну открытую рамку считывания длиной около 4000 кодонов, кодирующую 12 структурных и неструктурных белков (Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2/NS3-NS4A-NS4BNS5A-NS5B), фланкированную с 5´- и 3´-концов нетранслируемыми областями 5´-UTR и 3´-UTR [17].

Из всех регионов генома вирусов для дифференциации (сравнительных изучений) и филогенетического анализа широко используют 5´-UTR, Npro и E2 [17]. В связи с этим в качестве основного метода дифференциации пестивирусов применяют секвенирование отдельных фрагментов с последующим филогенетическим анализом [18][19]. Однако этот метод дорогостоящий и занимает много времени.

Вирус подвержен мутациям, вызванным ошибками РНК-зависимой РНК-полимеразы, и рекомбинациям, приводящим к образованию его различающихся, но близкородственных мутантов (субтипов). В связи с этим патогенность возбудителя варьирует и имеет «штаммовую» зависимость. К настоящему времени известны 21 субтип Pestivirus A, 5 субтипов Pestivirus B и четыре Pestivirus H [20].

Учитывая широкое распространение в последние годы во всём мире нового эмерджентного вида: Pestivirus H (BVDV-3), возникает необходимость быстрого выявления и дифференциации всех представителей рода в одной реакции, что имеет значение для дифференциальной диагностики и разработки противоэпизоотических мероприятий в практических условиях [2][12][18].

Для выявления пестивирусов, как правило, используют молекулярные методы, в частности, различные модификации полимеразной цепной реакции (ПЦР), в большинстве случаев направленные на обнаружение отдельных вирусов [21][22]. Широкое распространение во всём мире получили панпраймеры, предложенные S. Vilcek и соавт. для выявления Pestivirus spp. с последующим филогенетическим анализом ампликонов [21].

Для прямого выявления и дифференциации отдельных представителей рода Pestivirus за рубежом используют мультиплексную ПЦР, в том числе в режиме реального времени (РТ-ПЦР) [23][24][25][26]. Однако эти методы позволяют обнаружить и дифференцировать только два вида (Pestivirus А, В).

N. Decaro и соавт. (2012) разработали способ типирования пестивирусов А, В и Н с помощью «вложенной» двухшаговой ПЦР в формате электрофореза [27]. В дальнейшем авторы разработали высокопроизводительный, чувствительный и специфичный метод мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени, основанный на технологии TaqMan [28]. Предел выявления РНК составил 100–101 копий. Перекрёстных реакций не наблюдали.

Известно о выявлении трёх пестивирусов в сыворотке крови откормочного скота при помощи панпестипраймеров в ОТ-ПЦР в режиме гель-электрофореза [29]. Сообщений о подобных разработках в России мы не нашли. Ранее нами разработаны ОТ-ПЦР в электрофоретическом формате для выявления каждого из трёх вирусов в пробах биологического материала и эмбриональной сыворотки КРС и проведён их филогенетический анализ [30][31][32].

Цель данной работы – разработка мультиплексной ПЦР для одновременного выявления трёх вирусов КРС рода Pestivirus в режиме реального времени в образцах эмбриональной сыворотки КРС и пробах биологического материала, полученного от больных и инфицированных животных.

Материал и методы

Для расчёта олигонуклеотидных праймеров проводили выравнивание известных нуклеотидных последовательностей BVDV-1, -2 и -3, опубликованных в GenBank, с помощью программы ClustalW [33]. Химический синтез праймеров осуществляли амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U. Концентрацию их в маточном растворе определяли спектрометрическим методом.

На начальном этапе проводили анализ нуклеотидных последовательностей 5´-UTR области геномов всех видов рода Pestivirus из базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и определяли наиболее консервативные участки, специфичные для всех видов, а также для каждого вида в отдельности, и подбирали специфичные олигонуклеотидные праймеры и зонды. Свойства олигонуклеотидных праймеров анализировали с использованием программы Vector NTI 9.0.0 (InforMax).

Выделение РНК вирусов проводили стандартным способом с использованием коммерческого набора «РИБО-сорб» производства ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Реакцию ОТ для получения кДНК проводили с использованием коммерческого набора «Реверта-L» того же производителя. Для этого в пробирку, содержащую 9,5 мкл реакционной смеси: буфер для ОТ (50 mM Tris-HCl [pH 8,3], 3 мМ MgCl2, 75 mM KC1, 10 мМ DTT), 0,1 мМ dNTP, 0,1 мкг праймера для ОТ) и 0,5 мкл ревертазы из набора «Реверта-L», добавляли 10 мкл РНК-пробы, осторожно перемешивали и помещали в термостат 37 °С на 30 мин. Затем добавляли 20 мкл ДНК-буфера, тщательно перемешивали и использовали для постановки ПЦР.

Постановка полимеразной цепной реакции для выявления и дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота. Состав реакционной смеси: ПЦР-буфер (60 mM Tris-HCl [pH 8,5], 1,5 мМ MgCl2, 25 mM KC1, 10 мМ 2-меркаптэтанола, 0,1% Тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, по 0,2 мкг каждого праймера, по 0,1 мкг зонда, 1,25 Е Taq-ДНК-полимеразы, 5 мкл кДНК. Температурный режим проведения ПЦР: 95 °С 5 мин – 1 цикл; 95 °С 10 с, 55 °С 15 с, 72 °С 30 с – 45 циклов. Измеряли флуоресценцию при 55 °С на канале FAM. Положительными считали образцы со значением порогового цикла (Ct) ≤ 40.

Реакцию проводили в два раунда. В первом раунде с общими праймерами и зондом (PVsp F, PVsp R, PVsp Z) выявляли все три вируса, во втором раунде проводили три независимые реакции с соответствующими праймерами и зондами для генотипирования каждого из трёх видов пестивирусов.

Определение чувствительности и специфичности ПЦР. Положительные контрольные образцы (ПКО) получали методом молекулярной трансформации компетентных бактериальных клеток Escherichia coli плазмидой pDrive, содержащей специфические ДНК-вставки, и использовали их для контроля амплификации отдельно для каждого анализа. Концентрацию плазмидной ДНК определяли с использованием набора реагентов Quant-iT dsDNA, HS (Invitrogen, США) и флуориметра QUBIT (Invitrogen, США).

Для определения чувствительности реакции готовили 10-кратные разведения (от 10-1 до 10-7) контрольных штаммов Pestivirus A (Oregon C24V, 6,33 lg ТЦД50/см3), Pestivirus B (Blagodatsky, 6,5 lg ТЦД50/см3) и ПКО (Pestivirus A, B и H), каждое разведение исследовали в ПЦР. За аналитическую чувствительность принимали последнее разведение контрольных штаммов и ПКО, с которым результат ПЦР-анализа интерпретировался как положительный.

Специфичность тест-системы определяли с использованием референтных штаммов: Oregon C24V (Pestivirus A), Blagodatsky (Pestivirus B), ЛК (Pestivirus С), РСВ № 3 (Bovine orthopneumovirus), Оренбург (Bovine alphaherpesvirus 1), SD-1 (Bovine rhinovirus 1), BV-10 (Bovine mastadenovirus A), а также проб биоматериала, в которых нами ранее были выявлены и подтверждены секвенированием вирусы Pestivirus A, B и H [30][31][32].

Исследование проб биологического материала. Исследованы образцы коммерческой эмбриональной сыворотки КРС разных производителей, используемые для культивирования культур клеток и производства биопрепаратов в ветеринарии и медицине, а также пробы сыворотки крови, ткани лимфатических узлов, селезёнки, лёгких от животных с подозрением на инфицирование пестивирусами. Пробы сыворотки крови отбирали в объёме не менее 1 мл, из органов и тканей вырезали кусочки размером 1×1×1 см3. Образцы эмбриональной сыворотки и сыворотки крови больных и инфицированных животных использовали для выделения РНК без предварительной подготовки. Пробы органов и тканей перед исследованием гомогенизировали для получения 10% суспензии на физиологическом растворе, центрифугировали при 10·103 об/мин в течение 5 мин. Для выделения РНК использовали 100 мкл осветлённой надосадочной жидкости.

Всего исследовали 9 образцов эмбриональной сыворотки, 49 проб сыворотки крови и внутренних органов КРС разного возраста, давших положительный результат в предварительных исследованиях методом ОТ-ПЦР в формате гель электрофореза [30][31][32].

С целью изучения сравнительной эффективности двух реакций дополнительно исследовали 1823 пробы биоматериала от животных.

Результаты

На первом этапе работ анализировали нуклеотидные последовательности 5´-UTR области геномов всех видов рода Pestivirus из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), определяли наиболее консервативные участки, специфичные для всех видов, а также для каждого вида отдельно, и подбирали специфичные олигонуклеотидные праймеры и зонды. Результаты приведены в табл. 1. Моделирование реакции в программе Vector NTI с последовательностями геномов Pestivirus C (вирус классической чумы свиней) и Pestivirus D (вирус пограничной болезни овец) показало отсутствие реакции с данными вирусами.

Результаты определения аналитической чувствительности с использованием ПКО трёх вирусов представлены в табл. 2.

Полученные данные показали, что минимальное количество выявляемого ПКО составило 7,2·10 ГЭ на реакцию. Аналитическая чувствительность ОТ-ПЦР в режиме реального времени была различной и составила 1,6·102 для Pestivirus spp., 7,2·10 для Pestivirus A, 9,0·10 для Pestivirus B и 1,5·103 для Pestivirus Н. Расчётная эффективность амплификации для различных ПКО была ≈89% при достоверности аппроксимации (R2) от 0,9865 до 0,9931. Стандартные отклонения значений пороговых циклов варьировали от 0,12 до 0,60. Средние коэффициенты вариаций значений пороговых циклов при повторных исследованиях не превышали 1,91%, что свидетельствует о высокой повторяемости результатов определения аналитической чувствительности РТ-ПЦР.

Диагностическая чувствительность была определена исследованием 10-кратных разведений референтных штаммов Pestivirus A и B с известным титром. Все исследования проводили в трёх повторах. Из-за отсутствия штаммов Pestivirus H не удалось провести подобные исследования с ним. Данные по определению чувствительности приведены в табл. 3.

Результаты показали, что минимальный титр штамма Oregon C24V (Pestivirus A), выявляемый в реакции, равен 1,2 lg ТЦД50/см3., а штамма Blagodatsky – 0,6 lg ТЦД50/см3.

В опыте по определению специфичности реакции со штаммами ЛК (Pestivirus С), РСВ № 3 (Bovine orthopneumovirus), Оренбург (Bovine alphaherpesvirus 1), SD-1 (Bovine rhinovirus 1), BV-10 (Bovine mastadenovirus A) получены отрицательные результаты во всех реакциях. Специфичность реакции в отношении вируса пограничной болезни овец не проверяли в связи с отсутствием референтного штамма.

На первом этапе исследовали 49 проб биоматериала, в которых ранее с помощью ПЦР в формате гель-электрофореза и секвенирования были выявлены 9 субтипов Pestivirus A и B, а также 9 образцов эмбриональных сывороток, в 7 из них присутствовал Pestivirus H итальянской группы, а в двух – Pestivirus B. Все пробы дали положительный результат при исследовании в мультиплексной РТ-ПЦР (табл. 4).

Результаты сравнительного исследования 1823 проб биоматериала от животных двумя методами – разработанной нами РТ-ПЦР и ПЦР в варианте электрофореза представлены в табл. 5.

По данным табл. 5, последовательности Pestivirus spр. выявлены в 76 пробах биоматериала, при этом результаты двух ПЦР полностью совпали. Pestivirus A присутствовал в 73 пробах, Pestivirus B – только в трёх, а Pestivirus H и нетипируемые образцы не выявлены.

Для подтверждения специфичности полученных результатов определяли нуклеотидную последовательность ампликонов с использованием набора BigDye 3.1 (Applied Biosystems, США) с последующей очисткой на сефадексе G-50 Superfine. Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили по обеим цепям ДНК. Расшифровку первичных данных секвенирования (хроматограмм) проводили с помощью программы Sequencher 4.0.5 (Gene Codes Corporation, США). Анализировали нуклеотидные последовательности синтезируемых фрагментов методами выравнивания с опубликованными последовательностями штаммов пестивирусов с помощью программы ClustalW, согласно J. Thompson и соавт. [33].

В результате исследований в пробах органов больных животных и сыворотках крови КРС выявили и генотипировали только Pestivirus A и В.

Таким образом, разработанная РТ-ПЦР высокочувствительна, специфична и эффективна при выявлении и дифференциации трёх пестивирусов в образцах эмбриональной сыворотки, в сыворотке крови и пробах органов КРС.

Таблица 1. Последовательности праймеров и зондов, выбранные для выявления и генотипирования пестивирусов
Table 1. Sequences of primers and probes selected for detection and genotyping of Pestiviruses

Таблица 2. Аналитическая чувствительность при исследовании положительных контрольных образцов
Table 2. Analytical sensitivity in the testing of positive control samples

Таблица 3. Диагностическая чувствительность полимеразной цепной реакции в режиме реального времени со штаммами вирусов Pestivirus A и В
Table 3. Diagnostic sensitivity of real time PCR for detection of Pestivirus A and B strains

Таблица 4. Оценка специфичности полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с пробами биоматериала от животных
Table 4. The assessment of specificity of real time PCR based on testing of biological samples from animals


Примечание. * КРС – крупный рогатый скот.

Таблица 5. Диагностическая эффективность двух вариантов полимеразной цепной реакции при исследовании проб биологического материала от животных
Table 5. Diagnostic efficiency of two variants of PCR in the testing of biological samples from animals

Обсуждение

Для быстрого выявления Pestivirus A, B и H в клинических образцах было разработано несколько высокочувствительных методик на основе ПЦР, но только некоторые из них могли одновременно дифференцировать Pestivirus A и B [23][24][25][26][27][28]. Открытие нового Pestivirus H, вызывающего сходные клинические признаки у животных с Pestivirus A и B, вызвало ряд опасений относительно способности существующих методик эффективно обнаруживать его. ОТ-ПЦР с панпестипраймерами 324/326, разработанная S. Vilcek и соавт. [21], обычно используемая для молекулярного скрининга вирусов этого рода, в некоторых случаях была низкоэффективной в отношении Pestivirus H из-за несоответствия на 3’-конце праймера 324, что препятствовало его правильному отжигу [28].

M. Baxi и соавт. (2006) разработали одноступенчатую ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием технологии SmartCycler и TaqMan-зондов. Общие и видоспецифические праймеры были выбраны из последовательностей генома 5´-UTR. Анализ в реальном времени выявлял 10–100 ТЦД50 вируса со значениями коэффициента корреляции (r2) 0,998 и 0,999 для Pestivirus A и В соответственно. Анализ ранее типированных 54 штаммов BVDV и полевых изолятов показал высокую эффективность метода, а специфичность зондов TaqMan дополнительно продемонстрирована отсутствием перекрёстных реакций с вирусом классической чумы свиней и вирусом пограничной болезни овец. Были показаны высокая воспроизводимость методики, а также совпадение с результатами выделения вирусов [25]. Авторы предположили, что одностадийный анализ ОТ-ПЦР в реальном времени – быстрый, чувствительный и специфический тест для выявления и типирования пестивирусов.

В 2008 г. была разработана методика выявления пестивирусов на основе анализа TaqMan, специфичного Pestivirus Н, но не позволяющего провести одновременную дифференциацию Pestivirus A и В, показавшую частичную перекрёстную реакцию со штаммами Pestivirus В с высоким титром. Кроме того, 3 из 15 положительных на Pestivirus В образцов проявили перёкрестные реакции с Pestivirus Н [19].

N. Decaro и соавт. (2012) разработали ПЦР-анализ для одновременного выявления трёх пестивирусов. Этот метод был специфичным и надёжным, но трудоемким, поскольку требовал двух отдельных этапов: ОТ-ПЦР с последующей вложенной амплификацией. Кроме того, он представлял определённый риск перекрёстного загрязнения положительных и отрицательных образцов [27].

Чтобы преодолеть ограничения существующих методов V. Mari и соавт. (2016) разработали РТ-ПЦР на основе технологии TaqMan в режиме реального времени для дифференциации трёх пестивирусов в одной реакции. Реакция была чувствительной и показала воспроизводимые результаты, а предел выявления РНК вирусов составил 100–101 копий РНК. Перекрёстных реакций между вирусами не наблюдали. При исследовании полевых образцов от животных с инфекцией Pestivirus А, В и Н реакция показала приблизительно одинаковую чувствительность и достоверно различала все вирусы. При анализе 159 положительных проб биоматериала от КРС и тестированного ранее в ПЦР Pestivirus А и В были обнаружены в 103 и 15 пробах соответственно. 41 проба материала, полученного от животных из двух разных стад на юге Италии, была положительной на BVDV-3. Чувствительность выявления РНК составила: 4,02·101 – 7,26·107 (Pestivirus А), 5,78·101– 8,45·106 (Pestivirus В) и 3,72 ·101 – 2,75·107 (Pestivirus Н) [28]. По сравнению с ПЦР анализ ОТПЦР в реальном времени был одинаково или чуть более чувствительным и занимал меньше времени.

Мы разработали двухшаговую ОТ-ПЦР для одновременного выявления и типирования трёх пестивирусов в режиме реального времени. Мы модифицировали панпестипраймеры 324/326 S. Vilcek и соавт. [21] для более эффективного выявления всех вирусов, а для типирования видов применили праймеры и зонды собственного дизайна, что обеспечило высокую чувствительность и специфичность реакции. Нами не отмечено перекрёстных реакций между пестивирусами и положительного сигнала с вирусами других нозологических групп. Минимальное количество ПКО составило 7,2·10 ГЭ на реакцию. Аналитическая чувствительность ОТ-ПЦР в режиме реального времени была различной и составила 1,6·102 для Pestivirus spp., 7,2·10 для Pestivirus A, 9,0·10 для Pestivirus B и 1,5·103 для Pestivirus Н. Расчётная эффективность амплификации для разных ПКО была ≈89% при достоверности аппроксимации (R2) от 0,9865 до 0,9931. Стандартные отклонения значений пороговых циклов варьировали от 0,12 до 0,60. Средние коэффициенты вариаций значений пороговых циклов при повторных исследованиях не превышали 1,91%, что свидетельствует о высокой повторяемости результатов определения аналитической чувствительности РТ-ПЦР. Наши результаты не уступают зарубежным аналогам.

Ранее нами была установлена циркуляция на территории Сибири семи субтипов BVDV-1 (1а, 1b, 1c, 1d, 1f, 1i, 1p) и двух субтипов BVDV-2 (2b и 2с). Преобладающим субтипом у животных был BVDV1-b, а в перевиваемых линиях культур клеток чаще выявляли BVDV-1a. Присутствие BVDV-3 итальянской группы установили в семи лотах эмбриональной сыворотки, полученной от двух производителей [30][31][32]. В настоящей работе все пробы биоматериала, давшие положительный результат в гель-электрофорезной реакции, были подтверждены мультиплексной РТ-ПЦР.

Сравнительные испытания двух вариантов реакций показали полное совпадение их результатов. Последовательности Pestivirus spр. выявили в 76 пробах биоматериала. Из них Pestivirus A присутствовал в 73 пробах, Pestivirus B – в 3 пробах, а Pestivirus H и нетипируемые образцы не были выявлены.

Теоретически, ограничением данного исследования является то, что анализируемые штаммы пестивирусов были географически однородными, поскольку выделены только в регионе Сибири. Поэтому теоретически менее распространённые подтипы или дивергентные вирусы, циркулирующие в других регионах страны, могут показать другие результаты. В таких случаях возможно дополнительное проведение филогенетического анализа. Однако результаты выявления BVDV-3 в пробах эмбриональной сыворотки обнадёживают и служат доказательством специфичности разработанного нами метода. Потенциальным ограничением метода может быть вирус пограничной болезни овец, выявленный у КРС [34], однако пробы биоматериала были получены от животных, содержащихся на мегафермах, где их контакт с овцами полностью исключен, и эпизоотическая ситуация не требовала включения данного вируса в протокол реакции. Моделирование реакции в программе Vector NTI с последовательностями геномов вирусов классической чумы свиней и пограничной болезни овец, опубликованных в GenBank, дало отрицательные результаты.

Заключение

На фоне экономических реформ, сопровождающихся интенсификацией молочного и мясного животноводства и ростом количества мегаферм, особую актуальность приобретают вирусные инфекции, характеризующиеся многообразием клинических форм и синдромов. Большое значение они имеют для хозяйств, куда постоянно или периодически вводят новых животных из разных источников и происходит их перемещение внутри хозяйств, что создаёт условия для циркуляции патогенных вирусов среди восприимчивых категорий. В такой ситуации необходимы методы экспресс-диагностики, позволяющие в короткие сроки выявить несколько вирусов, в частности мультиплексные ПЦР в режиме реального времени. Актуально также определение контаминации широкого спектра биологических препаратов пестивирусами.

Мечение видоспецифических зондов флуорофорами позволяет достоверно определить характеристики пестивирусных штаммов, содержащихся в клинических образцах. Кроме того, 96-луночный формат планшетов для ПЦР в реальном времени обеспечивает высокую пропускную способность с возможностью одновременного тестирования нескольких образцов. Разработанный анализ представляет собой закрытую систему, в которой пробирка никогда не открывается после амплификации, и это снижает вероятность перекрёстного загрязнения новых образцов предварительно амплифицированными продуктами.

Мультиплексный анализ TaqMan в режиме реального времени может быть рекомендован для экспресс-диагностики болезней КРС, вызванных пестивирусами, для массовых эпизоотологических исследований с целью выявления персистентно инфицированных животных при реализации программ контроля, а также для скрининга пулов эмбриональной сыворотки, используемой для культивирования вирусов в медицине и ветеринарии.

×

Об авторах

А. В. Нефедченко

ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий РАН (СФНЦА РАН), Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока

Автор, ответственный за переписку.
Email: noemail@neicon.ru
Россия

С. В. Котенева

ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий РАН (СФНЦА РАН), Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока

Email: noemail@neicon.ru
Россия

Т. И. Глотова

ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий РАН (СФНЦА РАН), Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока

Email: noemail@neicon.ru
Россия

Александр Гаврилович Глотов

ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий РАН (СФНЦА РАН), Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока

Email: glotov_vet@mail.ru

Список литературы

  1. Evans C.A., Pinior B., Larska M., Graham D., Schweizer M., Guidarini C., et al. Global knowledge gaps in the prevention and control of bovine viral diarrhoea (BVD) virus. Transbound. Emerg. Dis. 2019; 66(2): 640-52. DOI: https://doi.org/10.1111/tbed.13068
  2. Глотов А.Г., Глотова Т.И., Шуляк А.Ф. Пестивирусы жвачных животных. Вопросы вирусологии. 2016; 61(2): 59-2. DOI: http://doi.org/10.18821/0507-4088-2016-61-2-59-62
  3. Гулюкин М.И., Юров К.П., Глотов А.Г., Донченко Н.А. Стратегия борьбы с вирусной диареей – болезнью слизистых крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах российской федерации. Вопросы вирусологии. 2013; 58(6): 13-8.
  4. Ridpath J.F. Bovine viral diarrhea virus: global status. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 2010; 26(1): 105-21. DOI: http://doi.org/10.1016/j.cvfa.2009.10.007
  5. Bauermann F.V., Ridpath J.F., Weiblen R., Flores E.F. HoBi-like viruses: an emerging group of pestiviruses. J. Vet. Diagn. Invest. 2013; 25(1): 6-15. DOI: http://doi.org/10.1177/1040638712473103
  6. Simmonds P., Becher P., Bukh J., Gould E.A., Meyers G., Monath T., et al. ICTV virus taxonomy profile: Flaviviridae. J. Gen. Virol. 2017; 98(1): 2-3. DOI: http://doi.org/10.1099/jgv.0.000672
  7. Pinior B., Firth C.L., Richter V., Lebl K., Trauffler M., Dzieciol M., et al. A systematic review of financial and economic assessments of bovine viral diarrhea virus (BVDV) prevention and mitigation activities worldwide. Prev. Vet. Med. 2017; 137(Pt. A): 77-92. DOI: http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2016.12.014
  8. Верховская А.Е., Сергеев В.А., Алипер Т.И., Иванов Е.В. Особенности диагностики и профилактики вирусной диареи крупного рогатого скота. Ветеринария. 2009; (8): 3-7.
  9. Глотов А.Г., Глотова Т.И., Петрова О.Г., Нефедченко А.В., Татарчук А.Т., Котенева С.В. и др. Распространение вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота. Ветеринария. 2002; (3): 17-1.
  10. Шилова Е.Н., Ряпосова М.В., Шкуратова И.А., Вялых Е.В. Вирусная диарея – болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота в Уральском регионе. Ветеринария. 2014; (5): 19-21.
  11. Черных О.Ю., Шевченко А.А., Джаилиди Г.А., Мищенко В.А., Мищенко А.В., Шевкопляс В.Н. Проблемы вирусной диареи крупного рогатого скота. Труды Кубанского государственного аграрного университета. 2016; (58): 194-8.
  12. Глотов А.Г., Глотова Т.И. Атипичные пестивирусы крупного рогатого скота. Сельскохозяйственная биология. 2015; 50(4): 399-408. DOI: http://doi.org/10.15389/agrobiology.2015.4.399rus
  13. Evermann J.F., Ridpath J.F. Clinical and epidemiologic observations of bovine viral diarrhea virus in the northwestern United States. Vet. Microbiol. 2002; 89(2-3): 129-39. DOI: http://doi.org/10.1016/s0378-1135(02)00178-5
  14. Bauermann F.V., Ridpath J.F., Weiblen R., Flores E.F. HoBi-like viruses: an emerging group of pestiviruses. J. Vet. Diagn. Invest. 2013; 25(1): 6-15. DOI: http://doi.org/10.1177/1040638712473103
  15. Урываев Л.В., Ионова К.С., Дедова А.В., Дедова Л.В., Селиванова Т.К., Парасюк Н.А. и др. Анализ контаминации клеточных культур пестивирусом BVDV и микоплазмами. Вопросы вирусологии. 2012; 57(5): 15-21.
  16. Giangaspero M. Pestivirus species potential adventitious contaminants of biological products. Trop. Med. Surg. 2013; 1(6). DOI: http://doi.org/10.4172/2329-9088.1000153
  17. Simmonds P., Becher P., Collett M.S., Gould E.A., Heinz F.X., Meyers G. Family Flaviviridae. In: King A.M.Q., Adams M.J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J., eds. Virus Taxonomy: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier Science; 2011: 1003-20.
  18. Bauermann F.V., Flores E.F., Ridpath J.F. Antigenic relationships between Bovine viral diarrhea virus 1 and 2 and HoBi virus: possible impacts on diagnosis and control. J. Vet. Diagn. Invest. 2012; 24(2): 253-61. DOI: http://doi.org/10.1177/1040638711435144
  19. Liu L., Xia H., Wahlberg N., Belák S., Baule C. Phylogeny, classification and evolutionary insights into pestiviruses. Virology. 2009; 385(2): 351-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.virol.2008.12.004
  20. Yesilbag K., Alpay G., Becher P. Variability and global distribution of subgenotypes of bovine viral diarrhea virus. Viruses. 2017; 9(6): E128. DOI: http://doi.org/10.3390/v9060128
  21. Vilcek S., Herring A.J., Herring J.A., Nettleton P.F., Lowings J.P., Paton D.J. Pestiviruses isolated from pigs, cattle and sheep can be allocated into at least three genogroups using polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis. Arch. Virol. 1994; 136(3-4): 309-23. DOI: http://doi.org/10.1007/bf01321060
  22. Nagai M., Hayashi M., Sugita S., Sakoda Y., Mori M., Murakami T., et al. Phylogenetic analysis of bovine viral diarrhea viruses using five different genetic regions. Virus. Res. 2004; 99(2): 103-13. DOI: http://doi.org/10.1016/j.virusres.2003.10.006
  23. Gilbert S.A., Burton K.M., Prins S.E., Deregt D. Typing of bovine viral diarrhea viruses directly from blood of persistently infected cattle by multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 1999; 37(6): 2020-3.
  24. Letellier C., Kerkhofs P. Real-time PCR for simultaneous detection and genotyping of bovine viral diarrhea virus. J. Virol. Methods. 2003; 114(1): 21-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jviromet.2003.08.004
  25. Baxi M., McRae D., Baxi S., Greiser-Wilke I., Vilcek S., Amoako K., et al. A one-step multiplex real-time RT-PCR for detection and typing of bovine viral diarrhea viruses. Vet. Microbiol. 2006; 116(1-3): 37-44. DOI: http://doi.org/10.1016/j.vetmic.2006.03.026
  26. La Rocca S.A., Sandvik T. A short target real-time RT-PCR assay for detection of pestiviruses infecting cattle. J. Virol. Methods. 2009; 161(1): 122-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jviromet.2009.06.005
  27. Decaro N., Sciarretta R., Lucente M.S., Mari V., Amorisco F., Colaianni M.L., et al. A nested PCR approach for unambiguous typing of Pestiviruses infecting cattle. Mol. Cell. Probes. 2012; 26(1): 42-6. DOI: http://doi.org/10.1016/j.mcp.2011.11.003
  28. Mari V., Losurdo M., Lucente M.S., Lorusso E., Elia G., Martella V., et al. Multiplex real-time RT-PCR assay for bovine viral diarrhea virus type 1, type 2 and HoBi-like pestivirus. J. Virol. Methods. 2016; 229: 1-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jviromet.2015.12.003
  29. Monteiro F.L., Cargnelutti J.F., Martins B., Noll J.G., Weiblen R., Flores E.F. Detection of bovine pestiviruses in sera of beef calves by a RT-PCR based on a newly designed set of pan-bovine pestivirus primers. J. Vet. Diagn. Invest. 2019; 31(2): 255-8. DOI: http://doi.org/10.1177/1040638719826299
  30. Глотов А.Г., Котенева С.В., Глотова Т.И., Южаков А.Г., Максютов Р.А., Забережный А.Д. Филогенетический анализ пестивирусов крупного рогатого скота, выявленных в Сибири. Вопросы вирусологии. 2018; 63(4): 185-91. DOI: http://doi.org/10.18821/0507-4088-2018-63-4-185-191
  31. Котенева С.В., Максютов Р.А., Глотова Т.И., Глотов А.Г. Идентификация атипичного пестивируса крупного рогатого скота в биологических образцах. Сельскохозяйственная биология. 2017; 52(6): 1259-64. DOI: http://doi.org/10.15389/agrobiology.2017.6.1259rus
  32. Котенева С.В., Нефедченко А.В., Глотова Т.И., Глотов А.Г. Генетический полиморфизм возбудителя вирусной диареи (болезни слизистых оболочек) крупного рогатого скота на молочных комплексах Сибири. Сельскохозяйственная биология. 2018; 53(6): 1238-46. DOI: http://doi.org/10.15389/agrobiology.2018.6.1238rus

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Нефедченко А.В., Котенева С.В., Глотова Т.И., Глотов А.Г., 2020

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС77-77676 от 29.01.2020.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах