Вспомогательный белок Vpr вируса иммунодефицита человека 1-го типа (Retroviridae: Orthoretrovirinae: Lentivirus: Human immunodeficiency virus-1): особенности генетических вариантов вируса, циркулировавших на территории Московской области в 2019–2020 гг.

Полный текст

Введение

Вспомогательный белок Vpr вируса иммунодефицита человека 1-го типа (Retroviridae: Orthoretrovirinae: Lentivirus: Human immunodeficiency virus-1; ВИЧ-1) является высококонсервативным вирусным белком, состоящим из 96 аминокислотных остатков (а.о.), массой около 14 кДа [1]. В своей структуре белок Vpr содержит три α-спирали, которые образованы участками белковой цепи с 17-го по 33-й а.о., с 38-го по 50-й а.о. и с 55-го по 77-й а.о. (рис. 1). α-Спирали левозакручены и ориентированы друг относительно друга таким образом, чтобы обеспечить взаимодействия между следующими аминокислотными остатками: L20, L23, L26, A30, V31 первой α-спирали, W38, L39, L42, I46 второй α-спирали и V57, L60, I61, L64, L68, F72 третьей α-спирали. Вышеуказанная ориентация дополнительно фиксируется взаимодействиями между T19, L20, W54 с одной стороны и между H33, F34, H71, F72 с другой. Структура белка Vpr характеризуется гибкими N- и C-концевыми областями: с 1-го по 13-й а.о. и с 78-го по 96-й а.о. соответственно [2].

 

Рис. 1. Схематическое изображение первичной структуры белка Vpr.

M – метионин; E – глутаминовая кислота; D – аспарагиновая кислота; T – треонин; L – лейцин; A – аланин; V – валин; H – гистидин; F – фенилаланин; I – изолейцин; Y – тирозин; W – триптофан; R – аргинин; S – серин; Vpr T-Helper/CD4⁺ Epitope region (major) – область белка Vpr, в которой преимущественно были картированы эпитопы, распознающиеся иммунной системой для последующего развития CD4⁺-T-клеточного ответа (https://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/maps/helper/Vpr.html); Vpr CTL/CD8⁺ Epitope region (major) – область белка Vpr, в которой преимущественно были картированы эпитопы, распознающиеся иммунной системой для последующего развития CD8⁺-цитотоксического Т-клеточного ответа (https://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/maps/ctl/Vpr.html).

Fig. 1. Schematic representation of Vpr primary structure.

M – methionine; E – glutamic acid; D – aspartic acid; T – threonine; L – leucine; A – alanine; V – valine; H – histidine; F – phenylalanine; I – isoleucine; Y – tyrosine; W – tryptophan; R – arginine; S – serine; Vpr T-Helper/CD4⁺ Epitope region (major) – Vpr region in which predominantly the epitopes have been mapped that are recognized by the immune system for subsequent development of CD4⁺ T cell response; Vpr CTL/CD8⁺ Epitope region (major) – Vpr region in which predominantly the epitopes have been mapped that are recognized by the immune system for subsequent development of CD8⁺ cytotoxic T cell response (https://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/maps/ctl/Vpr.html).

 

Ген белка Vpr экспрессируется на поздних стадиях жизненного цикла ВИЧ-1 и связывается с вирусным белком-предшественником Pr55^Gag, который играет важную роль в сборке и продукции вирусных частиц. Олигомеризация Vpr имеет решающее значение для распознавания Pr55^Gag, затем Pr55^Gag-Vpr-комплексы накапливаются в плазматической мембране для последующего эффективного включения в вирионы [3–5]. Таким образом, при инфицировании вирусом клетки-хозяина белок Vpr проникает в нее в составе вириона, что позволяет ему активно участвовать уже в ранних стадиях репликации вируса. Белок Vpr обладает многочисленными функциями (рис. 2):

• повышает процессивность и точность обратной транскрипции [6, 7];
• входит в состав прединтеграционного комплекса (вирусная ДНК, интеграза, белок Vpr и т.д.), который обеспечивает доставку вирусной ДНК из цитоплазмы в ядро для последующей интеграции в геном клетки-хозяина [6, 7];
• усиливает транскрипцию провирусной ДНК [6–8];
• вызывает убиквитин/протеасомозависимую деградацию некоторых клеточных белков, останавливая клеточный цикл в фазе G2, что способствует созданию клеточной среды, оптимальной для экспрессии генов ВИЧ-1 [7, 8];
• индуцирует ответ на повреждение ДНК, что, как предполагают, может также приводить к остановке клеточного цикла и повышению продукции цитокинов воспаления [6, 7];
• нарушает работу митохондрий, что запускает ряд процессов, которые также могут приводить к апоптозу [9];
• в макрофагах Vpr противодействует специальному клеточному белку, LAMPT5, который транспортирует вирусный белок Env в лизосому [6, 10].

 

Рис. 2. Активности белка Vpr.

ОТ – обратная транскрипция; Vpr – белок Vpr; Env – белок Env; PIC – прединтеграционный комплекс.

Fig. 2. Activities of Vpr protein.

RT – reverse transcription; Vpr – Vpr protein; Env – Env protein; PIC – pre-integration complex.

 

Vpr высвобождается продуцирующими клетками и проникает в окружающие В-лимфоциты. В B-лимфоцитах белок Vpr влияет на диверсификацию антител и обладает способностью снижать переключение классов иммуноглобулинов [11]. Отдельное внимание уделяют роли Vpr в усилении вирусной инфекции в неделящихся миелоидных клетках, макрофагах и дендритных клетках, которые позволяют формировать и поддерживать вирусный резервуар, эффективно передавая ВИЧ-1 к CD4⁺-T-клеткам во время презентации антигена [6, 12].

Белок Vpr рассматривают как один из факторов, способствующих развитию у пациентов нейрокогнитивных ВИЧ-ассоциированных расстройств (HIV-associated neurocognitive disorders, HAND): Vpr может проникать в клетки нервной ткани, является нейротоксином, который индуцирует апоптоз, активирует вирусную репликацию в латентно инфицированных клетках; в нейронах нарушает регуляцию уровней некоторых микроРНК и соответствующих им генов, что также может вызывать нейронную дисфункцию. Более того, ген vpr продолжает экспрессироваться даже при успешной антиретровирусной терапии (АРТ) [13–15].

На протяжении многих лет изучают вопрос корреляции аминокислотных замен в белке Vpr с изменением его функциональных свойств [16, 17]. Определены естественные аминокислотные замены в белке Vpr ВИЧ-1, ассоциированные со степенью развития HAND у лиц, живущих с ВИЧ (ЛЖВ), которые находятся на АРТ [18]. Сравнение генетического разнообразия белка Vpr вариантов ВИЧ-1 у пациентов с быстрым прогрессированием заболевания и у пациентов с долгосрочным отсутствием признаков прогрессирования заболевания в отсутствие АРТ показало, что аминокислотные замены в белке Vpr могут способствовать изменению кинетики репликации вируса и приводить к наблюдаемым различиям в прогрессировании заболевания [19]. При сравнении C-концевой области белка Vpr у вариантов ВИЧ-1 субтипов В и С были определены субтип-специфичные аминокислотные замены, которые могут оказывать влияние на функциональные свойства белка [20].

Практически сразу после описания белка Vpr стали рассматривать возможности создания агентов, ингибирующих репликацию ВИЧ-1 посредством противодействия этому белку: известно большое количество попыток создания антиретровирусных средств как на основе природных, так и синтетических компонентов [17, 21]. Кроме того, белок Vpr содержит эпитопы, распознаваемые T-клетками (https://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/maps/helper/Vpr.html, https://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/maps/ctl/Vpr.html), и рассматривается в качестве антиген-кандидата для создания анти-ВИЧ-вакцины [22].

Наиболее широко распространенным в России генетическим вариантом ВИЧ-1 на протяжении многих лет остается суб-субтип А6, тогда как в странах Европы, Азии и Америки циркулируют другие варианты вируса [23, 24]. Cо временем сосуществование и взаимодействие ВИЧ-1 суб-субтипа А6 с менее распространенными на территории России генетическими вариантами вируса (субтипом B, циркулирующей рекомбинантной формой CRF02_AG и т.д.) привели к формированию и распространению других рекомбинантов. Недавно проведенные исследования демонстрируют постепенное увеличение с течением времени доли рекомбинантных форм в генетической структуре ВИЧ-1, циркулирующих на территории Российской Федерации, – в частности, за счет CRF63_02A6 [25]. Также в период 2022–2023 гг. на территории России были выявлены две новые формы: CRF133_A6B и CRF157_A6C [26, 27]. Таким образом, несмотря на постепенное изменение состава циркулирующих вариантов ВИЧ-1 в России, молекулярно-эпидемиологический профиль ВИЧ-инфекции по-прежнему сохраняет свою уникальность.

Целью данной работы является изучение особенностей белка Vpr генетических вариантов ВИЧ-1, циркулировавших на территории Московской области в 2019–2020 гг.

Материалы и методы

При выполнении работы были проанализированы клинические образцы цельной крови «наивных» (ранее не получавших лечения) пациентов с ВИЧ-инфекцией ГКУЗ МО «Центр профилактики и борьбы со СПИД» (231 образец). В период 2019–2020 гг. у каждого пациента был проведен однократный забор крови в рамках реализации проекта CARE (https://www.careresearch.eu/, доступ на 01.11.2024). Весь клинический материал был собран и использован в настоящем исследовании с информированного согласия пациентов и на основании одобрения Комитета по биомедицинской этике ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (протокол № 16 от 08.02.2019). Параллельно была зарегистрирована и в дальнейшем проанализирована следующая информация о пациентах: пол, возраст, фактор риска инфицирования, дата забора клинического образца, стадия заболевания, показатели вирусной нагрузки (ВН) и иммунный статус пациента (количество CD4⁺-клеток). В табл. 1 приведены основные характеристики пациентов, включенных в исследование, в зависимости от стадии ВИЧ-инфекции, согласно клиническим рекомендациям Минздрава России¹.

 

Таблица 1. Основные характеристики включенных в исследование ЛЖВ, классифицированных по стадии ВИЧ-инфекции

Table 1. Main characteristics of people living with HIV (PLWH) included in the study, classified by stage of HIV infection

Характеристики Characteristics	2-я стадия/стадия начальных проявлений Stage 2/stage of initial symptoms	3-я стадия/ субклиническая стадия Stage 3/subclinical stage	4-я стадия/стадия вторичных проявлений Stage 4/stage of secondary symptoms
Всего пациентов, абс. Total number of patients, abs.	48	82	101
Демографические показатели | Demographics
Мужчины, абс. Males, abs.	30	45	71
Женщины, абс. Females, abs.	18	37	30
Возраст, медиана лет, диапазон Age, median age, range	38 [19; 62]	38 [21; 70]	39 [24; 64]
Путь инфицирования, абс. | Infection route, abs.
Гетеро Hetero	24	59	62
ПИН IDU	6	11	36
МСМ MSM	17	9	3
Неизвестно Unknown	1	3	0
Лабораторные показатели | Laboratory parameters
CD4, кл/мкл | clones/μL	599,50 (108–2022)	474,10 (110–1658)	229,72 (8–1062)
Вирусная нагрузка lg РНК, копий/мл Viral load log10 RNA, copies/mL	5,0 (3,4–7,0)	4,6 (3,3–6,2)	5,1 (3,1–6,4)

Примечание. ПИН – потребители инъекционных наркотиков; МСМ – мужчины, практикующие секс с мужчинами.

Note. IDU – Injecting drug users; MSM – Men having sex with other men.

 

Выделение провирусной ДНК в составе геномной ДНК осуществляли методом высаливания [28]. Получение продуктов области генома, кодирующей ген vpr, проводили методом гнездовой двухраундовой полимеразной цепной реакции (ПЦР): внешние праймеры – Vif1р (GCAGGTAAGAGAGCAAGCTGAACA) и Vif1о (GTCTCCGCTTCTTCCTGCCATAGGA), внутренние праймеры – Vif2р (GCTaCTCTGGAAAGGTGAAGG) и Vif2о (TACAAGGAGTCTTGGGCTGAC). Полученные ПЦР-продукты были очищены с использованием коммерческого набора для очистки ПЦР-фрагментов – Clean S-Cap («Евроген», Россия), а затем секвенированы дидезокси-методом по Сэнгеру с использованием коммерческого набора BigDye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) и праймеров Vif2р и Vif2о. Сборку и редактирование нуклеотидных последовательностей (н.п.) гена vpr на основе полученных электрофореграмм выполняли с использованием приложения SeqMan II 6.1. (DNASTAR Inc., США).

Предварительное определение генетических вариантов полученных нуклеотидных последовательностей гена vpr ВИЧ-1 осуществляли с применением трех специализированных программ: COMET HIV-1 (https://comet.lih.lu/) [29], REGA HIV-1 Subtyping Tool (Version 3.46) (https://www.genomedetective.com/app/typingtool/hiv) и jpHMM [30]. Затем для уточнения результатов предварительного субтипирования проводили филогенетический анализ методом максимального правдоподобия с использованием программы IQ-TREE [31]. Эталонные последовательности для проведения анализа были выгружены из международной базы данных Лос-Аламосской лаборатории, США (https://www.hiv.lanl, дата обращения 31.10.2024). Попарное и множественное выравнивание исследуемых и эталонных нуклеотидных последовательностей осуществляли с применением модуля ClustalW, интегрированного в программный пакет AliView [32]. Модель замещения нуклеотидов была выбрана при помощи программы jModelTest v. 2.1.7 на основании информационного критерия Акаике (Akaike information criterion, AIC) [33]. Достоверность выведенных филогений оценивали с помощью бутстрэп-теста (bootstrap) и критерия приблизительного отношения правдоподобия Шимодайры–Хасегавы (SH-aLRT) с 1000 послестартовых итераций. Кластеры с поддержкой SH-aLRT > 0,9 считались достоверно установленными. Визуализацию и графическую обработку результатов филогенетического анализа осуществляли в программе iTOL (https://itol.embl.de) [34].

На следующем этапе исследования формировали и анализировали консенсусные последовательности белка Vpr для наиболее распространенных генетических вариантов ВИЧ-1 по результатам исследования. Для этого полученные нуклеотидные последовательности гена vpr были разделены на группы в зависимости от их генетического варианта. Затем нуклеотидные последовательности гена vpr ВИЧ-1 были переведены в аминокислотные с помощью онлайн-инструмента для трансляции, представленного на сайте (https://www.bioinformatics.org/sms2/translate.html). Также для каждого анализируемого генетического варианта ВИЧ-1 на основе полученных аминокислотных последовательностей с помощью инструмента Simple Consensus Maker (https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/SimpCon.html) были сформированы общие консенсусные аминокислотные последовательности и сравнены между собой и относительно Vpr_model (последовательность белка Vpr субтипа B, анализируемого при определении его пространственной структуры [2]) с применением программы MEGA v. 10.2.2. При формировании консенсусной последовательности инсерции не учитывались; частота встречаемости, при которой аминокислота (а также стоп-кодон или делеция) в каждой позиции учитывалась в консенсусе, должна была быть больше 50%. При помощи программы IsUnstruct предсказывали расположение неструктурированных участков в консенсусных последовательностях и в Vpr_model [35]. При помощи программы AlphaFold 2 (AlphaFold Protein Structure Database) предсказывали пространственную структуру консенсусных последовательностей и Vpr_model [36].

В программе Chimera предсказанные гексамерные структуры анализируемых последовательностей накладывали друг на друга и на Vpr_model, чтобы определить максимально похожие друг с другом структуры (https://www.rbvi.ucsf.edu/chimera/).

На завершающем этапе исследования изучали вариабельность белка Vpr-A6 (белок Vpr вариантов ВИЧ-1 суб-субтипа А6) у пациентов с разными стадиями заболевания. Для этого полученные аминокислотные последовательности Vpr-A6 были сгруппированы в соответствии со стадией ВИЧ-инфекции пациента, от которого был получен образец. Ранее полученную консенсусную последовательность Vpr-A6 использовали в качестве референсной, относительно нее определяли аминокислотные замены в каждой группе пациентов, с применением программы MEGA v. 10.2.2. (www.megasoftware.net). С применением программного модуля Nonparametric Statistics из пакета Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США) выявляли сайты со статистически достоверными различиями в частоте встречаемости у пациентов с разными стадиями заболевания (p < 0,0012 при использовании критерия χ² с поправкой Бонферрони).

Результаты

При проведении попарного и множественного выравнивания и оценке качества 5 из 231 н.п. были исключены из дальнейшего анализа в связи с низким качеством или длиной нуклеотидных последовательностей (количество вырожденных букв или gap-ов (пробелов) более 1% от общей длины последовательности). В дальнейший анализ были включены 226 н.п., кодирующих ген vpr ВИЧ-1. Все полученные в ходе настоящего исследования нуклеотидные последовательности гена vpr ВИЧ-1 (226) были депонированы в международную базу данных генотипов GenBank со следующими номерами: PV059601–PV059826.

По результатам предварительного субтипирования было установлено, что два образца (0,88%, 2/226), полученные от пациентов со 2-й (1311101072) и с 3-й (1311001115) стадиями заболевания, относились к уникальным рекомбинантам (URFs) ВИЧ-1, образованным фрагментами ВИЧ-1 генетических вариантов B и G. Структуры геномов выявленных URFs_B/G представлены на рис. 3.

 

Рис. 3. Карта генома с исследуемой областью vpr у образцов 1311001072 (а) и 1311001115 (б).

Fig. 3. Genome map with the studied vpr region in samples 1311001072 (а) и 1311001115 (b).

 

Данные последовательности были исключены из дальнейшего филогенетического анализа.

По результатам филогенетического анализа 4 (1,77%) н.п. образовали достоверный кластер (SH-aLRT > 0,9) c последовательностями ВИЧ-1 субтипа G, 16 (7,08%) н.п. образовали достоверный кластер (SH-aLRT > 0,9) c последовательностями ВИЧ-1 субтипа B и 11 (4,87%) н.п. были включены в кластер, образованный совместно нуклеотидными последовательностями ВИЧ-1 циркулирующих рекомбинантных форм CRF02_AG и CRF63_02A6 (рис. 4).

 

Рис. 4. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена vpr ВИЧ-1 (n = 254, модель замещения нуклеотидов – TIM1 + I + G4).

Референсные последовательности выделены красным цветом, исследуемые – черным. Красной звездочкой отмечены нуклеотидные последовательности, отнесенные к потенциальным уникальным рекомбинантам.

Fig. 4. Phylogenetic analysis of nucleotide sequences of the HIV-1 vpr gene (n = 254, nucleotide substitution model – TIM1 + I + G4).

Nucleotide sequences classified as potential unique recombinants are marked with a red asterisk.

 

Поскольку в исследуемой области генома (vpr) ВИЧ-1 генетические варианты CRF02_AG и CRF63_02A6 обладают максимальным сходством, было принято решение идентифицировать их на основании совместных результатов филогенетического анализа и программы COMET HIV-1 – 10 последовательностей были отнесены к CRF63_02A6. По результатам филогенетического анализа (из-за положения на филогенетическом дереве – опосредованно от остальных) совместно с результатами программы jpHMM (для определения рекомбинантных формы вируса) было принято решение о том, что последовательность 1311001105 (на рисунке отмечена красной звездочкой) может являться потенциальным уникальным рекомбинантом (URF_CRF02/CRF63), структура его генома представлена на рис. 5.

 

Рис. 5. Карта генома с исследуемой областью vpr у образца 1311001105.

Пунктиром отмечена область, образованная фрагментом ВИЧ-1 рекомбинантных форм CRF02_AG и CRF63_02A6.

Fig. 5. Genome map for the studied vpr region in sample 1311001105.

The dotted line indicates the region formed by the HIV-1 fragment of recombinant forms CRF02_AG and CRF63_02A6.

 

Последовательность 1311000563 на основе совместных результатов филогенетического анализа и анализа в программе COMET HIV-1 была отнесена к URF_A6/B. Остальные 192 (84,96%) н.п. образовали достоверный кластер с нуклеотидными последовательностями ВИЧ-1 суб-субтипа A6.

Консенсусные последовательности белка Vpr были сформированы для вариантов ВИЧ-1 суб-субтипа А6, субтипа В и рекомбинантной формы CRF63_02A6, выявленных в ходе исследования. Консенсусная аминокислотная последовательность Vpr-А6 была сформирована на основе 192 исследуемых последовательностей, субтипа В – 16, а CRF63_02A6 – 10 соответственно. Данные генетические варианты также являются наиболее распространенными на территории Российской Федерации [24].

В исследуемых аминокислотных последовательностях Vpr-A6 были выявлены инсерции (аминокислотные вставки), делеции (пропуски аминокислот) и стоп-кодоны. Инсерции и делеции наблюдались в аминокислотных последовательностях, полученных от пациентов со всеми стадиями заболевания (табл. 2), тогда как стоп-кодоны – у 6 пациентов с 3-й и 4-й стадиями заболевания.

 

Таблица 2. Выявленные инсерции и делеции в исследуемых аминокислотных последовательностях Vpr-A6

Table 2. Identified insertions and deletions in the studied amino acid sequences Vpr-A6

Стадия заболевания Infection stage	Инсерции | Insertions		Делеции | Deletions
	наименование последовательности sequence name	положение position	наименование последовательности sequence name	положение position
2-я стадия Stage 2	1311000412	ins84V85	1311000645	85
	1311000512	ins84I85	1311000738	85, 86
			1311000948	85
3-я стадия Stage 3	1311000660	ins84I85	1311000121	85, 86
			1311000278	84
	1311000997	ins84I85	1311000601	84
			1311000613	85, 86
			1311000617	85, 86
	1311001126	ins84I85	1311000780	85, 86
			1311001119	85
			1311001125	85, 86
4-я стадия Stage 4	1311000884	ins84P85	1311000382	87, 88
			1311000599	85, 86
			1311000766	85
			1311000767	85
			1311000919	85
			1311001068	85, 89
			1311001088	85, 86
			1311001089	85
			1311001093	85

 

Все сформированные консенсусные последовательности содержали 96 а.о. (рис. 6).

 

Рис. 6. Консенсусные последовательности Vpr ВИЧ-1 суб-субтипа А6, субтипа В и рекомбинантной формы CRF63_02A6, выравненные относительно Vpr_model (последовательность белка Vpr, анализируемого при определении пространственной структуры [2]).

Точками обозначены позиции аминокислотных остатков (а.о.), в которых а.о. в консенсусах соответствовали референсу. Аминокислоты классифицированы на основе полярности радикалов. Неполярные аминокислоты: G (глицин), A (аланин), V (валин), L (лейцин), I (изолейцин), P (пролин) отмечены синим цветом; полярные незаряженные аминокислоты: S (серин), T (треонин), C (цистеин), M (метионин), N (аспарагин), Q (глутамин) – зеленым; ароматические аминокислоты: F (фенилаланин), тирозин (Y), W (триптофан), гистидин (H) – желтым; отрицательно заряженные аминокислоты: аспарагиновая кислота (D) и глутаминовая кислота (E) – оранжевым; положительно заряженные аминокислоты: лизин (K), аргинин (R) – красным [37, 38].

Fig. 6. Consensus sequences of Vpr HIV-1 sub-subtype A6, B and CRF63_02A6 genetic variants aligned with the Vpr_model (sequence of the Vpr protein analyzed in determining the spatial structure [2]).

The dots indicate amino acid residues (aa) positions in which the aa in the consensus were the same as in the reference. Non-polar amino acids: G (glycine), A (alanine), V (valine), L (leucine), I (isoleucine), P (proline) – are marked in blue; Polar uncharged amino acids: S (serine), T (threonine), C (cysteine), M (methionine), N (asparagine), Q (glutamine) – green; aromatic amino acids: F (phenylalanine), Tyrosine (Y), W (tryptophan), Histidine (H) – yellow; Polar acidic, negatively charged, amino acids: aspartic acid (D) and glutamic acid (E) – orange; Polar basic, positively charged amino acids: lysine (K), arginine (R) – in red [37, 38].

 

Первичная структура консенсусных последовательностей суб-субтипа А6, субтипа В и CRF63_02A6 отличалась от Vpr_model в 17, 11 и 15-й позициях соответственно (рис. 6).

В дальнейшем для сравнения пространственных структур при проведении анализа консенсусной последовательности субтипа В анализировали вариант последовательности содержащей в 77-м положении Q, в 84-м – I, при проведении анализа консенсусной последовательности CRF63_02A6 – вариант последовательности, содержащей в 58-м положении R.

На рис. 7 представлены предсказанные профили для неструктурированных участков для Vpr_model, консенсусных последовательностях суб-субтипа А6, субтипа В и CRF63_02A6.

 

Рис. 7. Сравнение профилей неструктурированных участков для консенсусных последовательностей суб-субтипа А6, субтипа В и CRF63_02A6 и Vpr_model, предсказанные программой IsUnstruct.

a – Vpr_model: развернутые участки с 1–15 и с 86–96 а.о.; б – консенсус суб-субтипа А6: развернутые участки с 1–15 и с 84–96 а.о.; в – консенсус субтипа В: развернутые участки с 1–16 и с 86–96 а.о.; г – консенсус CRF63_02A6: развернутые участки с 1–15 и с 86–96 а.о.

Fig. 7. The comparison of the tertiary structure of the consensus sequences of sub-subtype A6, subtype B and CRF63_02A6 and Vpr_model, predicted by the IsUnstruct program.

a – Vpr_model: unfolded regions from 1 to 15 and from 86 to 96 aa; b – sub-subtype A6 consensus: unfolded regions from 1 to 15 and from 84 to 96 aa; c – subtype B consensus: unfolded regions from 1 to 16 and from 86 to 96 aa; d – CRF63_02A6 consensus: unfolded regions from 1 to 15 and from 86 to 96 aa.

 

На рис. 8 представлены результаты предсказания пространственной структуры мономерных, димерных, тетрамерных и гексамерных структур, анализируемых последовательностей белка Vpr.

 

Рис. 8. Мономерные, димерные и олигомерные формы белка Vpr вариантов Vpr_model, суб-субтипа А6, субтипа В, рекомбинантной формы CRF63_02A6, предсказанные программой AlphaFold 2.

a – мономерные формы белка Vpr; б – димерные формы белка Vpr; в – тетрамерная форма белка Vpr; г – гексамерная форма белка Vpr.

Fig. 8. Monomeric, dimeric and oligomeric forms of Vpr protein in Vpr_model, sub-subtype A6, subtype B and CRF63_02A6 variants predicted by the AlphaFold 2 program.

a – monomeric forms of Vpr protein; b – dimeric forms of Vpr protein; c – tetrameric forms of Vpr protein; d – hexameric forms of Vpr protein.

 

Результаты пространственного выравнивания (сопоставления) предсказанных гексамерных структур представлены на рис. 9.

 

Рис. 9. Совмещение гексамерных структур Vpr.

Hexamer A6 and Hexamer Vpr_model – гексамер консенсусной последовательности белка суб-субтипа А6 и гексамер Vpr_model; Hexamer B and Hexamer Vpr_model – гексамер консенсусной последовательности белка субтипа B и гексамер Vpr_model; Hexamer CRF63_02A6 and Hexamer Vpr_model – гексамер консенсусной последовательности рекомбинантной формы CRF63_02A6 и гексамер Vpr_model; Hexamer A6 and Hexamer B – гексамер консенсусной последовательности суб-субтипа А6 и гексамер консенсусной последовательности субтипа B; Hexamer A6 and Hexamer CRF63_02A6 – гексамер консенсусной последовательности суб-субтипа А6 и гексамер консенсусной последовательности CRF63_02A6; Hexamer B and Hexamer CRF63_02A6 – гексамер консенсусной последовательности субтипа B и гексамер консенсусной последовательности CRF63_02A6; Среднеквадратичное отклонение между Cα-атомами для разных пар гексамеров показано на рисунке, которое изменяется от 16,9 Å до 37,8 Å.

Fig. 9. Alignment of Vpr hexameric structures.

Hexamer A6 and Hexamer Vpr_model – hexamer of A6 consensus sequence and hexamer Vpr_model; Hexamer B and Hexamer Vpr_model – hexamer of subtype B consensus sequence and hexamer Vpr_model; Hexamer CRF63_02A6 and Hexamer Vpr_model – hexamer of CRF63_02A6 consensus sequence and hexamer Vpr_model; Hexamer A6 and Hexamer B – hexamer of A6 consensus sequence and hexamer of subtype B consensus sequence; Hexamer A6 and Hexamer CRF63_02A6 – hexamer of A6 consensus sequence and hexamer of CRF63_02A6 consensus sequence; Hexamer B and Hexamer CRF63_02A6 – hexamer of subtype B consensus sequence and hexamer of CRF63_02A6 consensus sequence; The root mean square deviation between Cα atoms for different pairs of hexamers is shown in the figure, which varies from 16.9 Å to 37.8 Å.

 

При оценке вариабельности Vpr-А6 у пациентов с разными стадиями ВИЧ-инфекции было выявлено 14 замен, имеющих статистически значимые различия (p < 0,05) в частоте их встречаемости (табл. 3).

 

Таблица 3. Аминокислотные замены Vpr-A6 со статистически значимыми различиями по частоте встречаемости в группах ЛЖВ с разными стадиями заболевания

Table 3. Vpr-A6 amino acid substitutions with statistically significant differences in frequency of occurrence in groups of PLWH with different stages of the disease

Позиция Position	Мутация Mutation	Стадия 2 Stage 2	Стадия 3 Stage 3	Стадия 4 Stage 4	p2‒3	p2‒4	p3–4
13	E13A	2	0	0	0,0465	0,0190	–
15	Y15H	6	8	23	–	–	0,0444
15	Y15F	1	5	1	–	–	0,0353
19	M19V	3	0	2	0,0143	–	–
20	L20I	0	3	0	–	–	0,0390
45	H45Q	6	6	3	–	0,0054	–
55	E55V	2	0	0	0,0465	0,0190	–
61	I61T	6	2	8	0,0107	–	–
72	F72Y	2	0	0	0,0465	0,0190	–
77	Q77H	5	4	4	–	0,0451	–
85	Q85H	1	0	7	–	–	0,0219
87	R87S	5	3	3	–	0,0194	–
93	S93T	0	3	0	–	–	0,0390
94	S94N	1	3	0	–	–	0,0390

Примечание. Значения p-value представлены для позиций с p < 0,05; позиции с p ≥ 0,05 отмечены знаком «–». Достоверно значимыми считали различия с p-value с поправкой Бонферрони (p < 0,0012).

Note. The p-values are presented for items with p < 0.05; items with p ≥ 0.05 are marked with ‘–’. Differences with p-value with Bonferroni correction (p < 0.0012)

 

C учетом поправки Бонферрони (p < 0,0012) не было выявлено ни одного сайта со статистически значимыми различиями в частоте встречаемости у пациентов с разными стадиями заболевания.

Обсуждение

В настоящее время во всем мире продолжается рост генетического разнообразия ВИЧ-1, которое является одним из препятствий для разработки эффективных средств профилактики и терапии ВИЧ-инфекции [39]. Более того, результаты исследований позволяют предположить, что разные генетические варианты ВИЧ-1 способны обуславливать различные клинические проявления и скорость прогрессирования заболевания, а также оказывать влияние на эффективность лечения [40]. Регулярно проводятся работы, посвященные изучению степени влияния отдельных вирусных белков на течение ВИЧ-инфекции [14, 41–43]. Также изучают аминокислотные замены в вирусных белках, которые могут оказывать влияние на прогрессирование ВИЧ-инфекции, отдельное внимание уделяется характерным субтип-специфичным аминокислотным заменам [18, 44, 45]. В ранее проведенных исследованиях генетического разнообразия белка Vpr наиболее широко распространенного в России суб-субтипа А6 отмечали его низкий уровень изменчивости и, в связи с этим, определяли белок Vpr как перспективную мишень для разработки средств терапии [46]. Также для белка Vpr суб-субтипа А6 вариантов вируса, циркулирующих в разных регионах России, предварительно не было отмечено наличия характерных особенностей [47]. Настоящее исследование направлено на изучение особенностей белка Vpr наиболее широко распространенных в России генетических вариантов ВИЧ-1 на примере вариантов вирусов, циркулировавших в Московской области в 2019–2020 гг., и сравнение генетической вариабельности белка Vpr-A6 у пациентов с разными стадиями заболевания.

По результатам исследования было установлено, что большинство (84,96%) нуклеотидных последовательностей vpr относились к ВИЧ-1 суб-субтипа А6, вторым по распространенности стал субтип B (7,08%), затем – рекомбинантная форма CRF63_02A6 (4,87%), что согласуется с результатами исследования генетического разнообразия ВИЧ-1 на территории Российской Федерации [24]. Две последовательности были идентифицированы как уникальные B/G-рекомбинантные формы, что также согласуется с ранее представленными данными о выявлении в России уникальных B/G-рекомбинантных форм [48]. Одна последовательность гена vpr была определена как уникальная A6/B-рекомбинантная форма, что подкрепляется данными о формировании различных рекомбинантных форм между ВИЧ-1 суб-субтипа А6 и субтипа В на территории России [49].

Шесть из 192 (3,13%) последовательностей Vpr-A6, полученные от пациентов с разными стадиями ВИЧ-инфекции, содержали инсерцию между 84-м и 85-м положениями аминокислотных остатков. Двадцать из 192 (10,42%) последовательностей Vpr-A6, полученные от пациентов с разными стадиями заболевания, содержали делеции в 84–89-м положениях, при этом 50% данных последовательностей содержали сразу две делеции. Наиболее часто делеции встречались в 85-м (85%, 17/20) и в 86-м (40%, 8/20) положениях (табл. 2). Ранее уже отмечалось наличие делеций в 85, 86 и 89-й позициях в белке Vpr вариантов суб-субтипа А6 [46]. Преждевременные стоп-кодоны были выявлены у 6 пациентов с 3-й и 4-й стадиями заболевания. Известны исследования закономерностей и частоты встречаемости стоп-кодонов в участках провирусной ДНК, кодирующих протеазу, обратную транскриптазу и интегразу [50, 51]. Однако аналогичных работ по изучению распространенности стоп-кодонов в провирусной ДНК, кодирующей белок Vpr, пока не проводилось. В целом в настоящее время существует предположение, что дефектные провирусы могут обладать биологической активностью: образующиеся на их основе транскрипты и соответствующие им белки могут участвовать в стимуляции иммунного ответа, последующей хронической активации иммунной системы и быть серьезным препятствием для разработки средств эрадикации ВИЧ [52].

Консенсусные последовательности анализируемых вариантов ВИЧ-1 в нескольких позициях, предположительно участвующих в формировании пространственной структуры белка, содержали замены относительно референсной последовательности – Vpr_model: замену D17E – суб-субтип А6, субтип В, CRF63_02A6; T19M – суб-субтип А6, T55E – суб-субтип А6, CRF63_02A6; T55A – субтип В; L60I – суб-субтип А6, субтип В, CRF63_02A6 и R77Q – суб-субтип А6, субтип В, CRF63_02A6. При этом замены T55E, T55A и R77Q приводили к изменению химических свойств аминокислотного остатка в заданном положении.

Предсказание пространственных структур консенсусных последовательностей и референсной последовательности Vpr_model определило, что в анализируемых последовательностях структурированные участки белка преимущественно приходились на область с 16-го по 85-й а.о., что совпадало с областью, в которой картировались эпитопы в белке Vpr (рис. 1, 7).

Предсказание олигомерных структур белка Vpr консенсусных последовательностей и Vpr_model продемонстрировало различия среди тетрамерных и гексамерных форм. При пространственном выравнивании гексамерных форм было определено, что наибольшее среднеквадратичное отклонение между Сα-атомами (RMSD) составило 37,8 Å для пары гексамера консенсусной последовательности субтипа B и гексамера консенсусной последовательности CRF63_02A6, а наименьшее – 16,9 Å для пары гексамера консенсусной последовательности рекомбинантной формы CRF63_02A6 и гексамера Vpr_model (рис. 9). RMSD является количественной мерой сходства между двумя белковыми структурами, и наименьшее значение RMSD между олигомерными формами указывает на их структурное сходство.

Таким образом, имеющиеся особенности белка Vpr у различных вариантов ВИЧ-1 могут повлиять на формирование олигомерных форм белка. Учитывая высокую значимость процесса олигомеризации, который влияет на включение белка Vpr в вирионы и, как следствие, определяет возможность участия белка Vpr в ранних стадиях репликации вируса, можно утверждать, что существующие особенности могут повлиять на функциональные свойства белка Vpr [4].

В ранее выполненном исследовании динамики вариабельности гена vpr у пациентов, инфицированных ВИЧ-1 субтипа С, отмечалось постепенное увеличение генетического разнообразия vpr в популяции вируса у пациента в течение первого года развития заболевания [53]. Однако сравнение белка Vpr у вариантов вируса, выделенных от пациентов с разными стадиями заболевания в Китае, не выявило существенных различий аминокислот в функционально значимых областях [54]. В данном исследовании также не было обнаружено аминокислотных замен в белке Vpr-A6, имеющих статистически значимые различия в частоте встречаемости у пациентов с разными стадиями заболевания, что подтверждает ранее сделанные выводы о низкой вариабельности белка Vpr-A6 и перспективности его использования для создания средств терапии ВИЧ-инфекции [46, 47].

Ограничениями проведенного исследования является относительно небольшая выборка, в том числе не-A6-вариантов, а также изучение вариантов вируса, циркулирующих в пределах одного региона – Московской области.

Заключение

Впервые проведено сравнение особенностей белков Vpr генетических вариантов ВИЧ-1, наиболее широко распространенных на территории Российской Федерации (A6, B, CRF63). Было установлено, что присутствующие особенности могут повлиять на формирование олигомерных форм белка. Принимая во внимание важность процесса олигомеризации белка Vpr, можно предположить, что имеющиеся различия могут приводить к разной функциональной активности белка Vpr у вариантов ВИЧ-1. Вместе с тем сравнение генетического разнообразия Vpr-A6 у пациентов с разными стадиями ВИЧ-инфекции не выявило достоверно значимых аминокислотных замен, что подтверждает данные о низкой вариабельности белка Vpr внутри вариантов ВИЧ-1 суб-субтипа А6 и о возможности его использования для разработки средств терапии ВИЧ-инфекции.

 

¹ Минздрав РФ. Клинические рекомендации. ВИЧ-инфекция у взрослых; 2024. Available at: https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/79_2

Об авторах

Анна Игоревна Кузнецова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: a-myznikova@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-5299-3081

канд. биол. наук, заведующая лабораторией вирусов лейкозов, ведущий научный сотрудник Института вирусологии им. Д.И. Ивановского

Россия, 123098, г. Москва

Анастасия Александровна Антонова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: aantonova1792@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9180-9846

канд. биол. наук, научный сотрудник лаборатории вирусов лейкозов, Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского

Россия, 123098, г. Москва

Екатерина Александровна Макеева

ФГАОУ ВО «Московский политехнический университет»

Email: makeevakaty13@gmail.com
ORCID iD: 0009-0005-7085-3361

студентка факультета химической технологии и биотехнологии

Россия, 107023, г. Москва

Кристина Вячеславовна Ким

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: kimsya99@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4150-2280

младший научный сотрудник лаборатории вирусов лейкозов, Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского

Россия, 123098, г. Москва

Яна Михайловна Мунчак

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: yana_munchak@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4792-8928

младший научный сотрудник лаборатории вирусов лейкозов, Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского

Россия, 123098, г. Москва

Екатерина Никитична Меженская

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: belokopytova.01@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3110-0843

канд. биол. наук, научный сотрудник лаборатории вирусов лейкозов, Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского

Россия, 123098, г. Москва

Елена Александровна Орлова-Морозова

ГБУЗ МО «Центр профилактики и борьбы со СПИД»

Email: orlovamorozova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2495-6501

канд. мед. наук, заведующая амбулаторно-поликлиническим отделением

Россия, 140053, г. Котельники, Московская область

Александр Юрьевич Пронин

ГБУЗ МО «Центр профилактики и борьбы со СПИД»

Email: alexanderp909@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9268-4929

канд. мед. наук, главный врач

Россия, 140053, г. Котельники, Московская область

Алексей Геннадьевич Прилипов

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: a_prilipov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8755-1419

д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник, заведующий лабораторией молекулярной генетики Института вирусологии им. Д.И. Ивановского

Россия, 123098, г. Москва

Оксана Валериановна Галзитская

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; ФБУН «Институт теоретической и экспериментальной биофизики» Российской академии наук

Email: ogalzit@vega.protres.ru
ORCID iD: 0000-0002-3962-1520

д-р физ.-мат. наук, заведующая лабораторией биоинформатики, главный научный сотрудник ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи», Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского

Россия, 123098, г. Москва; 142290, г. Пущино, Московская область

Список литературы

Дополнительные файлы