Простой высокочувствительный и специфичный серологический тест для выявления антител к вирусу Varicella-Zoster (Varicellovirus humanalpha3)

Полный текст

Введение

Вирус ветряной оспы (ВО) и опоясывающего герпеса (Varicella-Zoster virus, VZV) представляет собой высококонтагиозный альфа-герпесвирус, которым инфицировано более 90% людей в мире [1, 2].

Согласно отчету, опубликованному Всемирной организацией здравоохранения в 2014 г., ежегодно ВО заболевают не менее 140 млн человек, из которых 4,2 млн имеют тяжелые осложнения, приводящие к госпитализации и смерти [3]. Для ВО в основном характерны легкая и средняя степени тяжести заболевания, однако существует большой риск развития тяжелой формы ВО у беременных женщин, новорожденных, VZV-cеронегативных взрослых и лиц с ослабленным иммунитетом [4]. Около 1/3 переболевших ВО заболевают в возрасте преимущественно старше 50 лет опоясывающим герпесом, обычно сопровождающимся постгерпетической невралгией [5, 6].

В эпоху всеобщей вакцинации против ВО диагностика этого заболевания на основе клинических симптомов является сложной задачей, особенно для участившихся в последнее время случаев ВО-прорыва. Проблема точной диагностики ВО в таких случаях может быть решена с помощью надежных лабораторных тестов [7]. В последние десятилетия для вспомогательной диагностики VZV-инфекции были созданы разнообразные серологические методы выявления специфических антител, которые нашли свое применение в эпидемиологических исследованиях, при изучении эффективности вакцин, а также при оценке риска заболевания у медицинских работников [8]. Из них наиболее высокой чувствительностью обладают коммерчески недоступные во многих странах метод флуоресцирующих антител к мембранному антигену VZV (Fluorescent antibody to membrane antigen assay, FAMA) и иммуноферментный анализ (ИФА) на основе гликопротеинов (ГП) VZV (gpИФА) [9]. Мажорным и иммунодоминантным вирусным белком в вирионах VZV и в инфицированных клетках является ГП E (gpE), необходимый для репликации вируса и передачи его от клетки к клетке [10–12]. Учитывая клеточно-ассоциированную природу VZV, тест FAMA считают более надежным средством оценки защитного иммунитета по сравнению с реакцией нейтрализации (РН) [13].

Оценка антительного ответа к четырехкомпонентной вакцине – корь, эпидемический паротит, краснуха и ВО (MMRV) – играет жизненно важную роль в ведении пациентов. До недавнего времени большинство клинических лабораторий использовали для обнаружения антител IgG к антигенам MMRV тесты в формате ИФА. Однако Консультативный комитет по практике иммунизации (ACIP) и Центр по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) не рекомендуют их использовать для оценки уровня вакциноиндуцированного иммунитета против ВО из-за низкой чувствительности [14, 15]. Для клинических лабораторий, выполняющих большой объем исследований, недавно была внедрена более надежная, быстрая и чувствительная по сравнению с ИФА технология высокопроизводительной мультиплексной автоматизации для обнаружения антител против антигенов MMRV (BioPlex 2200, Bio-Rad), позволяющая одновременно обнаруживать IgG-антитела в сыворотке крови ко всем 4 вирусам в одной реакции [16].

Другим наиболее простым и высокочувствительным тестом для выявления антител в сыворотках человека и животных является реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). С помощью этого теста определяют антитела к вирусам кори, краснухи, ящура, аденовирусу, цитомегаловирусу (ЦМВ), к вирусу иммунодефицита человека и др. [17–19].

Цель работы – разработка РПГА на основе формализированных эритроцитов, сенсибилизированных ГП VZV.

Материалы и методы

Культуры клеток. Клеточные культуры: MRC-5 – штамм диплоидных клеток легких эмбриона человека (Американская коллекция клеточных культур, АТСС); КМ-27 – кожно-мышечная ткань эмбриона человека (коллекция ФГАНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН», Москва, Россия), Vero-CCL-81 – линия перевиваемых клеток почки зеленой мартышки (АТСС); Vero-E6 – клон линии клеток Vero (коллекция ФГАНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН»); А₅₄₉ – линия перевиваемых клеток карциномы человека (коллекция ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова, Москва, Россия); ПТП – тестикулы поросенка (коллекция ВНИИВиМ, Покров, Владимирская обл., Россия); два типа мезенхимальных стволовых клеток из коллекции культур клеток ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова. Культуры клеток выращивали в питательной среде DMEM/F-12 с 10 мМ HEPES, с добавлением 5% или 10% сыворотки крупного рогатого скота (ООО НПП «БИОХИМСЕРВИС», Владимир, Россия).

Вирусы. Вакцинные штаммы вируса ВО «vFiraVax», вируса опоясывающего герпеса «vZelVax» (коллекция ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова); японский штамм вируса ВО «vOka» (коллекция CCL, США); лабораторный штамм вируса ВО «Ellen» (коллекция CCL); дикие варианты вируса ВО, изолированные во время вспышки в закрытом коллективе (коллекция ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова). Вирусы выращивали в культурах клеток в среде DMEM c повышенным содержанием глюкозы, без сыворотки.

Иммунные сыворотки и моноклональные антитела (МКА). Сыворотки крови человека к вирусу опоясывающего герпеса, взятые в период реактивации постгерпетической невралгии: Zel.-1 и Nik.-2; сыворотки крови от переболевших ВО пациентов (n = 25); иммунная сыворотка морской свинки к антигенам штамма AD₁₆₉ ЦМВ. Из сывороток удаляли термолабильные и термостабильные ингибиторы препаратом RDE (receptor dectroing enzyme, Denka Seiken, Япония) по инструкции производителя. МКА к gE вируса ВО – Varicella Mab (Potency, ID, Lot: PR 101022c, США). МКА к ГП gpB и gpD вирусов герпеса простого 1-го и 2-го типов, соответственно.

Реакция нейтрализации. РН проводили на клеточной культуре Vero-CCL-81, выращенной на 24-луночных планшетах (Costar) в ростовой питательной среде DMEM c 10% СКК. Приготовлены двукратные разведения иммунных вирусоспецифических сывороток морских свинок к вакцинным штаммам ВО – «vFiraVaX» и опоясывающему герпесу – «vZelVax». В каждое разведение иммунных сывороток в объеме 0,1 мл вносили равный объем 1000 доз ГАДЕ 50/0,1 мл вируса, смесь интенсивно перемешивали и оставляли на контакт на 1,5 ч при 36,5 °С в СО₂-инкубаторе, перемешивая каждые 15 мин. В 24-луночные планшеты с монослоем клеток и с предварительно удаленной ростовой средой вносили в каждые две лунки по 0,2 мл смеси вируса с сывороткой и оставляли на контакт на 1,5 ч в инкубаторе. Затем в лунки вносили по 0,8 мл поддерживающей среды DMEM без сыворотки. На планшете две лунки оставляли для контроля дозы вируса и контроля клеток, культивирование продолжали в течение 7 сут. Результат РН учитывали при 100% защите клеток.

Получение формализированных эритроцитов. Для получения формализированных бараньих, куриных и козьих эритроцитов кровь собирали в раствор Альсевера. Эритроциты отмывали трижды охлажденным физиологическим раствором (ФР) путем осаждения центрифугированием в течение 20 мин при 1500 об/мин. К отмытым эритроцитам добавляли 2% раствор формалина в 10-кратном объеме ФР, содержащем 0,5% глюкозы, рН раствора доводили 1 М NaOH до 7,0–7,2. Формализированные эритроциты выдерживали при комнатной температуре 3–4 сут до полного оседания эритроцитов, надосадок удаляли, к осадку добавляли равный объем ФР и хранили при температуре 2–8 °С. Перед сенсибилизацией формализированные эритроциты проверяли на спонтанную агглютинацию.

Приготовление вирусоспецифических ГП. В культуральных флаконах площадью 175 см² выращивали клетки, чувствительные к VZV, заражали вируссодержащей жидкостью (ВСЖ) и культивировали в течение 7–8 сут до 70–90% разрушения инфицированных клеток. Флаконы выдерживали сутки и более при −70 °С, затем их содержимое размораживали, клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 1500 об/мин в течение 20 мин, в надосадочную жидкость вносили сахарозно-желатиновый стабилизатор и оставляли при −70 °С для хранения до сенсибилизации эритроцитов. Для извлечения вирусных ГП из ВСЖ к ней добавляли фитогемагглютинин (ФГА) в концентрации 25 мкг/мл и по 50% взвесей формализированных бараньих, куриных или козьих эритроцитов в соотношении 10 : 1 по объему и оставляли при температуре 4 °С на 20 ч с периодическим встряхиванием для связывания вирусных ГП с ФГА на поверхности эритроцитов. Взвеси центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин, к осадкам нагруженных вирусными ГП формализированных эритроцитов добавляли ФР. Элюирование вирусных ГП с поверхности формализированных эритроцитов проводили в течение 1 ч при температуре 37 °С. Эритроциты удаляли из взвеси центрифугированием при 1500 об/мин в течение 20 мин. В полученный раствор вирусного ГП в качестве стабилизатора добавляли бычий сывороточный альбумин (БСА) до концентрации 1%. Концентрацию белков определяли на приборе NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, США).

Получение антигенных диагностикумов на основе вирусных ГП. Формализированные эритроциты сенсибилизировали вирусоспецифическими ГП, полученными из разных типов клеток, инфицированных штаммами VZV. Для этого эритроциты ресуспендировали в 10-кратном объеме охлажденного ФР, осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 20 мин и готовили 50% взвесь эритроцитов в ФР. Далее в центрифужных пробирках соединяли 1 объем бидистиллированной воды с 0,1 объема 50% взвеси эритроцитов, с 0,1 объема раствора вирусных ГП и с 0,1 объема 0,33% хлористого хрома (СrCl₃). Пробирки помещали в водяную баню на 1 ч при температуре 42 °С, затем добавляли равный объем ФР, перемешивали и осаждали сенсибилизированные эритроциты центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Осадок сенсибилизированных эритроцитов ресуспендировали в ФР, содержащим 1% БСА, отмывали дважды ФР с 1% БСА и готовили 2,5% взвесь сенсибилизированных формализированных эритроцитов в этом же растворе для использования в РПГА.

Получение антительных диагностикумов на основе МКА к VZV. К 0,1 мл взвеси 50% формализированных эритроцитов, предварительно отмытых 3 раза ФР, добавляли 0,1 мл ФР, 0,1 мл МКА к gpE (США) с концентрацией 318 мкг/0,1мл. Смесь перемешивали и вносили 0,3 мл 0,33% раствора хлорида хрома и 10 мкл 0,05 M NaOH. Смесь инкубировали в водяной бане в течение 1 ч при 42 °С, затем трижды отмывали ФР и готовили 2% антительный диагностикум в ФР.

РПГА для обнаружения антител к VZV в сыворотках животных и человека. Реакцию проводили микрометодом в объеме 150 мкл на V-образных планшетах. В каждую лунку планшета вносили по 50 мкл ФР, содержащего 1% нормальной кроличьей сыворотки, прогретой на водяной бане при 65 °С в течение 30 мин, по 50 мкл испытуемой сыворотки в разведениях от 1 : 100 до 1 : 12 400, и по 50 мкл сенсибилизированного антигенного диагностикума. В 4 свободные лунки по отдельности вносили по 50 мкл формализированных эритроцитов и по 50 мкл антигенного диагностикума для контроля на отсутствие спонтанной агглютинации. Планшет оставляли при температуре 4 °С до полного оседания контрольных эритроцитов и антигенного диагностикума и затем учитывали реакцию. При наличии в исследуемом материале специфичных к вирусному антигену антител происходило фиксирование эритроцитов на дне и стенках лунки в виде зонтика гемагглютинации. При отрицательной реакции эритроциты оседали на дно лунки в виде пуговки.

РПГА для определения активности gpE VZV. В лунки V-образного планшета вносили по 25 или 50 мкл 1% нормальной кроличьей сыворотки, затем добавляли по 25 или 50 мкл 2% антительного диагностикума. Свободные лунки использовали отдельно для контроля на спонтанную агглютинацию диагностикума и контроля формализированных бараньих эритроцитов. Планшет выдерживали 1,0–1,5 ч при температуре 4 °С до оседания эритроцитов в контрольных лунках и учитывали реакцию.

Иммуноферментный анализ. ИФА проводили общепринятым методом. На первом этапе вносили раствор антигена по 50 мкл в лунку, выдерживали ночь при температуре 4 °С, затем лунки планшета блокировали казеиново-сахарозным раствором 90 мин и высушивали планшеты 2 ч в термостате при температуре 37 °С с открытой дверцей. Для проведения ИФА в лунку вносили по 50 мкл разведений образцов сывороток крови человека, мыши или морской свинки в фосфатно-солевом буфере с твином (ФСБ-Т) с двукратным шагом, начиная с разведения 1 : 100, инкубировали 90 мин при температуре 37 °С; планшет промывали 3 раза ФСБ-Т; вносили по 50 мкл конъюгатов анти-Human IgG в рабочем разведении 1 : 5000, анти-мышь IgG Bio-Rad в рабочем разведении 1 : 2000; анти-свинка IgG в рабочем разведении 1 : 5000 в ФСБ-Т + 1% БСА, инкубировали планшеты 60 мин при температуре 37 °С; планшет промывали 3 раза ФСБ-Т; вносили раствор тетраметилбензидина, инкубировали 15 мин в темном месте; реакцию остнавливали серной кислотой, результаты регистрировали на спектрофотометре при длине волн 450 нм (длина волны сравнения 630 нм).

Этическое утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus author guidelines for animal use (IAVES 23.07.2010). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова (Протокол № 8 от 13.08.2024).

Статистические методы. Для статистической обработки результатов использовали пакеты программ Excel 2013 (Microsoft, США). Сравнение количественных значений полученных выборок проводили с помощью непараметрического U-критерия Манна–Уитни.

Результаты

На первом этапе разработки серологического теста РПГА были выбраны культуры клеток, при заражении которых VZV определялся максимальный цитопатический эффект (ЦПЭ), а именно – клетки КМ-27, А₅₄₉ и ПТП, при инфицировании которых разными штаммами VZV на 7–8-е сутки наблюдалась 70–90% деструкция клеток.

Далее устанавливали адсорбирующую способность формализированных эритроцитов животных, являющихся носителем главных компонентов в РПГА. Были выбраны три вида эритроцитов: баранов, кур и коз.

Известно, что лектины специфически связывают ГП вирусов [20, 21]. Для выделения вирусоспецифических ГП из ВСЖ были использованы два лектина – конкавалин А (КонА) и ФГА. В РПГА использовали сыворотку крови морской свинки, иммунизированной вакцинным штаммом «vZelVax» VZV. Титр иммунной сыворотки морской свинки в РН на чувствительных к VZV клетках КМ-27 составил 1 : 6400 ГАДЕ50/0,2._.

На рис. 1 представлены результаты определения концентрации лектинов КонА и ФГА, необходимых для эффективного связывания вирусных ГП из ВСЖ для последующей сенсибилизации формализированных куриных эритроцитов. Оптимальная концентрация КонА и ФГА составила 25 мкг/мл (р ≤ 0,05). При более высоких концентрациях титры сывороток в РПГА снижались в 4 раза.

 

Рис. 1. Определение оптимальной концентрации КонА и ФГА для связывания вирусоспецифических ГП VZV из вируссодержащей жидкости.

Fig. 1. Determination of the optimal concentration of ConA and PHA for binding virus-specific glycoproteins of VZV from virus-containing liquid.

 

На рис. 2 представлены результаты титрования в РПГА иммунных сывороток человека и морской свинки с антигенными диагностикумами, сенсибилизированными вирусными гликопротеинами, полученными с помощью ФГА, КонА и смеси лектинов.

 

Рис. 2. Титр иммунных сывороток в gpРПГА с антигенными диагностикумами на формализированных бараньих эритроцитах, сенсибилизированных вирусными ГП, полученными с различными лектинами.

Fig. 2. Titer of immune sera in gpRPGA with antigenic diagnostics on formalized sheep erythrocytes, sensitized with viral glycoproteins obtained with various lectins.

 

Представленные результаты четко демонстрируют, что на формализированных бараньих эритроцитах, сенсибилизированных полученным с помощью ФГА вирусным ГП, в РПГА выявляются вирусоспецифические антитела в сыворотках человека и животных, при этом в сыворотках животных в несколько сниженных титрах.

В РПГА с применением формализированных бараньих эритроцитов, сенсибилизованных вирусными ГП, полученными с помощью КонА, вирусоспецифические антитела в человеческих сыворотках не обнаруживаются. Использование смеси двух лектинов в равных концентрациях для получения вирусных ГП из той же ВСЖ снижает уровень титров антител в РПГА.

Далее представлены результаты экспериментов с очищенными ГП, элюированными с формализованных бараньих эритроцитах. Титры очищенных вирусных ГП были определены в РПГА с помощью антительного диагностикума, приготовленного на бараньих эритроцитах, сенсибилизированных MКА к gpE VZV (США). Концентрации вирусных ГП, полученных при заражении клеточных культур A₅₄₉, КМ-27, Vero-E6 и ПТП вирусными штаммами «vZelVax», «vFiraVax», «vOka», «Ellen», диким вирусом VZV (Москва), находились в диапазоне от 0,206 до 0,381 мг/мл, медиана титра для полученных ГП в РПГА составила 1 : 8.

Для оптимизации условий gpРПГА определяли способность формализированных бараньих, куриных и козьих эритроцитов адсорбировать вирусные ГП. Сенсибилизированные ГП VZV эритроциты были использованы в gpРПГА для титрования сыворотки крови морских свинок, инфицированных штаммом «vZelVax» VZV. Результаты показали, что бараньи эритроциты обладают более высокой сорбирующей способностью (титр в gpРПГА 1 : 3200, скорость седиментации 1,0–1,5 ч) в отличие от куриных (титр в gpРПГА 1 : 800, скорость седиментации 20 мин) и особенно от козьих (скорость седиментации 1,0–1,5 ч) эритроцитов. Эти данные согласуются с результатами других исследователей, полученных для иных вирусных и бактериальных агентов [22, 23].

На рис. 3 представлены результаты титрования в gpРПГА сывороток крови лиц, переболевших опоясывающим герпесом и ВО, а также сыворотки крови иммунизированных штаммом «vZelVax» VZV морских свинок, с применением формализированных куриных и бараньих эритроцитов, сенсибилизированных ГП вируса опоясывающего герпеса, полученных с помощью лектина ФГА. Титры в gpРПГА были выше на бараньих эритроцитах в реакциях со всеми использованными в эксперименте образцами сывороток крови. Можно сделать заключение о пригодности теста выявления специфических антител как у людей, так и у животных.

 

Рис. 3. Сравнительное титрование иммунных сывороток человека и морской свинки в gpРПГА с применением сенсибилизированных ГП VZV формализированных куриных и бараньих эритроцитов,

1 ‒ сыворотка крови больного опоясывающим герпесом, полученная в период реактивации; 2 ‒ сыворотка крови детей, переболевших ветряной оспой; 3 ‒ сыворотка крови морской свинки, иммунизированной вакцинным штаммом «vZelVax» VZV.

Fig. 3. Comparative titration of human and guinea pig immune sera in gpRPGA using sensitized by GP VZV formalized chicken and lamb erythrocytes.

1 ‒ serum of patient with herpes zoster; 2 ‒ blood serum of children with chickenpox; 3 – blood serum of a guinea pig immunized with the «vZelVax» VZV vaccine strain.

 

Специфичность gpРПГА была установлена в реакциях с не содержащими антител к VZV сыворотками крови людей. Учитывая, что у 99,0% человеческой популяции содержатся антитела к VZV, к исследуемым сывороткам добавляли равный объем вирусного ГП, смесь выдерживали 30 мин при температуре 37 °С для связывания нейтрализующих антител. На рис. 4 представлены результаты тестирования в gpРПГА (рис. 4 а) и в gpИФА (рис. 4 б) 5 сывороток человека, обработанных и не обработанных ГП VZV.

 

Рис. 4. Исследование специфичности серологических тестов gpРПГА (а) и gpИФА (б).

* ‒ из сывороток предварительно удалены термолабильные и термостабильные ингибиторы серологических реакций; ** ‒ из сывороток предварительно не удалены ингибиторы серологических реакций.

Fig. 4. Study on the specificity of immune sera in serological tests gpRPGA (а) and gpELISA (b).

* – termolabile and thermostable ingibitors of serological reactions have been preliminary removed from serums; ** – serological reactions have not been preliminary removed from serums.

 

Представленные результаты четко демонстрируют высокую специфичность gpРПГА по сравнению с gpИФА: gpРПГА не выявила антител ни в одной из обработанных проб, в то время как методом gpИФА в двух иммунных сыворотках антитела обнаружены, при этом их титры были снижены в 4 и 8 раз. Таким образом, отмечаются частичные перекрестные реакции в gpИФА. В целом существует проблема перекрестной реактивности серологических тестов, особенно ИФА, которую частично или полностью можно преодолеть путем удаления из сывороток термолабильных и термостабильных ингибиторов серологических реакций. На рис. 5 представлены результаты исследования иммунных сывороток на перекрестную реактивность.

 

Рис. 5. Сравнительное титрование иммунных сывороток в РН (титр в ГАДЕ 50/0,5 мл), gpРПГА (титр в ГАE 50/0,5 мл) и gpИФА (титр в условных единицах).

Антитела в сыворотке: 1 ‒ «FiraVax», морской свинки pig (к альфа-герпесвирусу типа 3); 2 ‒ МКА-1Н-110, мышиные (к альфа-герпесвирусу типа 1); 3 ‒ МКА-2Н-208, мышиные (к альфа-герпесвирусу типа 2); 4 ‒ ЦМВ-159, морской свинки (к бета-герпесвирусу типа 5).

Fig. 5. Comparative titration of immune sera in RN (titer in GADE50/0,5 ml), gpRPGA (titer in GAE 50/0,5 ml) and gpELISA (titer in conventional units).

Antibodies in serum: 1 ‒ «FiraVax», guinea pig (to alpha herpes virus type 3); 2 ‒ MKA-1H-110, mouse (to alpha herpes virus type 1); 3 ‒ MKA-2H-208, mouse (to alpha herpes virus type 2); 4 ‒ CMV-169, guinea pig (to beta herpes virus type 5).

 

Представленные результаты показывают, что в РН со 1000 ГАДЕ 50/0,1 мл дозой VZV и в РПГА с антигенным диагностикумом на сенсибилизированных ГП VZV формализированных бараньих эритроцитах выявляются только антитела к вирусу герпеса 3-го типа, а именно к вакцинному штамму «vFiraVax» VZV, и не обнаруживаются к герпесвирусам 1, 2 и 5-го типов, в отличие от теста gpИФА, для которого продемонстрирована перекрестная иммунореактивность.

Далее было проведено сравнительное титрование 27 иммунных сывороток в gpРПГА, gpИФА и ИФА. Результаты представлены рис. 6.

Анализ результатов титрования иммунных сывороток в gpРПГА и gpИФА (рис. 6) показал, что 44,4% сывороток имели одинаковые титры, иногда отличаясь на один шаг. При этом для 55,6% образцов титры в gpРПГА были больше титров в gpИФА, и ни в одном случае титры в gpИФА не превышали титры в gpРПГА. Сравнивая титры в gpИФА и в обычном ИФА, можно отметить, что в 59,3% случаев титры в gpРПГА были ниже, чем в ИФА, для 29,6% образцов титры в gpИФА были равны титрам в ИФА, в 11,1% случаев титры в gpИФА были больше, чем в ИФА, на один шаг.

 

Рис. 6. Результаты сравнительного титрования иммунных сывороток к VZV в gpРПГА, gpИФА и ИФА.

Fig. 6. Results of comparative titration of immune sera to VZV in gpRPGA and gpELISA and ELISA.

 

Обсуждение

Целью настоящей работы было создание высокочувствительного и специфичного простого серологического теста с доказанным отсутствием перекрестной реактивности. Этим требованиям соответствует формат серологического теста gpРПГА. С помощью gpРПГА можно выявлять антитела только к ГП VZV, т.е. к нейтрализующим эпитопам вирусных антигенов, обеспечивающим основной защитный эффект от VZV-инфекций. До настоящего времени считается, что инфекционность VZV остается тесно связанной с клеткой и вновь сформированный вирус не высвобождается в культуральную среду [24], поэтому тест gpРПГА для выявления антител против ГП VZV более надежен, чем РН. Поскольку с помощью этого теста определяется уровень антител, направленных исключительно к ГП вирусов, он является надежным и чувствительным индикатором иммунного статуса.

В зарубежной научной литературе имеется публикация о разработке gpРПГА для выявления антител к герпесвирусам на основе вирусных ГП [20]. Авторы получали очищенные ГП герпесвирусов из ВСЖ с помощью лектинов чечевицы, сенсибилизированных на сефарозе 4 B (Pharmacia) и элюированных 0,2 M a-methyl mannoside. Следует отметить, что большинство коммерческих иммуноферментных тест-систем недостаточно чувствительны для определения поствакцинальных антител [25].

Нами был разработан простой оригинальный метод получения ГП вируса VZV. ГП VZV выделяли из ВСЖ, зараженных разными штаммами VZV культур клеток посредством избирательного связывания с лектинами бобовых культур КонА и ФГА и сорбции на формализированных бараньих эритроцитах. Наиболее эффективным лектином оказался ФГА, позволяющий получать ГП для выявления в gpРПГА вирусоспецифических нейтрализующих антител в сыворотках крови человека и животных. Для получения очищенного ГП использовали известный метод очистки и концентрирования вирусов, в частности вируса гриппа: вирусы адсорбируются на эритроцитах цыплят или барана при температуре 4 °С, а затем элюируют с этих эритроцитов при температуре 37 °С [26]. Установленные с помощью антительного эритроцитарного диагностикума концентрации очищенных указанным способом вирусных ГП составили от 0,206 до 0,381 мг/мл, а их титры – 1 : 8. Подтвержден факт, что из трех типов исследованных формализированных эритроцитов животных: бараньих, куриных и козьих, наибольшей адсорбирующей способностью обладают бараньи эритроциты.

Сравнительный анализ показал, что разработанный тест gpРПГА обладает высокой специфичностью и воспроизводимостью. Важным его преимуществом в сравнении с ИФА является отсутствие перекрестной реактивности. Другим явным достоинством данного серологического теста является простота выполнения, что позволяет его применять в любой лаборатории.

Заключение

Разработан высокочувствительный и специфичный, простой в исполнении, не обладающий перекрестной реактивностью серологический тест gpРПГА для выявления поствакцинальных и постинфекционных антител к VZV. Его разработка – этап создания мультиплексного диагностикума для выявления антител в сыворотках крови детей, иммунизированных четырехкомпонентной вакциной против кори, эпидемического паротита, краснухи и ВО.

Об авторах

Фирая Галиевна Нагиева

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Автор, ответственный за переписку.
Email: fgn42@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8204-4899

д-р мед. наук, доцент, заведующая лабораторией гибридных клеточных культур отдела вирусологии 

Россия, 105064, г. Москва

Елена Петровна Баркова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: fgn42@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3369-8869

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории гибридных клеточных культур отдела вирусологии 

Россия, 105064, г. Москва

Ольга Сергеевна Харченко

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: fgn42@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2169-9610

научный сотрудник лаборатории генетики ДНК-содержащих вирусов отдела вирусологии 

Россия, 105064, г. Москва

Александр Викторович Сидоров

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: fgn42@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3561-8295

канд. биол. наук, заведующий лабораторией генетики ДНК-содержащих вирусов отдела вирусологии 

Россия, 105064, г. Москва

Галина Ивановна Алаторцева

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: fgn42@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9887-4061

канд. биол. наук, заведующая лабораторией клонирования вирусных геномов отдела вирусологии 

Россия, 105064, г. Москва

Богдан Сергеевич Черепович

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: fgn42@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5803-6263

младший научный сотрудник лаборатории РНК-содержащих вирусов отдела вирусологии 

Россия, 105064, г. Москва

Юлия Николаевна Тараканова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: fgn42@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3226-5989

канд. биол. наук, заведующая лабораторией диагностики вирусных инфекций отдела вирусологии 

Россия, 105064, г. Москва

Ольга Анатольевна Трубачева

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: fgn42@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0005-0821-5553

ведущий специалист лаборатории гибридных клеточных культур отдела вирусологии 

Россия, 105064, г. Москва

Евгений Алексеевич Пашков

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет)

Email: fgn42@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5682-4581

младший научный сотрудник лаборатории прикладной вирусологии отдела вирусологии 

Россия, 105064, г. Москва; 119048, г. Москва

Артем Андреевич Ртищев

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»

Email: fgn42@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4212-5093

научный сотрудник лаборатории генетики РНК-содержащих вирусов отдела вирусологии 

Россия, 105064, г. Москва

Оксана Анатольевна Cвитич

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет)

Email: fgn42@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1757-8389

д-р мед. наук, член-корр. РАН, директор 

Россия, 105064, г. Москва; 119048, г. Москва

Виталий Васильевич Зверев

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»; ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет)

Email: fgn42@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5808-2246

д-р биол. наук, профессор, академик РАН, научный руководитель 

Россия, 105064, г. Москва; 119048, г. Москва

Список литературы

Дополнительные файлы