Отправить статью по E-mail Система иммуноферментного анализа для серологической диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом на основе инактивированного очищенного вируса Пуумала (Hantaviridae: Orthohantavirus)
- Авторы: Иванов А.П.1, Дзагурова Т.К.1, Курашова С.С.1, Теодорович Р.Д.1, Клеблеева Т.Д.1, Ткаченко Е.А.1
-
Учреждения:
- ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита)»
- Выпуск: Том 69, № 3 (2024)
- Страницы: 285-289
- Раздел: В ПОМОЩЬ ВИРУСОЛОГУ
- Дата подачи: 09.02.2024
- Дата публикации: 05.07.2024
- URL: https://virusjour.crie.ru/jour/article/view/16622
- DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-230
- EDN: https://elibrary.ru/mgtslj
- ID: 16622
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Введение. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) является наиболее распространенным зоонозным вирусным заболеванием человека на территории Российской Федерации. Более 98% заболеваемости ГЛПС вызвано ортохантавирусом Пуумала (ПУУ). Для лабораторной диагностики ГЛПС, в частности серодиагностики клинических случаев, требуются эффективные (высокочувствительные, специфичные, максимально объективные и быстрые в исполнении) серологические тесты, разработка которых является важнейшим элементом контроля данного вирусного заболевания.
Цель исследования. Конструирование системы иммуноферментного анализа (ИФА) для определения специфических антител с использованием стандартного антигена в виде высокоочищенного инактивированного вируса ПУУ в качестве иммуносорбента.
Материалы и методы. Получение препаратов высокоочищенного антигена вируса ПУУ, конструирование системы ИФА для определения специфических антител, отработка параметров системы ИФА, параллельное титрование сывороток крови больных ГЛПС методом флуоресцирующих антител (МФА) и новым вариантом ИФА.
Результаты и обсуждение. Впервые в лабораторной практике исследования ГЛПС была сконструирована система ИФА на основе очищенного инактивированного вируса ПУУ (целевой компонент экспериментальной вакцины против ГЛПС) в качестве стандартного антигена при прямой сорбции на твердую фазу (иммунопанель). Параллельное титрование 50 образцов сывороток крови больных ГЛПС методами МФА и разработанного варианта ИФА показало высокую чувствительность и специфичность данного варианта ИФА, отмечены 100% совпадение результатов тестов (на уровне положительный/отрицательный результат) и значительный уровень корреляции величин титров специфических антител двух тестов.
Заключение. Разработанный вариант ИФА для определения антител к вирусу ПУУ на основе очищенного инактивированного вируса ПУУ – целевого компонента вакцинного препарата против ГЛПС в качестве иммуносорбента – может быть эффективно использован для серодиагностики ГЛПС и массовых серо-эпидемиологических исследований.
Полный текст
Введение
Лабораторная диагностика геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) – одного из ведущих зоонозных вирусных заболеваний человека на территории Российской Федерации (возбудители – ортохантавирусы, семейство Hantaviridae) – достаточно исследованная тема, начиная с 80-х годов XX века. Основой серологической диагностики ГЛПС был метод флуоресцирующих антител (МФА) [1], затем – различные варианты иммуносорбентных методов: иммуноферментного (ИФА) и радиоиммунного анализа, разработанные в том числе авторами данной публикации [2, 3]. Создание культуральной инактивированной хантавирусной вакцины, например, на основе вируса Пуумала (ПУУ), предусматривает высокую степень очистки вируса, что дает возможность также использовать вакцинный препарат в качестве иммуносорбента для ИФА (в системах определения специфических антител), т.е. в виде прямой сорбции очищенного инактивированного вируса на твердую фазу (иммунопанель). Такая система ИФА представляет собой трехслойный «сэндвич»: иммуносорбент (стандартный антиген) – исследуемая сыворотка – антивидовой пероксидазный конъюгат, что обеспечивает более высокую специфичность теста, поскольку сенсибилизирующие антитела отсутствуют.
Цель исследования – разработка варианта ИФА на основе высокоочищенного инактивированного вируса ПУУ для определения антител к нему у больных ГЛПС (серологическая диагностика клинических случаев), а также для проведения массовых серо-эпидемиологических исследований на эндемичных территориях.
Материалы и методы
Сыворотки крови больных ГЛПС были получены из ФБУЗ ЦГиЭ Оренбургской области с целью серотипирования. Антитела к хантавирусам в сыворотках крови больных ГЛПС выявляли с помощью МФА, описанного ранее [1], с использованием моновалентных культуральных антигенов вирусов ПУУ и Добрава (ДОБ), а также Диагностикума ГЛПС культурального поливалентного для непрямого метода иммунофлюоресценции производства ФГАНУ «ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН» (Институт полиомиелита) по инструкции производителя. Сыворотки крови больных поступали из инфекционных больниц для проведения специфической диагностики. Информированное добровольное согласие пациенты подписывали при госпитализации. Таким образом, одобрения исследования Этическим комитетом не требовалось.
В качестве стандартного антигена в представленной ИФА-тест-системе использовали инактивированный очищенный вирус ПУУ, представляющий собой полуфабрикат экспериментального инактивированного цельновирионного вакцинного препарата, полученного на основе штамма ПУУ-ТКД-VERO по ранее описанной технологии [4]. Коротко: культуральную жидкость клеток Vero, инфицированных вирусом ПУУ, осветляли фильтрацией (фильтр-патрон PPG060B01BA с фильтром Poly Pro XL 6,0), концентрировали методом ультрафильтрации в тангенциальном потоке (кассета Pellicon 2 mini.), инактивировали β-пропиолактоном в разведении 1 : 6000, хроматографически очищали на сорбенте Capto Core 700 (GE Healthcare). Полученный очищенный инактивированный препарат вируса ПУУ содержал 5,6 × 104 копий вирусной РНК/мл, 21,3 мкг/мл общего белка.
Применяли систему ИФА для определения антител класса G (IgG) к вирусу ПУУ в сыворотках крови больных ГЛПС. Иммунопанели (Costar, кат. № 9018) сенсибилизировали очищенным антигеном вируса ПУУ (вакцинный препарат) в концентрации 2,5 мкг/мл (подобрана шахматным титрованием) в карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9,6 (Sigma, кат. № C3041-100CAP), по 0,1 мл/лунка и инкубировали 18 ч при температуре +4 °С. После 3-кратной отмывки 0,05% Tween-20 в фосфатно-солевом буфере (Т-ФСБ) и блокирования свободных сайтов 1% фетальной бычьей сывороткой (Gibco, Великобритания) по 0,2 мл/лунка в течение 1 ч при +37 °С и 3-кратной отмывки вносили (0,1 мл/лунка) разведения анализируемых сывороток, начиная с 1 : 100 в ИФА-буфере (Т-ФСБ-1% фетальная бычья сыворотка). Параллельно вносили положительную и отрицательную контрольные сыворотки крови больных. Сыворотки инкубировали 1 ч при +37 °С. После 5-кратной отмывки вносили (0,1 мл/лунка) пероксидазный конъюгат против IgG человека (Sigma, кат. № A-6029-1ML) в оптимальном разведении (в ИФА-буфере), подобранном шахматным титрованием. Инкубировали 1 ч при +37 °С. После 5-кратной отмывки вносили (0,1 мл/лунка) субстрат TMB (Sigma, кат. № T0440-100ML, США), инкубировали 30 мин в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали 2М раствором серной кислоты (0,05 мл/лунка). Оптическую плотность (ОП) измеряли при 450 нм (Thermo Scientific Multiscan FC ELISA reader, Thermo Labsystems, Финляндия). Результат считали положительным при значении P/N (ОП опыта/ОП контроля в максимальных разведениях сыворотки) 2,1 и более [2].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel.
Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита)» (Протокол 1906/8к от 19.06.2024).
Результаты и обсуждение
Результаты определения антител (IgG) к возбудителю ГЛПС с использованием варианта ИФА на основе высокоочищенного инактивированного вируса ПУУ и МФА с различными антигенами указывают на высокую чувствительность и специфичность предлагаемого метода ИФА, что обусловлено, во-первых, качеством очистки антигена и, во-вторых, дизайном предлагаемого варианта ИФА, предусматривающего нанесение антигена на твердую фазу без предварительной ее сенсибилизации антителами. Система определяет антитела исключительно к вирусу ПУУ, поскольку антиген представляет собой цельновирионную структуру, в реакции фактически принимают участие эпитопы вирусной оболочки, обладающие типоспецифичностью [4]. Коэффициент корреляции (r) величин титров по данным МФА и ИФА имел высокое значение: 0,7.
В таблице представлены результаты параллельного титрования сывороток крови больных ГЛПС в МФА и ИФА.
Таблица. Результаты параллельного титрования сывороток крови больных ГЛПС в МФА и ИФА
Table. Results of parallel titration of HFRS patient blood sera in FAT and ELISA
№ п/п Sample # | № рег. Registration # | День болезни Day from disease onset | Титр антител Antibody titer | Серотип Serotype (ПУУ, ДОБ) (PUU, DOB) | ||
МФА FAT | ИФА ELISA | |||||
ПУУ/ДОБ PUU/DOB | Поливалент* Polyvalent | ПУУ PUU | ||||
1 | 9089а | 12 | 1024/4096** | 4096 | 0 | ДОБ |
2 | 9086 | 15 | 2048/16 000 | 16 000 | 0 | ДОБ |
3 | 9092 | 9 | 64 000/256 | 64 000 | 409 600 | ПУУ |
4 | 9093 | 7 | 16 000/128 | 16 000 | 51 200 | ПУУ |
5 | 9094 | 10 | 16 000/64 | 16 000 | 51 200 | ПУУ |
6 | 9097 | 11 | 16 000/128 | 16 000 | 102 400 | ПУУ |
7 | 9098 | 10 | 16 000/64 | 16 000 | 51 200 | ПУУ |
8 | 9099 | 6 | 4096/32 | 4096 | 12 800 | ПУУ |
9 | 9100 | 6 | 16 000/64 | 16 000 | 102 400 | ПУУ |
10 | 9101 | 16 | Отр. Negative | Отр. Negative | Отр. Negative | |
11 | 9103 | 14 | 64/отр (negative) | 64 | 3200 | ПУУ |
12 | 9104 | 14 | 16 000/128 | 16 000 | 25 600 | ПУУ |
13 | 9107 | 18 | 32 000/256 | 32 000 | 51 200 | ПУУ |
14 | 9112 | 12 | 64 000/128 | 64 000 | 102 400 | ПУУ |
15 | 9114 | 13 | 16 000/64 | 16 000 | 51 200 | ПУУ |
16 | 9115 | 12 | 16 000/64 | 16 000 | 102400 | ПУУ |
17 | 9118 | 15 | 16 000/128 | 16 000 | 102 400 | ПУУ |
18 | 9119 | 10 | 8000/64 | 8000 | 51200 | ПУУ |
19 | 9120 | 4 | 16 000/64 | 16 000 | 102 400 | ПУУ |
20 | 9126 | 16 | 16 000/128 | 16 000 | 102 400 | ПУУ |
21 | 9127 | 9 | Отр. Negative | Отр. Negative | Отр. Negative | |
22 | 9129 | 12 | 16 000/128 | 16 000 | 102 400 | ПУУ |
23 | 9131 | 4 | 64 000/128 | 64 000 | 102 400 | ПУУ |
24 | 9132 | 19 | 16 000/128 | 16 000 | 102 400 | ПУУ |
25 | 9133 | 8 | 16 000/64 | 16 000 | 25 600 | ПУУ |
26 | 9134 | 13 | 16 000/64 | 16 000 | 102 400 | ПУУ |
27 | 9135 | 11 | Отр. Negative | Отр. Negative | Отр. Negative | |
28 | 9137 | 17 | 32 000/128 | 32 000 | 102 400 | ПУУ |
29 | 9138 | 13 | 16 000/64 | 16 000 | 25 600 | ПУУ |
30 | 9139 | 10 | 16 000/64 | 16 000 | 12 800 | ПУУ |
31 | 9141 | 12 | 32 000/128 | 32000 | 51 200 | ПУУ |
32 | 9142 | 23 | 8000/64 | 8000 | 25 600 | ПУУ |
33 | 9144 | 9 | 16 000/64 | 16 000 | 51 200 | ПУУ |
34 | 9145 | 9 | 16 000/128 | 16 000 | 25 600 | ПУУ |
35 | 9147 | 11 | 64 000/128 | 64 000 | 51 200 | ПУУ |
36 | 9148 | 9 | 4096/32 | 4096 | 12 800 | ПУУ |
37 | 9149 | 3 | 16 000/64 | 16 000 | 25 600 | ПУУ |
38 | 9150 | 7 | 16 000/128 | 16 000 | 51 200 | ПУУ |
39 | 9151 | 17 | Отр. Negative | Отр. Negative | Отр. Negative | |
40 | 9152 | 9 | 64 000/128 | 64 000 | 102 400 | ПУУ |
41 | 9153 | 6 | 16 000/64 | 16 000 | 102 400 | ПУУ |
42 | 9154 | 23 | 16 000/128 | 16 000 | 25 600 | ПУУ |
43 | 9156 | 17 | 64 000/256 | 64 000 | 409 600 | ПУУ |
44 | 9157 | 12 | 64 000/128 | 64 000 | 409 600 | ПУУ |
45 | 9158 | 14 | 1024/32 | 1024 | 3200 | ПУУ |
46 | 9160 | 7 | 32 000/128 | 32 000 | 51 200 | ПУУ |
47 | 9161 | 12 | 16 000/128 | 16 000 | 102 400 | ПУУ |
48 | 9162 | 8 | 64 000/64 | 64 000 | 204 800 | ПУУ |
49 | 9164 | 5 | 512/отр. (negative) | 512 | 6400 | ПУУ |
50 | 9165 | 8 | 16 000/128 | 16 000 | 102 400 | ПУУ |
Примечание. * ‒ Диагностикум ГЛПС; ** ‒ обратная величина титра.
Note. * ‒ HFRS Test system; ** ‒ reciprocal.
Отсутствие ложноположительных результатов подтверждено отрицательными результатами исследования 50 сывороток крови из не эндемичных по ГЛПС районов в параллельном скрининге посредством МФА и ИФА.
Заключение
Таким образом, показано 100% совпадение результатов МФА ИФА при более высокой чувствительности ИФА (в 8‒16 раз по титру антител). Разработанный вариант ИФА не является функциональным тестом (в отличие от реакции нейтрализации и МФА), однако благодаря достаточной простоте, скорости исполнения и возможности обследования значительного количества образцов сывороток крови он может использоваться для серодиагностики ГЛПС, при оценке эффективности разрабатываемых хантавирусных вакцин и для массовых серо-эпидемиологических исследований.
Финансирование. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Этическое утверждение. Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита)» (Протокол № 1906/8к от 19.06.2024).
Funding. This study was not supported by any external sources of funding.
Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.
Ethics approval. The study was conducted with the informed consent of the patients. The research protocol was approved by the Ethics Committee of the Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of the Russian Academy of Sciences (Institute of Poliomyelitis) (Protocol No 1906/8к dated June 19, 2024).
Об авторах
Александр Петрович Иванов
ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита)»
Автор, ответственный за переписку.
Email: ivanovalexander1@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4576-7136
д-р мед. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии вирусов
Россия, МоскваТамара Казбековна Дзагурова
ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита)»
Email: dzaguron@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6656-1682
д-р мед. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок
Россия, МоскваСветлана Сергеевна Курашова
ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита)»
Email: svetllanak@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9934-699X
канд. мед. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок
Россия, МоскваРостислав Дмитриевич Теодорович
ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита)»
Email: rostislavteo@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2117-597X
научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок
Россия, МоскваТатьяна Дмитриевна Клеблеева
ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита)»
Email: klebleeva_td@chumakovs.su
ORCID iD: 0000-0003-4288-6818
научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии вирусов
Россия, МоскваЕвгений Александрович Ткаченко
ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН (Институт полиомиелита)»
Email: evgeniytkach@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6829-1241
д-р мед. наук, профессор, руководитель научного направления
Россия, МоскваСписок литературы
- Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А., Петров В.А. Эффективность применения культуральных антигенов для серодиагностики ГЛПС с помощью метода иммунофлюоресценции. Вопросы вирусологии. 1988; 33(1): 71–5. EDN: https://elibrary.ru/jfmqvh
- Ivanov A.P., Tkachenko E.A., Petrov V.A., Pashkov A.J., Dzagurova T.K., Vladimirova T.P., et al. Enzyme immunoassay for the detection of virus specific Ig G and Ig M antibody in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome. Arch. Virol. 1988; 100: 1–7. DOI: https://doi.org/10.1007/BF01310902
- Резапкин Г.В., Ткаченко Е.А., Иванов А.П., Башкирцев В.Н., Дзагурова Т.К. Определение аренавирусных антигенов и антител методом твёрдофазного радиоиммунологического анализа. Вопросы вирусологии. 1981; 26(4): 459–63.
- Ткаченко Е.А., Ишмухаметов А.А., Дзагурова Т.К., Синюгина А.А., Коротина Н.А., Набатников П.А. и др. Разработка экспериментально-промышленной технологии производства вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Ремедиум. 2015; (6): 47–54. EDN: https://elibrary.ru/uabrmj
Дополнительные файлы
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).