Интрафолликулярное инфицирование вирусом простого герпеса ооцитов млекопитающих и человека

Полный текст

Установлено, что детекция вируса простого герпеса (ВПГ) выше у пациенток с бесплодием, чем у фертильных женщин [1]. Предложены различные патогенетические механизмы возникновения инфертильного состояния в результате ВПГ-инфицирования женской репродуктивной системы. Например, показана роль ВПГ в формировании цервикального фактора бесплодия [2, 3]. Продемонстрирована гибель эмбриона вследствие вирусной контаминации при контакте с инфицированными клетками эндометрия [4, 5]. Определено, что нарушение имплантации эмбриона может являться следствием усиления цитотоксического звена иммунитета под влиянием ВПГ [1]. При генитальном инфицировании ВПГ, выделение вируса наблюдают во всех органах репродуктивной системы, иннервируемых пудендальным нервом [6]. Особый интерес вызывает инфицирование яичника. ДНК ВПГ обнаруживают в яичнике [3, 6], однако возможность детекции ВПГ в фолликулярных клетках и тека-клетках, несущих функцию стероидогенеза, и влияние овариальных гормонов на течение ВПГ-инфекции изучены недостаточно хорошо. И практически ничего неизвестно о способности ВПГ поражать женские половые клетки. Цель настоящей работы состояла в оценке возможности инфицирования ооцитов ВПГ при его обнаружении в яичнике, а также в изучении влияния половых гормонов (эстроген и прогестерон) на развитие герпесвирусной инфекции. Для этого исследовали неоплодотворив-шиеся ооциты, полученные в программах лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), и проводили экспериментальное заражение ВПГ самок лабораторных мышей. Материалы и методы Экспериментальные животные. Для изучения чувствительности клеток яичника к ВПГ использовали половозрелых самок мышей линии DBA/2J (H-2d) массой 16-18 г, которых содержали в виварии ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России. Эксперименты с животными проводили в соответствии с правилами, утвержденными этическим комитетом «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России. Введение женских половых гормонов мышам. С целью исследования роли гормонов в развитии инфекционного процесса у экспериментальных животных мышей разде- Контактная информация: Абдулмеджидова Анисат Газиевна, канд. мед. наук; e-mail: anisat2011@gmail.com 42 лили на три группы. В 1-й группе (n=6) животным подкожно (п/к) вводили 100 мкл масляного раствора синестрола в дозе 1,5 мкг на мышь ежедневно в течение 3 дней до инфицирования ВПГ. Животные 2-й группы (n=6) в том же режиме получали 100 мкл масляного раствора прогестерона п/к в дозе 0,5 мг на мышь. В контрольную - 3-ю - группу (n=6) вошли самки DBA/2J, которым п/к вводили по 100 мкл стерильного фосфатно-буферного раствора (phosphate bufered saline - PBS), рН 7,4. В работе у экспериментальных животных не проводили предварительную овариэктомию, однако концентрация вводимых гормонов была несопоставимо выше максимального уровня эстрогенов и прогестерона у самок мышей (40^10-5 и до 100-10-4 мкг/мл соответственно) [7]. Инфицирование мышей ВПГ проводили, используя референс-штамм F1 ВПГ 1-го типа, любезно предоставленный проф. Л. Перейра (США). Концентрация ВПГ соответствовала инфекционной множественности 106 бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл. ВПГ вводили интравагинально в объеме 30 мкл. Исследованный материал от зараженных мышей. Через 10 дней после инфицирования у мышей брали кровь на исследование уровня антител к белкам ВПГ и ткань яичника. Из ткани яичника готовили криостатные срезы толщиной 3-4 мкм на криотоме «Micron HM 525” (Германия). Материал и методы. Для исследования были получены ооциты 20 пациенток, обратившихся в клинику ОАО “Медицина” по поводу лечения бесплодия методом ЭКО или ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в ооцит). Средний возраст женщин 34±4,1 года (от 29 до 40 лет). Критериями исключения из выборки стали уровень ФСГ более 10 МЕ/л в крови пациенток на 2-3-и сутки менструального цикла и тяжелая степень патозооспермии у партнера. Исследованию методом иммуноцитохимии подвергали ооциты, которые не оплодотворились в программах ЭКО/ИКСИ. Неоплодотво-рившиеся ооциты пациенток помещали на предметные стекла Menzel Polysine (Германия) и высушивали на воздухе. Антигены ВПГ в ооцитах выявляли с использованием пероксидазного метода окрашивания. Непрямой иммунопероксидазный метод иммунно-гистохимии. Криостатные срезы яичника и ооциты пациенток фиксировали смесью ацетонхлороформ в Рис. 1. Патологический препарат яичника мышей линии DBA/2J, инфицированных интравагинально ВПГ на фоне прогестерона (а), PBS (б) и синестрола (в), а также отрицательный контроль (г) - препарат яичника неинфицированной самки DBA/2J. Пероксидазный метод окрашивания с использованием МКА к белкам ВПГ. Ядра окрашены гематоксилином Карачи. Ув.: ок. 10, об. 60. 43 Рис. 2. Гистологический препарат яичника DBA/2J, инфицированный интравагинально ВПГ на фоне прогестерона. Видны два интенсивно окрашенных ооцита, окруженных однослойным цилиндрическим эпителием (примордиальные фолликулы), а также окрашенные стромальные клетки яичника. Пероксидазный метод окрашивания с использованием МКА к белкам ВПГ. Ядра окрашены гематоксилином Карачи. Ув.: ок. 10, об. 60. соотношении 1:1 в течение 10 мин. Блокировку внутриклеточной пероксидазы в клетках яичника проводили при комнатной температуре 0,6% Н2О2 на метаноле в течение 10 мин, в ооцитах - в течение 1 мин. После каждой инкубации препараты промывали PBS. Моноклональные антитела (МКА) к ВПГ [1] использовали в концентрации 50 мкг/мл на PBS с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Конъюгированные кроличьи антимышинные антитела фирмы “Сорбент” (Россия) разводили 1:100 в PBS с 1% БСА. С каждым реагентом образцы исследуемого материала инкубировали 1 ч при 37°С. Реакцию проявляли раствором субстрата (0,05 М трис-HCl, pH 7,4; 0,03% H2O2; 0,1% 3,3’-диаминобензидин (ДАБ). Криостатные срезы докрашивали гематоксилином Карачи. Иммуноферментный анализ (ИФА). Для изучения уровня антител к белкам ВПГ класса IgG (анти-ВПГ) в сыворотке крови инфицированных животных использовали сертифицированные коммерческие наборы для ИФА фирмы «Диагностические системы» (Россия). В качестве вторых антител использовали конъюгированные кроличьи антимышинные антитела фирмы «Сорбент» (Россия) в разведении 1:500. Результаты ИФА по выявлению антител считали положительными, если оптическая плотность (ОП) в образце превышала критическую ОП, рассчитываемую по формуле: ОП ит = среднее значение ОП отрицательных контро-лей + к2о (среднее квадратическое отклонение от среднего арифметического значения). Результаты Оценивали выраженность клиническ инфекции, данные серологического исследования и результаты иммуногистохимического изучения яичника на фоне высокого содержания синестрола (1-я группа), прогестерона (2-я группа) и при естественном уровне половых гормонов, на который не оказывает влияние введение PBS (3-я группа). Исходы ВПГ-инфицирования животных трех экспериментальных групп представлены в таблице. Из таблицы видно, что у животных 1-й группы не выявили признаков инфекции, тогда как у подавляющего большинства мышей 2-й группы отметили активную инфекцию, которая у половины из них привела к летальному исходу. Среди животных 3-й группы клинические проявления наблюдали у 50% экспериментальных животных с последующим летальным исходом у 1 самки. По данным ИФА антитела к белкам ВПГ не обнаружили у животных 1-й группы, но выявили у всех самок DBA/2J двух других групп. Среднее значение ОП IgG анти-ВПГ в сыворотках крови животных 2-й группы составило 0,39±0,15, 3-й группы - 0,32±0,02 (ОПкрит=0,016). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии иммунного ответа на ВПГ-инфекцию у животных 1-й группы в отличие от мышей 2-й и 3-й групп. Результаты клинических наблюдений и серологического исследования были подтверждены данными иммуногистохимии. Так, при изучении криостатных срезов яичника животных на 10-е сутки после инфицирования ВПГ обнаружили вирусные антигены в гонадах всех животных 2-й и 3-й групп (рис. 1, а, б) и ни в одном случае в яичнике самок мышей 1-й группы (рис. 1, в). Как видно из рис. 1, а-в, поражение ВПГ клеток яичника имеет диффузный характер. Антигены ВПГ выявляли в цитоплазме клеток мозгового и коркового слоев яичника (см. рис. 1, а). Белки ВПГ обнаруживали в том числе в клетках фолликулов (рис. 2). Доля инфицированных клеток в яичниках изученных животных варьировала от 21% (42 клетки из 200 изученных в препарате) до 53% (106/200) на препарат, составив в среднем 33,1% (66/200). Особый интерес представляют данные, свидетельствующие об инфицированности ооцитов примордиальных фолликулов (см. рис. 2). На рис. 2 визуализируются два примордиальных фолликула в корковой зоне яичника, содержащих крупные окрашенные ооциты (коричневая окраска). Представляют интерес результаты исследования оо-цитов у пациенток с бесплодием. У 20 пациенток было получено 156 ооцита (7,8±2,4 ооцита на пациентку), из которых в результате проведения ЭКО/ИКСИ сформировались 130 (83,3%) зигот. Оставшиеся 26 ооцитов (1,3±0,3 ооцита на пациентку) подвергали иммуноци-тохимическому окрашиванию с использованием МКА к белкам ВПГ. В целом в результате лечения бесплодия методом ЭКО беременность наступила у 6 (30%) пациенток из 20. Тотальное отсутствие оплодотворения после процедуры ИКСИ наблюдали у 1 из 20 пациенток. Результаты иммуногистохимического исследования показали, что все четыре неоплодотворившихся ооцита пациентки содержали антигены ВПГ (рис. 3), клетки других пациенток инфицированы не были. Обсуждение Результаты сравнительного анализа клинических и лабораторных данных развития ВПГ-инфекции у самок мышей DBA/2J Группа животных Критерий оценки инфек ционного процесса 1-я (сине 2-я (прогесте 3-я (PBS) проявлений строл) (п = 6) рон) (п = 6) (п=6) Наличие герпетических высыпаний 0/6 5/6 3/6 Летальный исход 0/6 3/6 1/6 Наличие IgG-антител к белкам ВПГ в сыворотке крови 0/6 6/6 6/6 Обнаружение антигенов ВПГ в яичнике 0/6 6/6 6/6 44 Рис. 3. Зрелые ооциты человека, инфицированные ВПГ. а-г - ооциты пациентки Н., 35 лет. а - клетка с нарушенной морфологией; д - положительный контроль, ооцит окрашен антителами человека к актину; е - отрицательный контроль, неокрашенный ооцит. Пероксидазный метод иммуноцитохимии. Ув. 100. Результаты проведенной работы свидетельствуют о высокой чувствительности клеток яичника мышей к ВПГ. В представленном исследовании установлено, что поражение яичника возможно при восходящей герпесвирусной инфекции и выраженность клиники заболевания зависит от уровня овариальных гормонов. При введении синестрола до интравагинальной инокуляции вируса наблюдали отсутствие клиники и иммуноги-стохимических признаков поражения яичника. У этой группы мышей не были выявлены также сывороточные IgG-антитела, что указывает на отсутствие гуморального иммунного ответа на ВПГ-инфекцию. Суммируя полученные данные, можно заключить, что эстрогены обладают протективными свойствами в отношении первичного инфицирования генитальным герпесом. Возможным объяснением полученного результата является изменение рецепторов на поверхности эпителиальных клеток влагалища самок под влиянием эстрогенов, препятствующее проникновению ВПГ. Представленные данные согласуются с результатами других исследователей [9, 10]. При сравнительном анализе результатов серологического и иммуногистохимического исследований у самок DBA/2J, предварительно обработанных прогестероном и PBS, существенных различий не выявили. В этих группах у всех самок обнаруживали сопоставимый уровень IgG-антител и установили инфицирование яичника. Эти данные указывают на то, что прогестерон не оказывает существенного влияния на проникновение ВПГ в клетки. В то же время выраженная клиника заболевания и увеличение количества случаев летального исхода свидетельствуют о том, что на фоне высокой концентрации прогестерона противовирусный иммунный ответ недостаточно эффективен. В данной работе впервые показано инфицирование ооцитов млекопитающих и человека. Возможный путь проникновения ВПГ в ооцит - через отростки ВПГ-содержащих фолликулярных клеток, пронизывающих плазматическую мембрану ооцита. Об этом свидетельствует детекция антигенов ВПГ в ооцитах примордиальных фолликулов мышей. Вызывает несомненный интерес тот факт, что ВПГ обнаружен в зрелых ооцитах у пациентки с бесплодием. Ооциты были получены с применением гормональной индукции суперовуляции, когда уровень эстрадиола в организме женщины многократно превышает его значение при естественном менструальном цикле. Однако все полученные клетки были инфицированы. Эти данные указывают на то, что эстрогены препятствуют интравагинальному заражению ВПГ de novo, но не защищают от реактивации латентно протекающей инфекции. Этот вывод подтверждается результатами работы R. Vicetti Miguel и соавт., посвященной исследованию эстрадиолзависимого механизма реактивации латентной герпесвирусной инфекции [11]. В работе установлено отсутствие оплодотворения инфицированных ооцитов. Следует отметить, что ооциты не оплодотворились после процедуры ИКСИ, что является крайне редким событием и сопряжено с такими формами патазооспермии, как глобозооспермия и отсутствие центросомы у сперматозоида [12, 13]. Однако в данном случае не были установлены нарушения в спер-мограмме супруга пациентки и проведение ИКСИ было обусловлено ограниченным количеством полученных ооцитов. В то же время показано, что ВПГ оказывает повреждающее воздействие на геном инфицированной клетки, снижает ее синтетическую активность и негативно влияет на функцию микрофиламентов [14-16]. Возможно, провал оплодотворения в экстракорпоральных условиях был обусловлен указанными эффектами ВПГ. Результаты последующих исследований позволят подтвердить либо опровергнуть это предположение. Суммируя полученные данные, можно заключить, что при восходящей ВПГ-инфекции происходит инфициро 45 вание яичника с интрафолликулярной передачей ВПГ ооцитам, следствием чего может стать нарушение их оплодотворения. Эстрогены препятствуют интраваги-нальному заражению ВПГ, тогда как прогестерон повышает чувствительность организма к ВПГ.

Список литературы

Дополнительные файлы