Таксономия ранее не классифицированного вируса ЧИМ (CHIMV - Chim virus) (Bunyaviridae, Nairovirus, группа Кальюб), изолированного в Узбекистане и Казахстане из иксодовых (Acari: Ixodidae) и аргасовых (Acari: Argasidae) клещей, собранных в норах больших песчанок Rhombomys opimus Lichtenstein, 1823 (Muridae, Gerbillinae)

Полный текст

Прототипный штамм LEIV-858Uz вируса Чим (CHIMV - Chim virus) был изолирован в процессе зондирования территории среднеазиатских республик и Казахстана в 1971 г. от клещей Ornithodoros tartakovskyi Olenev, 1931, собранных в июле 1971 г. в норах большой песчанки Rhombomys opimus Lichtenstein, 1823 в окрестностях поселка Чим Кашкадарьинской области Узбекистана (38°47' с.ш., 66°18' в.д.) [1-3]. При изучении антигенных связей Для корреспонденции: Львов Дмитрий Константинович, д-р мед. наук, проф., акад. РАН, dk_lvov@mail.ru 18 CHIMV с вирусами семейств Togaviridae, Flaviviridae, Reoviridae (Orbivirus), Bunyaviridae (Orthobunyaviridae, Phlebovirus, Nairovirus), Rhabdoviridae (Lyssavirus), Or-thomyxoviridae (Thogotovirus) и неклассифицированными вирусами, изолированными ранее в СССР, получены негативные результаты. На этом основании CHIMV был отнесен к новым неклассифицированным вирусам [2, 4, 5]. Позднее еще четыре штамма вируса были изолированы в 1972-1976 гг. из клещей O. tartakovskyi Olenev, 1931, O. papillipes Birula, 1895, Rhipicephalus turanicus Pomerantsev, 1936 (Rhipicephalinae), собранных в норах большой песчанки в Кашкадарьинской, Бухарской, Сыр-дарьинской областях Узбекистана [6, 7], а в апреле 1979 г. три штамма CHIMV выделены из клещей Hyalomma asiaticum Schulze et Schlottke, 1930 (Hyalomminae) и из печени больших песчанок, добытых в пустынном ландшафте на границе песков и пойм рек Или и Каратал в Прибалхашье (Джезказганская область, Казахстан) [8-11]. В настоящей работе методом полногеномного сек-венирования de novo определена полная последовательность генома CHIMV. На основании проведенного филогенетического анализа показано, что CHIMV является новым вирусом рода Nairovirus (Bunyaviridae). CHIMV филогенетически наиболее близок к вирусу Кальюб (QYBV - Qalyub) - прототипному представителю одноименной группы. Полученные данные в сочетании с экологическими особенностями позволяют отнести CHIMV к группе Кальюб в составе рода Nairovirus (Bunyaviridae). Материалы и методы Вирусные штаммы. Работы с инфекционным материалом, связанные с получением и накоплением вируса, проводили в боксовых помещениях, оборудованных и сертифицированных для работы с микроорганизмами II группы патогенности. Использованный в работе вирус LEIV-858Uz получен из Государственной коллекции вирусов (ГКВ) РФ при ФГБУ “НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского” Минздрава России в виде лиофилизиро-ванной мозговой суспензии. Для накопления вируса лио-филизированную суспензию восстановили в 1 мл культуральной среды ДМЕМ (с добавлением антибиотика) и использовали для интрацеребрального заражения новорожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-3 сут) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 1 мл реагента TRIzol (Life Technology, США) и гомогенизировали пластиковым пестиком. Далее выделяли РНК согласно прилагаемой инструкции производителя данного реагента. Конечный осадок суммарной РНК растворяли в 100 мкл DEPC-обработанной воды. Для дополнительной очистки, а также для удаления низкомолекулярных фракций рибосомальной (5 S) и транспортной РНК полученный препарат очищали набором “RNeasy mini kit” (QIAGEN, Германия) в режиме cleanup на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориметра Qubit (Invitrogen, США). Для удаления рибосомальной (18 и 28 S) РНК использовали набор “GenRead rRNA depletion Kit” (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для этого брали не более 3 мкг суммарной РНК. Эффективность деплеции достигала 50-80% и, таким образом, количество полученной РНК для дальнейшего анализа составляло около 300 нг. Подготовка ДНК-библиотек и секвенирование. Для получения кДНК около 100 нг деплецированной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Pro-mega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора “NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с помощью набора “MinElute PCR Purification Kit” (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор “TruSeq DNA Sample Prep Kits v2” (Illumina, США) в соответствии с инструкцией. Для селекции ДНК по размеру применяли реагент “AMpure XP” (Beckman Coulter, США) с расчетом получения ДНК-библиотек длинной более 270 н.о., что соответствует размеру вставки около 150 н.о. Данные требования к размеру ДНК-библиотек связаны с использованием для секвенирования набора, позволяющего секвенировать не более 150 н.о. в одну сторону. Полученные Рис. 1. Результаты филогенетического анализа, проведенного методом максимального правдоподобия (maximum likelihood) для частичной последовательности RdRp наировирусов. Справа названия групп. Здесь и на рис. 2: положение CHIMV указано черным кружком. 19 Значения генетического расстояния (p-distance) между наировирусами, полученные при попарном сравнении последовательностей каталитического центра RdRp Группа Вирус Генетическое расстояние, % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Кальюб Чим, штамм LEIV-858Uz (CHIMV -Chim virus) 1 0,28 0,28 0,32 0,30 0,36 0,33 0,36 0,39 0,38 0,37 0,35 0,35 0,35 0,35 0,31 Бандиа (BDAV -Bandia virus) 2 0,16 0,22 0,28 0,34 0,30 0,33 0,35 0,34 0,41 0,37 0,38 0,39 0,38 0,37 0,33 Кальюб (QYBV -Qalyub virus) 3 0,13 0,06 0,26 0,33 0,32 0,32 0,36 0,35 0,41 0,39 0,35 0,39 0,36 0,37 0,33 Герань (GERAV -Geran virus) 4 0,14 0,07 0,03 0,31 0,31 0,35 0,34 0,37 0,40 0,36 0,36 0,38 0,36 0,37 0,35 Иссык-Куль Иссык-Куль (ISKV - Issyk-Kul virus) 5 0,24 0,26 0,26 0,29 0,34 0,38 0,37 0,40 0,43 0,39 0,40 0,40 0,39 0,37 0,33 Дера-Гхази-Хан (DGKV - Dera Ghazi Khan virus) Абу-Хаммад (AHV - Abu Hammad virus) 6 0,26 0,23 0,23 0,28 0,29 0,25 0,32 0,34 0,38 0,35 0,36 0,36 0,37 0,37 0,37 Абу-Мина (ABMV - Abu Mina virus) 7 0,26 0,25 0,23 0,28 0,30 0,11 0,31 0,32 0,38 0,35 0,34 0,33 0,35 0,34 0,34 Хьюз (HUGV - Hughes virus) Раза (RAZAV -Raza virus) 8 0,33 0,28 0,31 0,38 0,33 0,26 0,24 0,28 0,39 0,31 0,37 0,33 0,35 0,35 0,35 Каспий (CASV -Caspiy virus) 9 0,35 0,31 0,32 0,39 0,36 0,28 0,26 0,17 0,40 0,34 0,38 0,37 0,38 0,39 0,34 Тамды Тамды (TAMV -Tamdy virus) 10 0,34 0,36 0,34 0,41 0,38 0,32 0,30 0,34 0,32 0,40 0,38 0,42 0,42 0,41 0,42 Арташат Арташат (ARTSV -Artashat virus) 11 0,31 0,31 0,30 0,35 0,31 0,28 0,28 0,29 0,28 0,34 0,38 0,36 0,35 0,36 0,34 Тиафора (TFAV -Thiafora virus) Эрве (ERVEV -Erve virus) 12 0,32 0,33 0,35 0,42 0,34 0,33 0,32 0,31 0,36 0,32 0,31 0,33 0,32 0,33 0,36 Болезни овец Найроби (NSDV - Nairobi sheep disease virus) Дугбе (DUGV -Dugbe virus) 13 0,29 0,32 0,34 0,41 0,34 0,30 0,29 0,31 0,34 0,35 0,26 0,26 0,29 0,29 0,35 ККГЛ ККГЛ (CCHFV - Crimean-Congo hemorrhagic fever virus) 14 0,28 0,31 0,31 0,38 0,33 0,30 0,31 0,28 0,34 0,35 0,29 0,25 0,13 0,29 0,36 Хазара (HAZV -Hazara virus) 15 0,26 0,28 0,29 0,34 0,28 0,29 0,28 0,28 0,34 0,34 0,26 0,24 0,15 0,11 0,33 Сахалин Сахалин (SAKV - 16 0,23 0,26 0,26 0,30 0,25 0,27 0,25 0,26 0,23 0,36 0,23 0,31 0,28 0,25 0,24 Sakhalin virus) Примечание. Верхняя правая часть таблицы - данные для нуклеотидных последовательностей; нижняя левая - данные для аминокислотных последовательностей. библиотеки визуализировали на станции автоматическо- картирование ридов проводили с помощью програм-го электрофореза “QIAxcel Advanced System” (QIAGEN, мы “CLC Genomics Workbench 6.0” (CLC bio, США). Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом полимеразно-цепной реакции в реаль- Предварительный поиск гомологичных последовательностей осуществляли, используя сервис BLASTX ном времени (2х SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для анализа нуклео-США), прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекоменда- тидных и аминокислотных последовательностей ис-циям, изложенным в руководстве “Sequencing Library пользовали пакет программ “Lasergene Core Suite” qPCR Quantification Guide” (Illumina, США). (DNAstar, США). Последовательности выравнивали Секвенирование ДНК-библиотек проводили на при- по алгоритму ClustalW. Филогенетический анализ и боре MiSeq (Illumina, США) с использованием набора построение дендрограмм проводили с использовани- “MiSeq Reagent Kits V2 (300PE)” в соответствии с ин- ем программы MEGA5 по методу ближайшего соседа струкцией производителя. (neighbor-joining) или максимального правдоподо- Биоинформационный анализ. Обработку данных бия (Maximum likelihood) с 100-кратным бутстрепполногеномного секвенирования, сборку контигов и тестированием. 20 Рис. 2. Результаты филогенетического анализа, проведенного методом ближайшего соседа для полных аминокислотных последовательностей буньявирусов животных. Справа названия родов. а - полипротеин - предшественник оболочечных белков GnGc; б - белок нуклеокапсида N. Результаты и обсуждение В результате проведенного полногеномного секвени-рования деплецированной РНК из мозга зараженных CHIMV мышей определили уникальные последовательности генома нового вируса, которые обладали гомологией с вирусами рода Nairovirus сем. Bunyaviridae. В ходе дальнейшего анализа полученных данных установили полную последовательность кодирующих областей генома CHIMV. Геном CHIMV состоит из трех сегментов РНК (L-, M- и S-сегмент), размер и структура которых соответствует вирусам рода Nairovirus. L-сегмент CHIMV имеет размер более 12,7 тыс. н.о. и кодирует вирусный фермент РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp). M-сегмент (около 5650 н.о.) кодирует полипротеин-предшественник двух оболочечных гликопротеидов. S-сегмент (около 180 н.о.) кодирует белок нуклеокапсида N (номер в базе данных GenBank KF801656). Вирусы рода Nairovirus объединены в семь групп: Кальюб, Дера-Гхази-Хан, Хьюз, Сахалин, Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), болезни овец Найроби и Тиафора [12]. Накопление геномных данных, связанных с секвенированием геномов наировирусов, позволило уточнить таксономическую структуру наи-ровирусов [13, 14]. В целом филогенетическая структура рода Nairo-virus соответствует их разделению на группы. Ранее с использованием технологии полногеномного секве-нирования мы классифицировали ряд новых наировирусов, которые по своим филогенетическим свойствам являются прототипными вирусами новых одноименных групп в составе рода Nairovirus. Это вирусы Иссык-Куль (ISKV - Issyk-Kul virus; ID GenBank KF801652), Арташат (ARTSV - Artashat virus; KF801650), Тамды (TAMV - Tam-dy virus; KF801653, KF801654, KF801655) [15, 16]. Также мы сек-венировали геном новых наиро-вирусов Каспий (CASV - Caspiy virus, KF801658) из группы Хьюз [17], Герань (GERAV - Geran virus) из группы Кальюб [18] и Бурана (BURV - Burana virus) из группы Тамды [19]. Нужно отметить, что наировирусы одной антигенной группы (или филогенетического клайда), даже изолированные в разных географических регионах, имеют общие экологические особенности, связанные с экологией их преимущественного членистоногого переносчика, что является отражением сопряженного (система вирус - переносчик - позвоночный хозяин) эволюционного процесса. Уровень гомологии аминокислотных последовательностей белков наировирусов превышает данное значение для нуклеотидных последовательностей. Большая часть нуклеотидных замен является синонимичными. В процессе эволюции наировирусов скорость накопления синонимичных мутаций, которые не подвержены действию отбора на уровне белка, значительно выше, чем для несинонимичных замен. В связи с этим филогенетический анализ наировирусов проводится на основе аминокислотных последовательностей [12, 18]. Филогенетический анализ CHIMV, проведенный на основе частичных последовательности каталитического центра RdRp наировирусов, представлен на рис. 1. Филогенетически CHIMV наиболее близок к вирусам группы Кальюб, с которыми на анализируемом участке обладает до 87% гомологии по аминокислотной последовательности (см. таблицу). Эти данные согласуются с тем, что вирусы группы Кальюб так же, как и CHIMV, экологически связаны с клещами рода Ornithodoros - O. (Pavlovskyella) erraticus - и норовыми грызунами. QYBV неоднократно изолировали от клещей O. erraticus, собранных в норах африканской травяной мыши (Arvican-tis niloticus niloticus) в долине и дельте Нила в Египте [19, 20]. Возможности более подробного сравнительного анализа CHIMV с другими вирусами группы Кальюб затруднены, поскольку для них отсутствуют геномные данные. Таким образом, CHIMV является первым вирусом группы Кальюб, для которого определена полная последовательность генома. 21 Результаты анализа полных последовательностей генома CHIMV показали, что CHIMV практически равноудален от известных наировирусов. По аминокислотной последовательности полипротеина-предшественника оболочечных белков GnGc (М-сегмент) CHIMV обладает только 30-40% гомологии с другими наировирусами. Так, уровень гомологии CHIMV с CCHFV составляет 26%, с ISKV - 41%. Гомология CHIMV с наировирусами по белку нуклеокапсида (N, S-сегмент) составляет в среднем 50%. Филогенетический анализ, проведенный на основе сравнения полноразмерных последовательностей вирусных белков GnGc и N, представлен на рис. 2. Клещи O. tartakovskyi, от которых в основном выделены штаммы CHIMV, распространены в Ирано-Туранской провинции Средиземноморской зоогеографической подобласти и Нагорно-Азиатской провинции ЦентральноАзиатской подобласти (Казахстан, республики Средней Азии, северо-восточный Иран, Китай (Синьцзян)). Западная граница проходит по восточному берегу Каспийского моря (53°-54° в.д.), восточная - в Синьцзяне (87°30' в.д.), северная - 44°-47° с.ш. Наиболее типичные биотопы - предгорные ксерофитные степи с лессовыми почвами. Вид заселяет также лугостепи, пустыни (пойменные террасы, арыки). Клещи O. tartakovskyi предпочитают норы малого диаметра (грызуны - песчанки, тушканчики, суслики, мелкие хищники, ежи, черепахи и птицы). Синантропные биотопы заселяет редко [21]. Большие песчанки (Muridae, Gerbillinae: Rhombomys) распространены от берегов Каспийского моря по равнинам Средней Азии и южного Казахстана и пустыням Центральной Азии, Ирана, Афганистана, на восток -до северного Китая и Внутренней Монголии. Большие песчанки являются типичными обитателями песчаных пустынь, образуют колонии с норами очень сложного и многоярусного строения и большим количеством (до 200-500) выходов. Норы - своеобразный биотоп, сохраняющийся многие десятки лет и обеспечивающий существование стойких природных очагов (в частности, чумы) в аридных районах [7, 10, 11]. Значение CHIMV в патологии человека неизвестно. Находки антител к вирусу в Кашкадарьинской области Узбекистана (9,5%) у верблюдов свидетельствуют о способности вируса инфицировать этих животных [6]. Принадлежность CHIMV к роду Nairovirus, включающему вирусы ККГЛ, Иссык-кульской лихорадки, определяет его потенциальную роль в возникновении заболеваний человека. Ком-плементсвязывающие антитела к африканским вирусам группы Кальюб - Бандиа (BADV - Bandia virus), Омо (OMOV - Omo virus), QYBV - обнаружены среди местного населения в Египте и Сенегале [22, 23]. Зондирование территории Узбекистана и Казахстана проводили в рамках программы по биобезопасности и изучению биоразнообразия в разных экосистемах Северной Евразии, а также для пополнения базы данных Государственной Коллекции вирусов Российской Федерации [24-29].

Список литературы

Дополнительные файлы