Молекулярно-генетическая характеристика вирусов Охотский (OKHV-Okhotskiy virus) и Анива (ANIV-Aniva virus) (Reoviridae, Orbivirus), изолированных в высоких широтах Северной Евразии из облигатных эктопаразитов чистиковых птиц (Alcidae Leach, 1820) - клещей Ixodes (Ceratixodes) uriae White, 1852

Полный текст

Вирус Охотский (OKHV - Okhotskiy virus) был впервые изолирован из клещей Ixodes (Ceratixodes) uriae White, 1852 (Acari: Parasitiformes, Ixodidae), собранных в сентябре 1971 г. в гнездовье тонкоклювой кайры (Uria aalge Pontopiddan, 1763) на острове тюлений в акватории Охотского моря, в Анивском заливе у южного побережья острова Сахалин [1-10]. Позднее ряд штаммов OKHV был выделен в аналогичных экологических условиях в высоких широтах в других частях бассейнов Охотского, Берингова и Баренцева морей (табл. 1) [1-11]. Прототипный штамм вируса Анива (ANIV - Aniva virus) LEIV-1373C (депонент в Государственной коллекции вирусов РФ № ГКВ 634; авторы: Львов Д.К., Громашев-ский В.Л., Скворцова Т.М., Аристова В.А.) выделен от клещей I. uriae, собранных в сентябре 1971 г. на острове Тюлений и позднее на острове Арий Камень (55°13' с. ш., 165°48' в. д.) в акватории Берингова моря у северозападной оконечности острова Беринга в составе Беринговых островов (см. табл. 1) [4-7]. По данным электронной микроскопии OKHV и ANIV отнесен к роду Orbivirus сем. Reoviridae, а на основание результатов серологических исследований - к серогруп-пе Кемерово [1, 3-9]. К этой же группе по состоянию на 1985 г. принадлежали еще семь вирусов, изолированных от клещей I. uriae (табл. 2) [12-18]. Однако к 2012 г. ситуация существенно изменилась (табл. 3) [19]. Изменение названия Кемерово (KEMV - Kemerovo virus) на Грейт-Айленд (GIV - Great Island virus) нельзя считать правомерным (см. табл. 3). В ревизии также нуждается видовой статус некоторых штаммов. Настоящая работа посвящена этой дискуссии. Материалы и методы Прототипные штаммы OKHV / LEIV-70C и ANIV / LEIV-1373C получены из Государственной коллекции вирусов РФ ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России в виде лиофилизирован-ной мозговой суспензии. Восстановленной суспензией (0,2 мл) проводили интрацеребральное заражение ново рожденных беспородных белых мышей. После развития симптомов поражения ЦНС (2-4-е сутки) мышей забивали в соответствии с правилами содержания и использования лабораторных животных. Выделение РНК. Фрагменты мозга (около 30 мг) помещали в 700 мкл лизирующего буфера RLT (QIA-GEN, Германия) и гомогенизировали в гомогенизаторе TyssueLyser LT (QIAGEN, Германия). Далее РНК выделяли набором «RNeasy mini kit» (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube (QIAGEN, Германия) из 350 мкл буфера в соответствии с инструкцией. Концентрацию РНК измеряли с использованием флюориме-тра Qubit (Invitrogen, США). Подготовка библиотек и секвенирование. Для депле-ции рибосомальной РНК использовали набор GenRead rRNA depletion Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией. Для получения кДНК 50 нг деплециро-ванной РНК фрагментировали в 15 мкл реакционной смеси для обратной транскриптазы с гексапраймером при 85°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед. К фрагментированной РНК добавляли 200 ед. фермента RevertAid Premium (Thermo Scintific, США) и 20 ед. ингибитора РНаз RNasin (Promega, США). Инкубировали при 25°С 10 мин, далее при 42°С 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70 °С 10 мин. Синтез второй цепи кДНК проводили с использованием набора «NEBNext® mRNA Second Strand Synthesis Module» (NEB, США) в соответствии с инструкцией. Полученную дцДНК очищали с помощью набора MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QIAcube. Для получения ДНК-библиотек из дцДНК использовали набор TruSeq DNA Sample Prep Kits v2 (Illumi-na, США) в соответствии с инструкцией. Полученные библиотеки визуализировали на станции автоматического электрофореза QIAxcel Advanced System (QIA-GEN, Германия). Молярность полученных библиотек измеряли методом полимеразно-цепной реакции в реальном времени 2х SsoFast EvaGreen Supermix (BioRad, США; прибор Bio-Rad CFX1000) согласно рекомен Таблица 1 Изоляция штаммов OKHV и ANIV из клещей Ixodes (Ceratixodes) uriae White, 1852 в гнездовьях чистиковых птиц (Alcidae Leach, 1820) в бассейнах Охотского, Берингова и Баренцева морей Вирус Характеристика Дальний Восток Европа бассейн Охотского моря бассейн Берингова моря бассейн Баренцева моря Сахалинская область Камчатский край Чукотский АО Мурманская область остров Тюлений (48°29' с. ш., 144°38' в. д.) остров Ионы (56°24' с. ш., 143°23' в. д.) остров Арий Камень (Командорские острова) (55°13' с. ш., 165°48' в. д.) побережье пролива Беринга (64°50' с. ш., 173°10' з. д.) остров Харлов близ Кольского полурстрова (68°49' с. ш., 37°19' в. д.) Охотский Количество штаммов 5 2 3* 1 23** (OKHV) Уровень вирусофорности, % 0,037 0,103 0,016 0,087 0,256 И то го . Обследовано клещей 11 23 Количество штаммов 35 725 8994 Уровень вирусофорности, % 0,031 0,256 Анива Количество штаммов 1 0 1 0 0 (ANIV) Уровень вирусофорности, % 0,007 0 0,005 0 0 Итого ... Обследовано клещей Количество штаммов Уровень вирусофорности, % 35 725 2 0,006 Примечание. * - один штамм выделен из клещей Ixodes signatus Birula, 1895; ** (Rissa tridactyla Linnaeus, 1758) [12]; АО - автономный округ. 0 8994 0 - два штамма выделены от обыкновенных моевок 23 Таблица 2 Орбивирусы (Reoviridae, Orbivirus), изолированные из облигатных паразитов колониальных птиц - клещей Ixodes (Ceratixodes) uriae White, 1852. Вирус Место сбора материала Автор Ссыл страна, регион географические координаты биотоп ка Анива (ANIV - Aniva virus) РФ, Сахалинская область Остров Сахалин, скалы в Анивском заливе Охотского моря (46°30' с. ш., 142°30' в. д.) Гнездовье кайр Д. Львов и со-авт., 1993 [4] Баулине (BAUV -Bauline virus) Канада, провинция Лабрадор Остров Ньюфаундленд, полуостров Авалон (52°46' с. ш., 47°11' з. д.) Гнездовье кайр и тупиков A. Main и со-авт., 1984 [12] Кейп-Врат (CWV -Cape Wrath virus) Великобритания, Шотландия Мыс Рот (58°36' с. ш., 4°53' з. д.) Гнездовье кайр A. Main и со-авт., 1984 [13] Грейт-Айленд (GIV -Great Island virus) Канада, провинция Лабрадор Остров Ньюфаундленд, полуостров Авалон (52°46' с. ш., 47°11' з. д.) Гнездовье кайр и тупиков A. Main и со-авт., 1984 [14] Микинес (MYKV -Mykines virus) Дания Фарерские острова (62°05' с. ш. 7°30' в. д.) Гнездовье тупиков A. Main и со-авт., 1984 [15] Наджет (NUGV -Nugget virus) Австралия Острова Маккуори в южной части Тихого океана между Новой Зеландией и Антарктидой (54°30' ю. ш., 159°00' в. д.) Гнездовье пингвинов R. Doherty и соавт., 1984 [16] Охотский (OKHV -Okhotskiy virus) РФ, Сахалинская область Остров Тюлений в Охотском море (48°29' с. ш., 144°38' в. д.) Гнездовье кайр D. Lvov и со-авт., 1984 [1, 4] Тиндхолмур (TDMV -Tindholmur virus) Дания Фарерские острова (62°05' с. ш. 7°30' в. д.) Гнездовье тупиков A. Main и со-авт., 1984 [17] Якина-Хед (YHV -Yaquina Head virus) США, штат Орегон Остров Якина-Хед у Тихоокеанского побережья (44°40' с. ш., 124°05' з. д.) Гнездовье кайр C. Yunker и соавт., 1984 [18] дациям, изложенным в руководстве «Sequencing Library qPCR Quantification Guide» (Illumina, США). Сиквение ДНК-библиотек проводили на приборе MiSeq (Illumina, США), используя набор MiSeq Reagent Kits V2 (300PE) в соответствии с инструкцией производителя. Биоинформационный анализ. Обработку данных полногеномного секвенирования, сборку контигов и картирование ридов осуществляли с помощью программы «CLC Genomics Workbench 5.5» (CLC bio, США). Предварительный поиск гомологичных последовательностей проводили, используя сервис BLASTX (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov). Для подбора праймеров, множественного выравнивания, анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали пакет программ «Lasergene Core Suite» (DNAstar, США). Последовательности выравнивали по алгоритму ClustalW [20]. Генетическую дистанцию определяли по модели p-distance с частичным удалением гэпов. Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили с помощью программы MEGA5 по методу ближайшего соседа (модель p-distance) с 1000-кратным бутстреп-тестированием [21]. Результаты и обсуждение В результате секвенирования вируссодержащего материала определили последовательности, соответствующие около 70% генома OKHV и около 50% генома ANIV. Таким образом, для OKHV установили частичные или почти полные последовательности всех 10 сегментов, а для ANIV-частичные последовательности только девять сегментов (кроме VP4). Данные об уровне гомологии, рассчитанном как обратная величина генетической дистанции (p-distance), аминокислотных последовательностей OKHV и ANIV с другими орбивирусами представлены в табл. 4. Наибольший уровень гомологии по всем белкам OKHV и ANIV имеют с GIV. Это значение для структурных белков кора T2 и VP7 (T13) составляет 92 и 96% соответственно для обоих вирусов. Белок внешнего слоя нуклеокапсида VP7 (T13) является основным носителем группоспецифичных антигенных детерминант, и такой высокий уровень гомологии OKHV и ANIV с GIV позволяет однозначно отнести данные вирусы к серогруп-пе GIV. Основные нейтрализующие и видоспецифические детерминанты орбивирусов сосредоточены на двух структурных протеинах VP2 и VP5. Уровень гомологии VP2 OKHV и ANIV с GIV составляет 67 и 69% соответственно. Уровень гомологии белка VP5 несколько выше - 72 и 79% соответственно (см. табл. 4). Гомология структурных белков OKHV и ANIV с GIV значительно выше, чем неструктурных. Так, белок VP1 (полимераза), который считается одним из самых консервативных белков орбивирусов, у OKHV и ANIV обладает гомологией с GIV на уровне 88%. Гомология остальных неструктурных белков OKHV и ANIV с GIV составляет 60-80% (см. табл. 4). Таким образом, учитывая высокий уровень генетической дистанции неструктурных и внешних структурных белков, считаем, что OKHV и ANIV являются отдельными самостоятельными вирусами в составе группы GIV. OKHV и ANIV обладают антигенным перекрестом, однако они легко дифференцируются серологическими методами. Большинство белков OKHV и ANIV имеют между собой высокий уровень гомологии (VP1 96%; Т2 99%; VP7 (T13) 98%; NS1 94%; NS2 98%; NS3 72%; VP6 93%). Однако белки внешней оболочки, несущие основные видоспецифические антигенные детерминанты, VP2 и VP5 у OKHV и ANIV обладают только 62 и 68% гомологии соответственно. Этим можно объяснить их антигенную дифференциацию. Филогенетический анализ провели для консервативных белков орбивирусов VP1 (pol) и VP7 (T13) методом присоединения соседей (см. рисунок, а, б). На дендрограмме видно, что OKHV и ANIV входят в филогенетическую ветвь GIV. Топология расположения OKHV и ANIV на дендрограмме, построенной для последовательностей вариабельного белка VP2, также указывает на их принадлежность группе GIV (см. рисунок, в). В дальневосточной части ареала зараженность I. uriae ANIV составляет 0,06%, в европейской части ANIV не выделялся (см. табл. 1) [1]. Наибольшая зараженность этих клещей OKHV (0,256%) обнаружена на севере 24 а Филогенетическое древо для аминокислотных последовательностей VP1 (RdRp) (а), VP7 (T13) (б), VP2 (в). Кольского полуострова (европейская часть), в то время как в различных частях ареала на Тихоокеанском побережье Дальнего Востока выявлена зараженность в пределах 0,016-0,103%, т. е. в 8 раз меньше, чем в европейском ареале (см. табл. 1) [10]. На прибрежных и островных территориях Субаркти-ки, Арктики и севере умеренного пояса расположены огромные гнездовые скопления морских колониальных птиц. Облигатными паразитами этих птиц являются два вида иксодовых клещей: Ixodes (Ceratixodes) uriae White, 1852 и Ixodes signatus Birula, 1895. I. uriae паразитирует на 17 видах птиц Северного и 16 видах птиц Южного полушарий [22-29]. В Северном полушарии I. uriae обнаружен на 6 видах чистиковых (Alcidae Leach, 1820): толстоклювых (Uria lomvia Linnaeus, 1758) и тонкоклювых (U. aalge Pontopiddan, 1763) кайрах, гагарке (Al-ca torda Linnaeus, 1758), топорке (Fratercula cirrhata Pallas, 1769), тупике (Fratercula arctica Linnaeus, 1758) и обыкновенном чистике (Cepphus grylle Linnaeus, 1758); на четырех видах чайковых (Laridae Vigors, 1825): обыкновенной моевке (Rissa tridactyla Linnaeus, 1758), серебристой чайке (Larus argentatus Pontoppidan, 1763), морской чайке (Larus marinus Linnaeus, 1758) и бургомистре (Larus hyperboreus Gunnerus, 1767); на одном виде крачковых (Sternidae Bonaparte, 1838): полярной крачке (Sterna paradisaea Pontoppidan, 1763); на пяти видах пеликановых (Pelecanidae Rafinesque, 1815): бе-рингийском (Phalacrocorax pelagicus Pallas, 1811), хохлатом (Ph. aristotelis Linnaeus, 1761), большом (Ph. carbo Linnaeus, 1758), краснолицем (Ph. urile Gmelin, 1789) бакланах и северной олуше (Morus bassanus Linnaeus, 1758); на одном виде трубконосых (Procellariidae Leach, 1820): глупышах (Fulmarus glacialis Linnaeus, 1761). Все перечисленные виды, кроме олушей, гнездятся в России. В 25 Таблица 3 Состав серогруппы Грейт-Айленд (GIV) (ранее - серогруппа Кемерово) (KEMV) [20] Английское название Аббревиатура Русское название Above Maiden virus ABMAV Эбав-Майден Arbroath virus ARTHV Арброт Bauline virus BAUV Баулине Broadhaven virus BHVNV Бродхавн Cape Wrath virus CWV Кейп-Врат Colony virus CLNV Колони Colony B North virus CLNBV Колони-Бэ-Норт Ellidaey virus ELLDV Эллидей Foula virus FOULV Фула Great Island virus GIV Грейт-Айленд Great Saltee Island virus GSIV Грейт-Солти-Айленд Grimsey virus GRIMV Гримси Inner Farne virus INFAV Иннэр-Фарнэ Kemerovo virus KEMV Кемерово Kenai virus KENAV Кенай Kharagysh virus KHARV Харагыш Lipovnik virus LIPV Липовник Lundy virus LUNV Лунди Maiden virus MAIDV Майден Mill Door virus MILDV Мил-До Mykines virus MYKV Микинес North Clett virus NOCLV Норс-Клетт North End virus NENDV Норт-Энд Nugget virus NUGV Наджет Okhotskiy virus OKHV Охотский Poovoot virus POOVV Пувут Rost Island virus ROISV Рост-Айленд St Abb’s Head virus SABHV Сент-Абб-Хед Shiant Islands virus SHISV Шант-Айлендс Thormodseyjarlettur virus THORV Тормодсейярлеттур Tillamook virus TILV Тилламук Tindholmur virus TINDV Тиндхолмур Tribec virus TRBV Трибеч Vearoy virus VEAV Верой Wexford virus WEXV Вексфорд Yaquina Head virus YHV Якина-Хед Южном полушарии I. uriae обнаружен на четырех видах пингвинов (Spheniscidae Bonaparte, 1831): королевском (Aptenodytes patagonicus Miller, 1778), магеллановом (Spheniscus magellanicus Forster, 1781), златохохлом (Eudyptes chrysolophus Brandt, 1837) и малом (Eu. minor Forster, 1781); на пяти видах трубконосых: антарктиче ской китовой птичке (Pachyptila desolata Gmelin, 1789), буллеровом (Thalassarche bulleri Rothschild, 1893), чернобровом (Th. melanophris Temminck, 1828), светлоспинном дымчатом (Phoebetria palpebrata Forster, 1785) и странствующем (Diomedea exulans Linnaeus, 1758) альбатросах; на пяти видах пеликановых: белогрудом (Phalacrocorax fuscescens Vieillot, 1817), керге-ленском (Ph. verrucosus Cabanis, 1875) и голубоглазом (Ph. atriceps Turbott, 1990) бакланах, георгиевском (Pelecanoides georgicus Murphy et Harper 1916) и кергеленском (Pelecanoides urinatrix exsul Salvin, 1896) нырковых буревестниках. Однако основным прокормителем I. uriae в Северном полушарии являются чистиковые птицы, а в Южном полушарии - пингвины [22-29]. На территории России I. uriae распространен в гнездовых колониях морских птиц на тихоокеанском шельфе: Курильских островах в Охотском море, Командорских островах в Беринговом море, юго-восточном побережье Чукотки, южном побережье острова Новая Земля [29]. Клещи концентрируются в подстилке на глубине до 20 см. На 1 м2 поверхности птичьей колонии насчитывается до 7 тыс. клещей всех стадий метаморфоза. Клещи I. uriae так же, как и I. signatus, нападают на человека [8]. Ареал I. signatus существенно меньше и включает острова архипелага Римского-Корсакова в западной части зал. Петра Великого (Охотское море); Командорские острова в Беринговом море; остров Хоккайдо и северное побережье острова Хонсю в Японском архипелаге; Алеутские острова и северное побережье Калифорнии в США. Клещи I. signatus паразитируют в основном на берингийском баклане (Ph. pelagicus) [29]. При серологическом обследовании около 1,5 тыс. птиц выявлено наличие антител (АТ) к OKHV у 15% глупышей (F. glacialis) на острове Ионы, у 4-6% тонкоклювых кайр (U. aalge) на острове Тюлений и Командорских островах, у 0,7% берингийских бакланов (Ph. pelagicus) на Командорских островах [4]. Вируснейтрализующие АТ к вирусам BAUV и GiV найдены в местах изоляции вирусов в Канаде в популяциях топорков (Fratercula cirrhata Pallas, 1769) (37%) и пестролицых буревестников (Calonectris leucomelas Temminck, 1836) (4-6%) [30]. В сыворотках крови людей, длительное время проживавших на Командорских островах, АТ к OKHV обнаружены в 12% образцов. Однако случаев заболеваний людей, этиологически связанных с OKHV, не выявлено [18]. Положительные результаты подтверждены в РН [4, 8, 11]. Общие экологические особенности и ареал распространения OKHV и ANIV, возможно, связаны с высоким уровнем гомологии между белками репликативного комплекса и внутреннего нуклеокапсида (93-99%), тог Таблица 4 Уровень (в %) идентичности белков OKHV и ANIV с орбивирусами Белок Вирус VP1 (Pol) T2 VP2 NS1 VP4 VP5 NS2 VP7 (Т13) VP6 NS3 OKHV ANIV OKHV ANIV OKHV ANIV OKHV ANIV OKHV ANIV OKHV ANIV OKHV ANIV OKHV ANIV OKHV ANIV OKHV ANIV GIV 89 88 93 92 67 69 81 80 80 н.д. 72 79 60 88 96 96 65 66 78 74 KEMV 73 76 83 79 38 40 63 64 61 н.д. 64 63 81 65 80 79 48 49 57 51 Tribec 73 74 83 79 37 39 61 61 62 н.д. 63 64 57 62 76 76 48 49 57 46 Yunnan 48 49 44 43 10 9 28 29 39 н.д. 34 33 27 30 29 30 28 28 20 12 EHDV 45 44 38 35 11 15 20 22 39 н.д. 30 20 19 19 25 25 22 21 23 17 AHSV 46 48 36 34 10 12 21 21 38 н.д. 29 24 22 21 23 23 22 23 24 15 Bluetongue 45 47 36 34 12 19 20 22 41 н.д. 31 33 17 18 21 22 20 20 18 11 26 да как внешние структурные белки OKHV и ANIV VP2 и VP7, связанные с вирулентностью вируса, продукцией нейтрализующих АТ и рецепторным узнаванием, обладают гомологией менее 70%. Вероятно, этот факт можно объяснить процессом постоянной реассортации между OKHV и ANIV, который привел к конвергенции этих двух вирусов. Зондирование территории в высоких широтах РФ проводили в рамках Программы по биобезопасности и изучения биоразнообразия в различных экосистемах Северной Евразии, а также для пополнения базы данных Государственной коллекции вирусов РФ [4, 6, 31-33].

Список литературы

Дополнительные файлы